CN108588210B - 包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用 - Google Patents

包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物，生物标志物为生物小分子或者差异基因，生物小分子包括：乙烯乙酰甘氨酸、2‑甲基‑3戊酮酸、3‑吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6)。本发明还公开了用于早期发现与预警药物性肝损伤的方法，定量检测样品中生物小分子或差异基因的浓度。本发明还公开了生物标志物在科学研究、制备药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用。本发明的生物标志物的变化发生在药物性肝损伤之前，具有预警的作用；有利于降低药物性肝损伤的发病率和病死率，有助于改善我国药物性肝损伤防控现状，有效缓解患者机体及经济的双重负担。

Description

包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用
技术领域
本发明涉及一种肝损伤诊断技术领域，涉及包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用。
背景技术
国内的流行病学调查显示，中草药制剂是引起药物性肝损伤排名前三位的常见药物之一。雷公藤多苷是目前在临床上用于治疗类风湿性关节炎、银屑病等免疫性疾病的重要中药制剂，其临床疗效显著，但也是发生毒性作用较多的中药制剂之一，以急性肝损伤最为严重。目前临床诊断指标与缺陷：目前临床尚无统一、公认的药物性肝损伤的诊断标准，仅根据丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)等传统指标进行判断，特异性较差，很难完全反映肝损伤的严重程度，并且无法鉴别肝损伤类型与诱导因素。另外，病理组织学检查具有侵袭性，也无法在肝损伤发生之前进行及时准确的预警。传统指标的滞后性使其不适合作为早期预警与疗效评价的标准，不能做到有效的预防与预后判断。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物。
本发明再有一个目的是提供用于早期发现与预警药物性肝损伤的方法。
本发明另有一个目的是提供生物标志物在科学研究、制备药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物，所述生物标志物为生物小分子或者差异基因，所述生物小分子包括：乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6)。
优选的是，所述的用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物中，所述差异基因包括：乙醇脱氢酶ADHs基因和多巴脱羧酶DDC基因NM_001270852.1/NM_001270853.1/NM_012545.4，所述乙醇脱氢酶ADHs基因包括Adh4NM_017270.2，Adh6NM_001012084.1和Adh7NM_134329.1。
优选的是，所述的用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物中，所述药物性肝损伤为雷公藤多苷导致的肝损伤。
用于早期发现与预警药物性肝损伤的方法，检测样品中生物标志物的浓度，所述生物标志物为生物小分子或差异基因，所述生物小分子包括乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、LPC(20:2) 和LPC(22:6)，当检测生物小分子的浓度时，利用液相色谱串联质谱法进行定量检测，若乙烯乙酰甘氨酸比正常浓度升高4倍以上、2-甲基-3戊酮酸比正常浓度升高1.5倍以上、3-吲哚丁酸比正常浓度下降 0.65倍以下、LPC(20:2)比正常浓度下降0.7倍以下、LPC(22:6)比正常浓度下降0.7倍以下，则判定该样品发生药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法中，当样品中的乙烯乙酰甘氨酸比正常浓度升高4.07倍以上、2-甲基-3戊酮酸比正常浓度升高1.55倍以上、3-吲哚丁酸比正常浓度下降0.67倍以下、LPC(20:2)比正常浓度下降0.71倍以下、LPC(22:6)比正常浓度下降0.73倍以下，则判定该样品发生药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法中，所述差异基因包括乙醇脱氢酶ADHs基因和多巴脱羧酶DDC基因 NM_001270852.1/NM_001270853.1/NM_012545.4，所述乙醇脱氢酶ADHs基因包括Adh4 NM_017270.2，Adh6NM_001012084.1和Adh7NM_134329.1，当检测样品中差异基因的表达量时，若Adh4基因的表达量为正常值的4.2倍以上，DDC基因的表达量为正常值的1.2倍以上，Adh6基因的表达量为正常值的47倍以上，Adh7基因的表达量为正常值的0.8倍以上，则判定该样品发生药物性肝损伤。
优选的是，所述的方法中，所述药物性肝损伤为雷公藤多苷导致的肝损伤。
优选的是，所述的方法中，当检测生物小分子的浓度时，所述样品采用动物血清。
优选的是，所述的方法中，当检测样品差异基因的表达量时，所述样品为动物肝脏组织。
所述的生物标志物在科学研究、制备药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用。
