CN112394178B - 莫西沙星相关肝损伤的生物标志物、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了莫西沙星相关肝损伤的生物标志物，包括L‑酪氨酸、L‑亮氨酸、L‑缬氨酸、左旋多巴和L‑异亮氨酸。本发明还公开了包含能够检测生物标志物的试剂的试剂盒。本发明还公开了生物标志物在代谢组学、代谢通路和肠道菌群变化的研究中或制备肝损伤诊断试剂盒或诊断设备研发中的应用。本发明提供的生物标志物易于检测，具有检测和预警的作用。本发明首次报道了莫西沙星诱导肝毒性的代谢变化和微生物组成差异，将代谢组学与肠‑肝轴上的肠道菌群相关联以研究莫西沙星诱发的肝损伤，丁酸缺乏引起的与能量相关的代谢紊乱和肠道微生态失调造成肝损害，有助于阐明莫西沙星引起的肝毒性的发病机制，提高人们对于药物性肝损伤的认识。

Description

莫西沙星相关肝损伤的生物标志物、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于肝损伤技术领域，涉及莫西沙星相关肝损伤生物标志物、试剂盒及应用。
背景技术
莫西沙星具有肝损伤危险，相关病例对照研究表明，莫西沙星和左氧氟沙星的临床使用更容易发生肝损伤的风险。回顾性研究和病例报告提示，与莫西沙星暴露有关的肝毒性风险增加。代谢组学提供了阐释多种环境毒物可能与宿主生物相互作用产生其整体表型变化的分析平台。广谱抗生素对微生物群组成具有深远而持久的影响，包括多样性的降低和群落组成的改变。近年来，许多研究表明肠道菌群的改变可导致许多疾病的产生，饮食或环境因素可影响肠道微生物组的组成和肝脏疾病的发展，包括肝硬化、非酒精性脂肪肝(NAFLD)和脂肪性肝炎(NASH)。肠道菌群可能通过肠肝循环和肠—肝轴对宿主代谢和健康产生深远影响。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一种目的是提供莫西沙星相关肝损伤的生物标志物。
本发明另有一个目的是提供包含能够检测所述的生物标志物的试剂的试剂盒。
本发明再有一个目的是通过所述的生物标志物在代谢组学、代谢通路和肠道菌群变化的研究中或制备肝损伤诊断试剂盒或诊断设备研发中的应用。
为此，本发明提供的技术方案为：
莫西沙星相关肝损伤的生物标志物，所述生物标志物包括L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、左旋多巴和L-异亮氨酸。
优选的是，所述的莫西沙星相关肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物还包括丙酮酸、草酰乙酸、琥珀酸、3-甲基-2-酮丁酸、柠檬酸、乙酰乙酸、S-乳酸、3-氧代丙酸、琥珀酸半醛、R-乳酸、异柠檬酸和β-羟丁酸。
优选的是，所述的莫西沙星相关肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物包括肌苷酸、D-甘露糖、二羟基丙酮、β-D-葡萄糖和α-D-葡萄糖。
优选的是，所述的莫西沙星相关肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物包括花生四烯酸、棕榈酸、D-甘油、甘油磷酰乙醇胺、亚油酸、甘油三酯18:0、甘油三酯18:1、磷脂酰胆碱18:0、磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰胆碱20:3和鞘氨酸。
优选的是，所述的莫西沙星相关肝损伤的生物标志物中，所述生物标志物还包括L-肾上腺素、吲哚-3-乙酸、酪胺、乙醛和甲基乙二醛。
包含能够检测所述的生物标志物的试剂的试剂盒。