优选的是，所述的应用中，药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备应用于雷公藤多苷导致的肝损伤的诊断中。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明基于代谢组学与lncRNA基因芯片技术的学科交叉特色，获得的代谢物类生物标志物与基因类生物标志物具有如下优势：1、通过lncRNA→mRNA→代谢终产物的代谢通路对生物标志物进行了有效验证。2、生物标志物的变化发生在药物性肝损伤之前，相比于传统指标的滞后性，具有预警的作用。3、有利于降低药物性肝损伤的发病率和病死率，为临床药物性肝损伤高危人群筛查、预防干预和个体化防治及精准用药提供重要依据，将有助于改善我国药物性肝损伤防控现状，有效缓解患者机体及经济的双重负担。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1A、1B、1C、1D、1E和1F依次分别为雷公藤多苷大鼠肝损伤模型造模六周过程中，每周对照组大鼠与相应低剂、高剂组模型大鼠肝酶指标谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素 (TBIL)、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)和甘油三酯(TG)的变化；
图2为本发明其中一个实施例中的雷公藤多苷大鼠肝损伤模型肝组织HE染色病理切片各自处理结果图，2A高剂量一周组、2B高剂量两周组、2C高剂量三周组、2D高剂量四周组、2E高剂量五周组、2F高剂量六周组、2G低剂量一周组、2H低剂量两周组、2I低剂量三周组、2J低剂量四周组、2K 低剂量五周组、2L低剂量六周组，2M高剂量对照组，2N低剂量对照组；
图3A和3B分别为本发明其中一个实施例中正和负离子模式下色谱总离子流图；
图4A和4B分别为给药前对照组与给药第一至第五周高剂量组在正离子检测模式(4A)和负离子检测模式下(4B)的OPLS-DA得分图(●：给药前对照组；■：给药一周组；给药两周组；给药三周组；给药四周组；给药五周组)；
图5A为对照组与高剂量组在正离子模式下的OPLS-DA得分图(●代表对照组，代表高剂量组)， 5B为对照组与高剂量组在正离子模式下的PLS-DA模型经过100次置换验证的结果；
图6A为对照组与高剂量组在负离子模式下的OPLS-DA得分图((●代表对照组，代表高剂量组)，6B为对照组与高剂量组在负离子模式下的PLS-DA模型经过100次置换验正的结果；
图7A和7B为13个药物性肝损伤潜在生物标志物的ROC曲线，7A为药物性肝损伤模型中4个上调代谢物的ROC曲线，7B为药物性肝损伤模型中9个下调代谢物的ROC曲线；
图8A和8B为药物性肝损伤模型大鼠血清中发生上调的2中代谢物的含量变化，图8A为2-甲基 -3-戊酮酸的含量变化，图8B为乙烯乙酰甘氨酸的含量变化；
图9A、9B、9C为药物性肝损伤模型大鼠血清中发生下调的3种代谢物的含量变化，9A为LPC(22:6) 的含量变化、9B为LPC(20:2)的含量变化、9C为3-吲哚丁酸的含量变化；
图10为药物性肝损伤相关代谢通路分析的可视化结果；
图11为本发明另一个实施例中差异表达基因的火山图(灰色点：P>0.05的基因；绿色点：FC<2， P≤0.05的基因；红色点：FC≥2，P≤0.05的显著上调的差异基因；蓝色点：FC≤-2，P≤0.05的显著下调的差异基因)；
图12为本发明另一个实施例中给药前对照组(BK)与高剂量第四周组(H4)的差异基因分层聚类图。
图13为本发明另一个实施例中上调差异表达基因相关的20条生物学通路；
图14为本发明另一个实施例中下调差异表达基因相关的20条生物学通路；
图15为本发明中生物小分子与差异基因的示意关联图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
基于代谢组学与lncRNA基因芯片技术的学科交叉特色，获得的代谢物类生物标志物与基因类生物标志物具有如下优势：1、通过lncRNA→mRNA→代谢终产物的代谢通路对生物标志物进行有效验证。2、生物标志物的变化发生在药物性肝损伤之前，相比于传统指标的滞后性，具有预警的作用。3、有利于降低药物性肝损伤的发病率和病死率，为临床药物性肝损伤高危人群筛查、预防干预和个体化防治及精准用药提供重要依据，将有助于改善我国药物性肝损伤防控现状，有效缓解患者机体及经济的双重负担。
本发明提供用于早期发现与预警药物性肝损伤的生物标志物，所述生物标志物为生物小分子或者差异基因，所述生物小分子包括：乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和 LPC(22:6)。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述差异基因包括：乙醇脱氢酶ADHs基因和多巴脱羧酶DDC基因NM_001270852.1/NM_001270853.1/NM_012545.4，所述乙醇脱氢酶ADHs基因包括 Adh4NM_017270.2，Adh6NM_001012084.1和Adh7NM_134329.1。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述药物性肝损伤为雷公藤多苷导致的肝损伤。
本发明提供用于早期发现与预警药物性肝损伤的方法，检测样品生物标志物的浓度，所述生物标志物为生物小分子或差异基因，所述生物小分子包括乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、 LPC(20:2)和LPC(22:6)，当检测生物小分子的浓度时，利用液相色谱串联质谱法进行定量检测，若乙烯乙酰甘氨酸比正常浓度升高4倍以上、2-甲基-3戊酮酸比正常浓度升高1.5倍以上、3-吲哚丁酸比正常浓度下降0.65倍以下、LPC(20:2)比正常浓度下降0.7倍以下、LPC(22:6)比正常浓度下降0.7倍以下，则判定该样品发生药物性肝损伤。
在上述方案中，作为优选，当样品中的乙烯乙酰甘氨酸比正常浓度升高4.07倍以上、2-甲基-3戊酮酸比正常浓度升高1.55倍以上、3-吲哚丁酸比正常浓度下降0.67倍以下、LPC(20:2)比正常浓度下降0.71倍以下、LPC(22:6)比正常浓度下降0.73倍以下，则判定该样品发生药物性肝损伤。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述差异基因包括乙醇脱氢酶ADHs基因和多巴脱羧酶DDC基因NM_001270852.1/NM_001270853.1/NM_012545.4，所述乙醇脱氢酶ADHs基因包括Adh4 NM_017270.2，Adh6NM_001012084.1和Adh7NM_134329.1，当检测样品中差异基因的表达量时，若Adh4基因的表达量为正常值的4.2倍以上，DDC基因的表达量为正常值的1.2倍以上，Adh6基因的表达量为正常值的47倍以上，Adh7基因的表达量为正常值的0.8倍以上，则判定该样品发生药物性肝损伤。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述药物性肝损伤为雷公藤多苷导致的肝损伤。
在上述方案中，作为优选，当检测生物小分子的浓度时，所述样品采用动物血清。
在上述方案中，作为优选，当检测样品差异基因的表达量时，所述样品为动物肝脏组织。
所述的生物标志物在科学研究(比如药物性肝损伤动物模型的建立与评价；药物或化合物肝脏毒性的筛选与评价等)、制备药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述的应用中，药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备应用于雷公藤多苷导致的肝损伤的诊断中。
为使本领域技术人员更好地理解本发明，现提供如下的实施例进行说明：
实施例1
雷公藤多苷致肝损伤大鼠模型的血清代谢组学研究
2材料与方法
2.1仪器与材料
戴安系列超高效液相色谱仪(ultra high performance liquidchromatography，UHPLC， California，USA)，Q-Exactive四级杆-轨道阱高分辨串联质谱仪(Thermo Scientific，Waltham，MA， USA)，以及其他本领域常用设备及试剂。雷公藤多苷片(批号：150302；规格：10mg*50片/瓶，福建汇天生物药业有限公司)；
实验动物：6～8周龄Wistar大鼠114只，体重160～180g，购自维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2012-0001。
2.2样本的收集与制备
2.2.1大鼠肝损伤模型建立与样本采集
雷公藤多苷大鼠肝损伤模型在18.9mg/kg的剂量下连续灌胃42天可成功建立肝损伤模型。大鼠给药分为三组：正常对照组、低剂量组(9.5mg/kg，根据成人临床最大使用剂量1.5mg/kg换算)和高剂量组(18.9mg/kg)。并根据给药时长具体分为：低剂量第一周组至第六周组(L1～L6)；高剂量第一周组至第六周组(H1～H6)；给药前空白组(BK0)及各周相对应的对照组(BK1～BK6)，每小组各6 只大鼠，共114只大鼠。
分别于给药第7日、第14日、第21日、第28日、第35日和第42日处死每周相应的对照及高、低剂量组大鼠。每只大鼠下腔静脉取血4mL，4℃下3500rpm离心10min。将分离的血清分为三份，第一份4℃保存进行血清生化指标检测，第二份-80℃冻存进行血清代谢组检测，剩余-80℃冻存备用。完整分离肝脏并称重，将肝组织分为三份，第一份用10％中性甲醛溶液固定以制作肝组织病理切片，第二份液氮冻存进行差异基因表达分析，剩余-80°冻存备用。
2.2.2样本的制备
将-80℃冻存的血清样本放置于4℃下融化，2500rpm涡旋混合3min。精密吸取血清样本40μL，并加入300μL冰乙腈，2500rpm涡旋5min，使其充分混合后，于4℃条件下10000rpm离心10min，沉淀蛋白。吸取上清液200μL，36℃离心浓缩1h至干燥。上样检测前，向经离心浓缩的样本中加入含2％乙腈的水溶液200μL进行复溶，2500rpm涡旋混合3min使其全部溶解，在4℃下10000rpm离心10min，取上清液并经96孔板过滤后进行UPLC-MS/MS分析。
2.3样本分析检测条件
2.3.1色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm，2.1×100mm)，与保护柱ACQUITYUPLC HSS T3 VANGUARD(1.8μm)。柱温：30℃。流速：0.25mL/min。进样体积：5μL。流动相：A为含0.1％甲酸的水溶液；B为乙腈；线性梯度洗脱，进样前用起始流动相平衡色谱柱8min，具体梯度洗脱条件如下：
表1-1.梯度洗脱条件
流动相A：水，含0.1％甲酸；Mobile phase A：0.1％formic acid in water；
流动相B：乙腈；Mobile phase B：acetonitrile。
2.3.2质谱条件
离子源为加热ESI源，采用正、负离子检测模式检测。所使用的各种气路均为氮气。
正离子检测模式质谱参数如下：
负子检测模式质谱参数如下：
2.4酶学指标统计学处理
采用SPSS16.0软件对每周对照组、低剂量及高剂量组大鼠的血清生化结果进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.5多变量统计分析数据处理
2.5.1数据预处理
分别采用正、负离子检测模式下的LC-MS/MS方法对正常对照组大鼠及肝损伤组大鼠的血清样本进行分析。针对获得的LC-MS/MS原始数据，通过数据格式转换软件MassMatrix MS Data File Conversion，将原始.raw格式的数据文件转换为.mzXML格式。再将其导入开源数据处理软件XCMS 进行峰识别、峰过滤和峰对齐，获得包括质荷比(m/z)、保留时间及峰面积在内的二维数据阵[21-22]。
2.5.2多变量统计分析
将上述二维数据阵输入多变量统计分析软件SIMCA-P 13.0(VersionAB，Sweden)，在数据分析前进行mean-centering中值化及pareto-scaling标度化处理，消除噪音及假峰对数据分析产生的影响。采用正交偏最小二乘判别分析(orthogonalprojections to latent structures discriminant analysis， OPLS-DA)建立模式识别模型，并采用偏最小二乘判别分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)对所建立的模型进行交叉验证分析。
2.5.3差异代谢物的筛选