所述的生物标志物在代谢组学、代谢通路和肠道菌群变化的研究中或制备肝损伤诊断试剂盒或诊断设备研发中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供的生物标志物的易于检测，变化发生在肝损伤严重之前，具有检测和预警的作用。同时，本发明首次报道了莫西沙星诱导肝毒性的代谢变化和微生物组成差异，提出了一个研究思路，将代谢组学与肠-肝轴上的肠道菌群相关联以研究莫西沙星诱发的肝损伤，丁酸缺乏引起的与能量相关的代谢紊乱和肠道微生态失调造成肝损害，本发明研究结果有助于阐明莫西沙星引起的肝毒性的发病机制，提高人们对于药物性肝损伤的认识。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中莫西沙星引起的转氨酶的变化示意图和肝损伤的组织病理学观察图，通过肝损伤相关的血清生化指标和组织病理学观察评估肝损伤可知，在莫西沙星给药组的第3、7、14、21天检测大鼠的ALT，AST，TBIL，ALP，SOD和MDA的血清水平(*p<0.05)。光学显微镜下H&E染色的代表性病理图像显示，在莫西沙星处理组中，肝细胞脂肪变性明显，呈脂肪液泡(黑色箭头)(放大倍数：10倍)。
图2为莫西沙星诱导的肝损伤大鼠在第7天的代谢组学分析和代谢变化图，其具有最严重的肝损伤和组织病理学特征。2A确定了总共40个极性和非极性差异代谢物的调节和倍数变化，FC>0：代谢产物上调；FC<0：代谢产物下调；2B为具有相互反应关系的代谢物可视化图，涉及七个代谢途径，其中，乙醛、β-羟丁酸丰度上调，L-缬氨酸、草酰乙酸、异柠檬酸、琥珀酸、柠檬酸、左旋多巴、L-肾上腺素丰度下调；R-乳酸、甲基乙二醛、S-乳酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、丙酮酸、3-甲基-2-酮丁酸、酪胺、L-酪氨酸、乙酰乙酸和琥珀酸半醛无统计学意义；以“#”标记的反应关系线表示两种代谢物反应活性上调；以“*”标记的反应关系线表示两种代谢物反应活性下调；反应关系为实线代表两种代谢物比率具有直接关系，但无统计学意义；反应关系为虚线代表两种代谢物间没有直接关系。
图3为本发明中在莫西沙星给药的第3、7、14、21天，莫西沙星诱发的肝损伤中代谢产物的统计学显着性热图(p<0.05)，与对照组相比。
图4为本发明中莫西沙星给药大鼠肠道菌群上的群落结构和α多样性，4A为门水平上细菌的前十五名相对丰度，4B为使用多样性指数盒状图比较不同组之间的肠道菌群的α多样性，横坐标表示组，纵坐标表示索引值。
图5为本发明中对照组和莫西沙星处理组样品之间的肠道菌群差异图，5A为差异肠道菌群的进化分支图；5B为差异肠道菌群的直方图，从上到下的四种条形分别代表对照组，中剂量组，低剂量组和高剂量组中的肠道菌群差异。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
从肠—肝轴的角度研究宿主代谢特征与莫西沙星诱导的肝损伤中肠道菌群变化之间的代谢关系具有重要意义。莫西沙星作为广谱抗菌药物会影响肠道菌群的生长和种类。截止目前，尚未从肠—肝轴角度进行莫西沙星诱导的药物性肝损伤相关内源性代谢物肠道菌群代谢途径的相关研究。本发明对大鼠灌胃给予莫西沙星，探讨影响肠—肝轴功能以形成肝毒性的代谢紊乱和肠道菌群改变。
本发明提供莫西沙星相关肝损伤的生物标志物，所述生物标志物包括L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、左旋多巴和L-异亮氨酸。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述生物标志物还包括丙酮酸、草酰乙酸、琥珀酸、3-甲基-2-酮丁酸、柠檬酸、乙酰乙酸、S-乳酸、3-氧代丙酸、琥珀酸半醛、R-乳酸、异柠檬酸和β-羟丁酸。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述生物标志物包括肌苷酸、D-甘露糖、二羟基丙酮、β-D-葡萄糖和α-D-葡萄糖。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述生物标志物包括花生四烯酸、棕榈酸、D-甘油、甘油磷酰乙醇胺、亚油酸、甘油三酯18:0、甘油三酯18:1、磷脂酰胆碱18:0、磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰胆碱20:3和鞘氨酸。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述生物标志物还包括L-肾上腺素、吲哚-3-乙酸、酪胺、乙醛和甲基乙二醛。
本发明还提供包含能够检测所述的生物标志物的试剂的试剂盒。