通过OPLS-DA模型中变量的VIP(Variable importance on projection)值和S-plot载荷图，挑选所有对分组有贡献的差异变量(VIP>1.0)。经过带Jack-knifed置信区间进行可靠性验证，并使用原始变量轮廓图删除两组数据严重重叠的变量。通过对差异变量进行组间t-test(P<0.05),保证筛选出的变量在组间的差异具有统计学意义。进一步使用Pearson协相关分析计算差异变量间的二级偏相关系数；对于相关系数r>0.8的变量，结合CAMERA分析结果以及提取离子流色谱图或离子的精确质量数和保留时间，剔除同位素离子、加和离子或碎片离子，获得准确分子离子。
2.6潜在生物标志物的结构鉴定
通过高分辨的MS及MS/MS谱分析、同位素丰度比和质谱裂解特征，结合网络数据库检索：HMDB (http://www.hmdb.ca/)，Massbank(http://www.massbank.jp/)，METLIN(http://metlin.scripps.edu/)and KEGG(http://www.kegg.jp/)对发现的差异代谢物进行结构鉴定。并通过与标准品的保留时间和MS/MS 谱对照分析，最终确定差异代谢物的结构。
3结果与讨论
3.1酶学指标分析
通过测定常用临床肝功能指标谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)和甘油三酯(TG)来衡量大鼠肝损伤的进展情况。图1A-1F 中为造模六周过程中，每周对照组大鼠与相应低剂、高剂组模型大鼠肝酶指标的变化。如图所示，与对照组相比，AST指标在第一周至第四周的低、高剂量组均有升高趋势；高剂量组的第一周和第四周中AST指标升高具有统计学意义；低剂量组的第二周至第四周AST指标具有明显升高；两个剂量组在第五周和第六周均无明显变化。ALT指标在第一周和第二周的低、高剂量组同样显示出升高趋势，且低、高剂量组在第一周ALT的升高均具有统计学意义；第三周至第六周ALT变化趋于平缓，且与对照组相比有降低的趋势，这可能与动物的自身耐受有关。TBIL指标在第三周的高剂量组中发生了明显的升高，ALP指标在第一周的高剂量组中具有显著的增高。GGT和TG指标在第一周至第六周中未出现明显变化。血清中肝酶指标AST和ALT的变化与文献报道基本相符。
3.2病理组织学结果分析
雷公藤多苷致大鼠肝损伤的HE染色病理切片可见图2。根据文献报道，雷公藤多苷引起的肝脏损伤具有时间及剂量依赖性。由图2A至2N中可以观察到，造模六周后对照组大鼠的肝组织无明显病理改变，肝小叶及细胞结构正常、肝索排列整齐；高剂量组在第一周至第四周出现肝细胞肿胀，大部分肝细胞出现小泡性的脂肪变。第五周和第六周高剂量组出现肝索结构紊乱，肝小叶和汇管区可见炎性细胞浸润，肝细胞出现脂肪变性。低剂量组从第一周至第四周的肝细胞结构基本正常，视野中有个别细胞内出现脂肪变；第五周和第六周出现脂肪变的肝细胞较前四周稍多。综上所述，在六周造模时间内高剂量组对大鼠肝脏造成了比较明显的损害，而低剂量组的大鼠肝脏基本正常，随用药时间增加而在第五和第六周出现轻度改变。
3.3数据可靠性评价
在正、负离子检测模式下，对高、低剂量组肝损伤大鼠及对照组大鼠的血清样本进行LC-MS检测，总离子流色谱图(total ion chromatography，TIC)如图3A和3B所示。血清样本中的诸多代谢物能够得到良好的分离，保留时间在30min以内，适用于大样本检测分析要求。
3.4血清中代谢物的轮廓分析
在正离子检测模式下共获得4019个变量，在负离子检测模式下获得2064个变量。将正、负离子模式下获得的二维数据阵分别导入SIMCA-P软件进行多变量统计分析。
综合病理切片及血清酶学结果，提示高剂量组大鼠在给药的六周中发生了明显的肝脏损害，选取前五周的数据进行多变量分析。为了更加清晰的观察雷公藤多苷致肝损伤大鼠在给药前及给药的五周中血清代谢物整体轮廓的变化轨迹，选择给药前对照组及高剂量组的样本同时进行OPLS-DA模型分析。图4A和4B所示LC-(+)ESI/MS谱所获得的OPLS-DA分析结果，表明给药前对照组及第一至五周高剂量组共6个样本组可达到比较明显的聚类及分组，其中给药第四、五周组的样本比给药第一至三周组的样本更加偏离对照组，表明随着肝损伤发生时间的增加，其病理损害逐渐加重。对LC-(-)ESI/MS (图4B)谱所获得的数据阵进行同样的统计分析，结果显示六组间同样能够得到比较明显的聚类及分组。
通过对给药前对照组及高剂量组的大鼠血清样本进行整体代谢轮廓分析后，发现高剂量组在给药第一周后即在代谢水平上出现明显的扰动，与病理组织的观察结果相一致。因此，后期将选择高剂量组所有样本与对照组所有样本的LC-MS谱数据进行OPLS-DA多变量统计分析，有利于寻找可用于药物性肝损伤早期发现的潜在生物标志物。
3.5模式识别模型的建立及验证
选用PLS-DA和OPLS-DA模型进行有监督的数据分析，并采用置换验证(permutation test)避免 PLS-DA模型拟合过度以证明模型的可靠性。进一步结合OPLS-DA模型中的变量VIP值，带jack-knife 置信区间的载荷图及原始变量轮廓图对差异代谢物进行筛选。
为寻找对照组与高剂量组大鼠血清中的差异代谢物，本研究选用OPLS-DA模型对血清样本的LC-(±)ESI/MS数据进行有监督的数据分析。如图5A所示，LC-(+)ESI/MS谱获得的数据得到的OPLS-DA 模型含有1个预测成分和2个正交成分，46.2％的变量[R2(X)]可用于解释74.5％的组间差异[R2(Y)]，经过交叉验证显示预测能力为52.2％[Q2Y]。R2(Y)与Q2Y之间的差值为0.223(一般不超过0.2～0.3)，Q2Y 值大于50％，表示模型预测能力良好。为了避免模型过度拟合，对与OPLS-DA模型主成分数相同的PLS-DA模型进行置换验证，图5B为其经过100次建模的置换验证结果，获得的R2Y(绿色圆形)与真实模型的R2Y值共同构成的回归线截距为0.375(理论上应小于0.3～0.4)，Q2Y(蓝色方块)与真实模型的Q2Y值共同构成的回归线截距为-0.192(理论上应小于0.05)。
由LC-(-)ESI/MS谱获得的数据得到的OPLS-DA模型(图6A)含有1个预测成分和2个正交成分， 61.5％的变量[R2(X)]可用于解释64.5％的组间差异[R2(Y)]，经过交叉验证显示预测能力为49.4％[Q2Y]。 R2(Y)与Q2Y之间的差值为0.151。对主成分数为3的PLS-DA模型进行置换验证，图6B为其经过100 次建模的置换验证结果，获得的R2Y(绿色圆形)与真实模型的R2Y值共同构成的回归线截距为0.388， Q2Y(蓝色方块)与真实模型的Q2Y值共同构成的回归线截距为-0.227。
以上验证结果表明，血清样本在正、负离子检测模式下获得的数据结果，经过多变量统计分析后，数据模型符合相关参数标准，能够有效的进行潜在生物标志物的筛选。
3.6潜在生物标志物的筛选
(1)本研究采用VIP list与S-plot载荷图相结合来挑选所有对分组有贡献的差异变量。首先通过S-plot 载荷图初步筛选差异变量；再结合VIP list，挑选VIP值大于1的变量，当VIP值大于1时则认为该变量对于模型分组的贡献高于平均水平[31]，进一步通过jack-knifed置信区间验证这些变量的可靠性，删除跨越零值的变量。经过上述筛选步骤，在正离子检测模式下获得252个差异变量，在负离子检测模式下获得个170差异变量。
(2)对上述差异变量在对照组和高剂量组中的检测强度(峰面积)进行独立样本t检验，删除两组间差异无统计学意义(P>0.05)的变量；结合原始代谢轮廓图，删除组间数据严重交叉的变量。经过上述筛选，在正离子检测模式下获得152个差异变量，在负离子检测模式下获得129个差异变量。
(3)通过手动提取原始数据图谱中的差异变量色谱峰，以验证结果的准确性，将不可靠的差异代谢物剔除，在正离子检测模式下获得84个差异变量，在负离子检测模式下获得38个差异变量。
(4)进一步对差异变量进行Pearson协相关分析，计算各差异变量的二级偏相关系数。对于相关系数 r>0.8的变量，结合提取离子流色谱图或离子的精确质量数和保留时间，以及R语言中CAMERA方法给出的信息，判断相同保留时间的离子是否来源于相同代谢物，剔除同一代谢物的加合离子、同位素离子及碎片离子，获得准确分子离子。经过以上筛选，最终在正离子检测模式下获得个30差异变量，在负离子检测模式下获得25个差异变量，详细信息可见于表1-2。
表1-2.在正、负离子模式下对照组与肝损伤高剂量组的潜在生物标志物
a.Fold change was calculated by the ratio of mean value of controlgroup to high dose group.
3.7潜在生物标志物的结构鉴定
对可能的生物标志进行结构鉴定时，首先需确定潜在生物标志物的[M+H]+或[M-H]-分子离子，通过其精确质量数结合同位素丰度比法初步推测可能生物标志物的分子组成；结合代谢物的高分辨MS、 MS/MS谱，代谢物结构的质谱裂解特征和网上代谢物数据库(HMBD、Metlin、KEGG等)检索，推断可能生物标志物的可能结构。
采用上述方法及思路对本研究发现的其他可能生物标志物进行分析，共鉴定出13个潜在生物标志物的结构，包括：吡啶甲酸、2-甲基-3-戊酮酸、L组氨醇、乙烯乙酰甘氨酸、谷氨酸、7-甲基鸟嘌呤、 5-羟色胺、3-吲哚丁酸、龙胆酸及四种溶血磷脂酰胆碱LPC(18:2)、LPC(20:3)、LPC(20:2)和LPC(22:6)，具体信息可见表1-3。其余一些未确定结构的生物标志物，主要是由于其在血清中含量较低，未能获得理想的MS/MS谱图，或者是在代谢物数据库中未能获得足够的信息确认其结构。
3.8潜在生物标志物的诊断敏感性和特异性评价
本研究采用接收者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)对已鉴定出的13 个潜在生物标志物的诊断性能进行评价。ROC曲线下面积(areaunder the curve，AUC)可反映诊断指标区分阳性和阴性诊断能力的大小。AUC值越大，则表示诊断准确性越高，通常认为当0.5<AUC<0.7 时，诊断价值较低；在0.7<AUC<0.9时，诊断价值中等；当AUC≥0.9时，诊断价值较高。
采用SPSS16.0软件进行ROC曲线分析，图7A为在肝损伤大鼠血清中发生上调的4个潜在生物标志物的ROC曲线，其中乙烯乙酰甘氨酸和2-甲基-3-戊酮酸的AUC分别为0.840和0.727，表示其具有一定的诊断价值；图7B为肝损伤大鼠血清中发生下调的9个潜在生物标志物的ROC曲线，其中3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6)的AUC分别为0.828、0.735和0.715，表示其作为药物性肝损伤潜在标志物的诊断具有一定的准确性。
进一步分析上述5个潜在标志物在正常对照组及低剂量组中大鼠血清中的变化。由病理结果可知，低剂量组在第一至第四周均未发生明显病理改变，而第五周出现少量细胞脂肪变，因此将结合与肝损伤关系更敏感的ALT指标和5个潜在标志物在低剂量组第一至第五周中的含量进行比较。图8A和8B 所示为低剂量组大鼠血清中发生上调的两个代谢物的含量变化图。与对照组相比，乙烯乙酰甘氨酸和 2-甲基-3-戊酮酸在低剂量组第一至第五周中的含量均明显升高，而ALT指标未发生显著改变；表明乙烯乙酰甘氨酸和2-甲基-3-戊酮酸在肝损伤发生时比ALT指标更为灵敏，能够在肝实质损伤发生前进行预警，可能为药物性肝损伤早期发现的潜在生物标志物。
图9A、9B、9C所示为低剂量组大鼠模型血清中发生下调的三个代谢物的含量变化图。与对照组相比，3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6)在低剂量第四、五周中的含量均显示明显下降，ALT指标未发生显著改变，提示三种代谢物相联合可更加有效的预警肝损伤，可能成为药物性肝损伤早期发现的潜在生物标志物。
3.9药物性肝损伤相关的代谢通路分析
为进一步分析药物性肝损伤发生发展机制可能涉及的代谢通路，利用所发现的13个潜在生物标志物进行了相关的代谢通路分析。MetaboAnalyst 3.0(www.metaboanalyst.ca)是一款专门为代谢组学提供综合数据分析的在线网站，其中的通路分析模块(pathway analysis module)以京都基因与基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)代谢途径数据库为依托，可将富集分析(enrichiment analysis)与通路拓扑结构分析(pathway topology analysis)的结果相整合，确定与研究结果最相关的代谢通路，并将其可视化以直观分析。