本发明还提供所述的生物标志物在代谢组学、代谢通路和肠道菌群变化的研究中或制备肝损伤诊断试剂盒或诊断设备研发中的应用。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
申请人认为，从肠—肝轴的角度研究宿主代谢特征与莫西沙星诱导的肝损伤中肠道菌群变化之间的代谢关系具有重要意义。莫西沙星作为广谱抗菌药物会影响肠道菌群的生长和种类。截止目前，尚未从肠—肝轴角度进行莫西沙星诱导的药物性肝损伤相关内源性代谢物肠道菌群代谢途径的相关研究。本发明对大鼠灌胃给予莫西沙星，探讨影响肠—肝轴功能以形成肝毒性的代谢紊乱和肠道菌群改变。
1材料与方法
1.1化学品
LC-MS级乙腈(ACN)，甲醇(MeOH)，异丙醇(IPA)和分析级甲基叔丁基醚(MTBE)购自Fisher Scientific Co.，Ltd(Fair Lawn，NJ，USA)；甲酸(FA)和乙酸铵(NH4OAc)购自默克公司(Darmstadt,Germany)；超纯水购自娃哈哈公司(中国杭州)；盐酸莫西沙星片由BayerPharma AG(德国)生产。
1.2动物研究和样品收集
雄性Sprague–Dawley大鼠(n＝102，6-8周龄)购自北京维通利华动物技术有限公司(中国)。实验内容由首都医科大学附属北京朝阳医院动物伦理委员会批准执行。动物饲养条件：温度为24±2℃，相对湿度为50±5％，昼夜循环12小时交替，水和食物可随意摄取。在动物适应实验室条件一周后，将大鼠随机分为四个实验组，每组24只。使用蒸馏水将盐酸莫西沙星片制成混悬液，根据常用的临床剂量，每天通过灌胃法向大鼠服用莫西沙星悬浮液(0、36、72、108mg/kg体重)，分别在第3、7、14、21天处死四个不同剂量组的大鼠。根据给药的时间和剂量，将动物进行分组(L：低剂量，M：中剂量，H：高剂量，Q：给药前)，在上述时间点进行腹主动脉取血。在4℃以5000×g离心5分钟收集血清，并立即用于生化分析。将粪便样品从结肠中小心取出，并收集在预冷(干冰)的容器中，立即在液氮中速冻。将用于16S rRNA基因测序的代谢组学血清和结肠内容物储存在-80℃的冰箱中。将肝脏组织固定在4％多聚甲醛中以进行病理检查。修剪固定的大鼠肝脏样品，将其包埋在石蜡中，切片，然后用苏木精和伊红(H&E)染色以进行组织病理学检查。
1.3生化分析
进行丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)，总胆红素(TBIL)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)的血清生化分析，由北京德易生物技术有限公司(中国)的临床生化分析仪(AU480，日本奥林巴斯)完成。使用可见光分光光度计(南京建成生物工程研究所，中国)测试肝脏氧化应激生物标志物。
1.4血清样本制备
向每份50μL血清的等分试样中，添加750μL的MeOH和750μL的MTBE以沉淀蛋白并提取代谢物。将该混合物涡旋5分钟，以15000rpm(4℃，10分钟)离心。转移上清液，并加入600μL H2O和750μL MTBE。通过涡旋分离上部有机部分和下部含水部分，并以15000rpm(4℃，10min)离心。极性和非极性代谢物均来自水相和有机相。转移上清液并蒸发至干。将极性和非极性残留物分别重新溶解于50μL ACN/H2O(2:98，v/v)和50μL的MeOH/CHCl3(1：1，v/v)中，涡旋震荡5分钟，然后以15000rpm(4℃，10分钟)离心。收集上清液用于进一步分析。
1.5血清代谢组学的LC-HRMS分析
通过Dionex UltiMate 3000HPLC系统(Dionex,Olten,Switzerland)与Q-Orbitrap质谱仪(Q Exactive；Thermo Fisher Scientific，Waltham,MA)联用，进行非靶向代谢组学分析。使用反相Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1×100mm×1.7μm；MA，Milford)，色谱柱温度30℃。用于极性代谢物检测的流动相由A相：含0.1％FA的纯净水和B相：ACN组成。用于非极性代谢物检测的流动相由A相：含0.1％FA和2mmol NH4OAc的纯净水中和B相：含0.1％FA和2mmol NH4OAc的ACN/IPA(1：1，v/v)组成。流速为0.25mL/min。正和负电喷雾电离(ESI)模式均使用5μL的进样量。自动进样器设置为4℃。梯度条件如下：0-3分钟，线性梯度为2-20％B；3-10分钟，线性梯度为60％B；10-15分钟，60-100％B；15-20分钟，100％B。进样前，使色谱柱平衡8分钟。