将已鉴定出的13个潜在药物性肝损伤生物标志物的英文名称输入至代谢通路分析模块，并与 KEGG等数据库中标准化合物信息进行匹配，选择所要分析的物种Rattusnorvegicus(Rat)通路数据库进行检索，最终共发现13条代谢通路可能与药物性肝损伤的发生机制相关，涉及谷氨酸盐代谢，氮素代谢，类脂化合物代谢，组氨酸代谢，丁酸甲酯代谢，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，甘油磷脂代谢，色氨酸代谢，酪氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，氨酰基-tRNA生物合成与卟啉和叶绿素代谢，结果可见表1-4。
代谢通路的可视化结果如图10所示，当P值越小时，节点的颜色越深；代谢通路影响值(Pathway Impact，PI)越大时，节点的半径越大，其所代表的通路与药物性肝损伤的相关性越大。发现的相关 13条代谢通路中，影响值PI>0.1的共有4条，即谷氨酸盐代谢，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，类脂化合物代谢，色氨酸代谢，表明这4条通路与药物性肝损伤的发生密切相关。
表1-4.药物性肝损伤潜在生物标志物的代谢通路分析
a.The raw p was original p value derived from enrichiment analysis.
4小结
本研究采用基于LC-MS/MS的代谢组学方法，对雷公藤多苷致肝损伤模型大鼠与正常对照大鼠的血清进行分析。通过多元统计分析，建立OPLS-DA模式识别模型；通过VIPlist、Jack-knifed置信区间等一系列筛选，从高剂量肝损伤组大鼠与正常对照组大鼠的血清中获得55个差异代谢物。通过高分辨MS谱和MS/MS谱分析，对潜在生物标志物的结构进行分析，鉴定出13个差异代谢物的结构，其中4个代谢物：2-甲基-3戊酮酸、L组氨醇、乙烯乙酰甘氨酸及谷氨酸在肝损伤大鼠血清中发生明显上调；9个代谢物：吡啶甲酸、7-甲基鸟嘌呤、5-羟色胺、3-吲哚丁酸、龙胆酸及四种溶血磷脂酰胆碱 LPC(18:2)、LPC(20:3)、LPC(20:2)和LPC(22:6)发生下调。采用ROC曲线对差异代谢物诊断敏感性及特异性进行分析，发现乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6)这5个代谢物作为药物性肝损伤早期发现的潜在生物标志物具有一定的诊断价值。进一步通过已鉴定的潜在生物标志物进行了相关代谢通路分析，发现药物性肝损伤大鼠体内谷氨酸盐代谢，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，类脂化合物代谢，色氨酸代谢4条通路发生明显紊乱，表明上述代谢通路与药物性肝损伤的发生显著相关。
实施例2
雷公藤多苷致肝损伤大鼠模型的肝脏差异基因表达谱研究
2材料与方法
2.1仪器与材料均为本领域常用仪器及材料
2.2样本的收集
本研究所使用的样本为雷公藤多苷致肝损伤模型的大鼠肝脏组织，本实施例中采用实施例1中的大鼠肝脏组织。结合肝酶指标与病理结果，选取给药前对照组大鼠和药物性肝损伤高剂量组大鼠给药第一周、第二周和第四周的样本进行差异基因表达分析。从每周的6个样本中各随机抽取3个样本进行基因芯片检测。抽取的样本编号为：对照组BK1、BK5、BK6；高剂量第一周组H1-3、H1-5、H1-6；高剂量第二周组H2-4、H2-5、H2-6；高剂量第一周组H4-2、H4-5、H4-6。所有样本在提取及检测前均保存于液氮。
2.3肝组织RNA的提取与质量检测
肝组织总RNA利用NanoDrop ND2000进行定量，并经Agilent 2100型生物分析仪及1％琼脂糖电泳检测RNA完整性和纯度。RNA完整指数(RNA Integrity Number，RIN)大于7且28S/18S>0.7时，表示RNA完整性好；测定RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/280值处于2.0左右表示提取的RNA纯度较高，可用于基因芯片分析。RNA质检合格后，样本的标记、芯片的杂交以及洗脱参照芯片标准流程。肝脏总RNA的提取及基因芯片表达谱检测均由上海欧易公司完成。
2.4基因芯片检测分析
将肝脏总RNA反转录成双链cDNA，再进一步合成用生物素Cyanine-3-CTP(Cy3)标记的cRNA。本研究使用的芯片为Agilent Rat LncRNAArray。将标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C扫描芯片获得原始探针信号。采用FeatureExtraction软件(version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像并提取原始数据，并利用Genespring软件(version 13.1,Agilent Technologies) 对原始数据进行quantile标准化处理。
2.5统计学处理与生物信息学分析
将标准化后的数据进行统计学处理，组间比较采用独立样本t检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。利用t检验的P值和倍数变化(Fold change，FC)值进行差异表达基因筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化FC≥2.0且P<0.05。进一步对差异表达基因进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。对差异基因进行KEGG富集分析以判定差异基因主要影响的生物学通路。
2.6差异表达基因mRNA荧光定量PCR检测分析
针对主要影响的生物学通路上的差异基因进行PCR定量检测分析，获得准确定量结果。具体步骤包括：
RNA提取：提取总RNA，利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)测定浓度及 OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
逆转录：利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录体系：第一步：总RNA，0.5μg；4×gDNA wiperMix，2ul；；Nuclease-free H2O 加至8μl，反应程序：42℃2min。第二步：加入5×HiScriptII Q RT SuperMix IIa，2μl，反应程序：
25℃10min，50℃30min，85℃5min。总反应体积10ul。逆转录完毕后加入90μlNuclease-free H2O储存在-20℃冰箱备用。
引物设计：引物采用Roche LCPDS2软件设计并由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
荧光定量PCR：利用Green PCR Kit试剂盒(Qiagen，Germany)在480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上进行反应。体系：2×Green PCR Master Mix， 5μl；10μM Forward primer，0.2μl；10μM Reverse primer，0.2μl；cDNA，1μl；Nuclease-free H2O，3.6μl。 PCR程序：95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每℃采集5次荧光信号。
计算表达量：获得扩增曲线和熔解曲线，采用2-ΔΔCt法(ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt＝ΔCt 实验组样品-ΔCt对照组样品)，计算表达量与相对表达量。
3结果与讨论
3.1肝组织提取总RNA的浓度和质量检测
表2-1为样本总RNA的浓度及质量检测结果。12个样本的总RNA提取结果良好，总RNA的吸光度OD260/280值均在(2.0±0.2)之间，28S/18S>1.5且RIN≥7，表示RNA的完整性和纯度均符合芯片检测要求。
表2-1.总RNA的浓度及质量检测结果
3.3差异表达基因的筛选
基因芯片的分析结果利用t检验得到的差异显著性P值和标准化信号值的差异倍数值进行筛选，标准为FC≥2.0且P≤0.05。筛选后H4组与BK组中共有1803条mRNA存在表达差异，其中表达上调759个，表达下调1044个。图11为差异表达基因的火山图，X轴是差异倍数以2为底取对数的值，Y 轴是P-value值以10为底取负对数的值。图12为给药前对照组(BK)与高剂量第四周组(H4)的差异表达基因的分层聚类图。
3.4差异表达基因相关通路分析
利用KEGG数据库对差异基因进行相关通路(Pathway)分析，并且用统计检验的方法计算每个 Pathway条目中差异基因富集的显著性，以P<0.05表示差异基因在该Pathway中出现了显著性的富集。
通过KEGG数据库的富集分析，对差异表达的1803个基因进行Pathway功能分析，图13和图14 为上调及下调表达基因富集分析排名前20的相关生物学通路。富集结果显示，上调差异表达基因显著参与生物学通路17条，其中涉及氨基酸代谢通路3条，包括精氨酸生物合成、氨基酸生物合成及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸盐代谢；下调差异表达基因显著参与生物学通路8条，其中涉及1条氨基酸代谢通路，即酪氨酸代谢。具体通路信息见于表2-2和表2-3。其中酪氨酸代谢通路，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸盐代谢通路。
表2-2.上调差异基因显著富集的17条生物学通路
Table 2-2.20biological pathways of related up-regulated genes
a.The description of biological pathway
b.The number of target genes in this pathway
c.Significant P values of Enrichment in pathway
d.The P values after calibration by Benjamini-Hochberg method
表2-3.下调差异基因显著富集的8条生物学通路
a.The description of biological pathway
b.The number of target genes in this pathway
c.Significant P values of Enrichment in pathway
d.The P values after calibration by Benjamini-Hochberg method
通过前期代谢组学的研究结果，确定了Tyrosine metabolism代谢通路，可以通过对酪氨酸代谢通路的基因进行检测以作为佐证。
3.5差异表达基因mRNA荧光定量PCR检测分析
结合代谢组学获得的研究结果，针对酪氨酸代谢通路上差异表达的基因：乙醇脱氢酶ADHs (ADH6、ADH4、ADH7)与多巴脱羧酶DDC基因进行PCR定量检测分析，获得健康组与药物性肝损伤模型组基因的准确定量结果。表2-5为基因的具体名称与引物信息。
表2-5基因的具体名称与引物信息
具体表达量与相对表达量及相关倍数关系如表2所示。
表2.差异mRNA荧光定量PCR结果
4小结
本研究采用基因芯片技术结合生物信息学分析，对雷公藤多苷致肝损伤大鼠模型的肝脏组织进行差异基因表达谱初步研究。针对空白对照组大鼠和药物性肝损伤组大鼠间的差异表达基因，以FC≥2.0 且P≤0.05为筛选标准，共检出1803个差异表达基因，其中759个表达上调，1044个表达下调。对差异表达基因进行基于KEGG数据库的通路(Pathway)功能分析。富集结果显示：上调差异表达基因主要参与生物学通路17条，其中涉及氨基酸代谢通路3条，包括精氨酸生物合成、氨基酸生物合成及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸盐代谢；下调差异表达基因主要参与生物学通路8条，其中涉及1条氨基酸代谢通路，即酪氨酸代谢。进一步针对酪氨酸代谢通路关注的基因，获得对应分组中的表达量，并进行mRNA荧光定量PCR验证，验证生物标志物的可靠性提供依据。
综合实施例1和2，由图15可见，实施例1中发现的生物标志物共鉴定出13个潜在生物标志物的结构，包括：吡啶甲酸、2-甲基-3-戊酮酸、L组氨醇、乙烯乙酰甘氨酸、谷氨酸、7-甲基鸟嘌呤、5- 羟色胺、3-吲哚丁酸、龙胆酸及四种溶血磷脂酰胆碱LPC(18:2)、LPC(20:3)、LPC(20:2)和LPC(22:6)，涉及谷氨酸盐代谢，氮素代谢，类脂化合物代谢，组氨酸代谢，丁酸甲酯代谢，丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，甘油磷脂代谢，色氨酸代谢，酪氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，这其中大多涉及氨基酸代谢；并且，基因lncRNA代谢通路分析结果显示确有氨基酸代谢通路相关，同时对酪氨酸代谢通路相关基因(ADH4等)进行定量验证，确有差异；这表明上述13个潜在生物标志物与相关差异基因(ADH4等)确有关联。
实施例3
一种高灵敏度、高通量液相色谱串联质谱法定量动物血清的生物小分子试剂盒及其制备以及基因芯片技术检测动物基因标志物试剂盒及其制备，由特定浓度的生物小分子标准曲线、质控样本、样本沉淀试剂、内标液、流动相调节液组成；以及RNA的提取及基因芯片表达谱检测。
包括如下步骤：
(1)生物小分子(乙烯乙酰甘氨酸、2-甲基-3戊酮酸、3-吲哚丁酸、LPC(20:2)和LPC(22:6))储备液、标志物母液、标准曲线样本、质控样本的配制；(2)样本沉淀试剂的配制；(3)流动相调节液甲酸的配制。
血清的生物小分子定量检测方法，包括：
(1)血清样本预处理：血清于4℃条件下融化，涡旋混匀，通过乙腈沉淀蛋白，加入内标液，涡旋混匀，高速离心，取上清液。
(2)液相分离：
a.采用C18、C8或氰基键和硅胶作固定相；
b.流动相：乙腈；甲醇；乙酸铵；甲酸铵；等度或梯度洗脱；控制流速。其所使用的流动相为：乙腈；甲醇；乙酸铵；甲酸铵；反相色谱等度或梯度分离。
(3)质谱测定：电喷雾离子源；大气压化学电离源；正离子方式。
利用液相色谱串联质谱法定量检测样品肝脏组织血清中生物标志物的浓度，当检测血清中生物小分子的浓度时，若血清中的乙烯乙酰甘氨酸比正常浓度升高4倍以上、2-甲基-3戊酮酸比正常浓度升高1.5 倍以上、3-吲哚丁酸比正常浓度下降0.65倍以下、LPC(20:2)比正常浓度下降0.7倍以下、LPC(22:6)比正常浓度下降0.7倍以下，则判定该样品发生药物性肝损伤
实施例4
基因芯片技术检测动物基因标志物试剂盒及其制备，包括如下步骤：
(1)RNA的提取：总RNA利用NanoDrop ND2000进行定量，并经Agilent 2100型生物分析仪及1％琼脂糖电泳检测RNA完整性和纯度。(2)差异基因(ADH6、ADH4、ADH7与DDC)及内参基因引物序列、PCR曲线，溶解曲线的配制；(3)测定RNA在260nm和280nm的吸光度值；(4)基因芯片分析
血清的差异基因检测方法，包括：
(1)基因芯片检测分析：使用的芯片Agilent Rat LncRNA Array。将标记好的cRNA和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C扫描芯片获得原始探针信号。采用Feature Extraction软件 (version10.7.1.1,Agilent Technologies)处理原始图像并提取原始数据，并利用Genespring软件(version 13.1,Agilent Technologies)对原始数据进行quantile标准化处理。
(2)mRNA检测与数据处理：RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。当检测样品肝脏组织血清中差异基因的表达量时，若Adh4基因的表达量为正常值的4.2倍以上，DDC基因的表达量为正常值的1.2倍以上，Adh6基因的表达量为正常值的47倍以上，Adh7基因的表达量为正常值的0.8倍以上，则判定该样品发生药物性肝损伤。
实施例5
所述的生物标志物在科学研究(比如药物性肝损伤动物模型的建立与评价；药物或化合物肝脏毒性的筛选与评价等)、制备药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用，药物性肝损伤诊断试剂盒或诊断设备应用于雷公藤多苷导致的肝损伤的诊断中
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的用于早期发现与预警肝损伤的生物标志物、方法及应用的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用
<130> 2017
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgatctgga cttactggtg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaggtcagg attgttcgg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catgtgggtg aagaagagaa c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctcagataa acagggtcca ta 22
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ccttcgtcaa tcttggcg 18
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tattggctga cggcacga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atccaggacc gtgtactc 18

Claims (1)

1.生物标志物检测试剂在制备雷公藤多苷导致的肝损伤诊断试剂盒中的应用，所述生物标志物为乙烯乙酰甘氨酸。
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