MS的操作参数如下：鞘气流速为40psi；辅助气体流量，11Arb；扫气流量，0；喷涂电压3.5kV；毛细管温度：350℃；s-lens RF为55；辅助气体加热器温度220℃。高纯度氮气(N2)被用作雾化气体和碰撞气体，以实现更高的能量碰撞解离。全扫描的分辨率设置为70,000，扫描范围为m/z 66.6-1000.0Da。方法之在MS全扫描后进行MS/MS(dd-MS2)。MS/MS的条件如下：分辨率17,500；自动增益控制(AGC)目标1e6；最大注入时间(MIT)，100毫秒；隔离窗口，3m/z。碰撞能量(CE)设置为15eV，30eV和45eV。dd-MS2扫描的扫描范围是m/z 66.6-1000.0Da。
1.6血清代谢组学的数据处理和统计分析
使用Mass Matrix MS数据文件转换软件(http://www.massmatrix.net)将LC-HRMS原始数据转换为m/z格式。使用开源软件XCMS进行峰识别、过滤、对齐和标化，获得包含质荷比(m/z)，保留时间和峰面积的二维数据矩阵。对于极性提取物，在MetaboAnalyst网站(www.metaboanalyst.ca)上对标准化数据进行了Mummichog的非靶向代谢物标记和代谢途径分析。使用MATLAB进一步分析了由p<0.05的代谢途径聚集所产生的代谢网络中直接相关代谢物的比例。对于非极性提取物，将质谱数据导入SIMCA-P中以进行OPLS-DA分析和组间差异代谢物筛选(VIP>1.5，p值<0.05，并删除Jack-Knifed超过零的值)。通过Lipidmaps数据库(https://www.lipidmaps.org/)对筛选后获得的代谢物进行鉴定。
1.7 16S rRNA基因测序与分析
使用QIAamp 96PowerFecal QIAcube HT试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从结肠内容物中提取基因组DNA。所有操作均在无菌条件下进行。使用NanoDrop分光光度计(ThermoScientific NanoDrop)检查DNA浓度，并使用1％琼脂糖凝胶测试DNA质量。使用12.5μLKAPA HiFi HotStart Ready Mix(Anachem，Dublin，Ireland)，1μL模板DNA(10-50ng/μL)扩增16S rRNA基因高变V3-V4区，0.25μL，每种引物25μM进行PCR使用25个PCR反应体积的引物Bakt_343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3',SEQ ID NO:1)和Bakt_798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3',SEQ ID NO:2)使用25个循环扩增。第一个PCR程序包括在95℃下3分钟，在95℃下30s，在55℃下30s，在72℃下30s的25个循环30s，然后在72℃下5min。在第二次PCR中，仅在第一个PCR条件下，仅8个循环即可将测序引物和衔接子连接至扩增子文库。使用凝胶电泳评估PCR产物的大小。使用Agencourt AMPure XP Beads(Beckman Coulter Genomics，MA，USA)纯化扩增子产物，并使用Quantity One软件(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)通过光密度法定量，然后以等摩尔浓度合并。通过使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行凝胶提取来纯化DNA文库。DNA库的浓度和长度分布通过Qubit荧光计(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和Qseq100(BiOptic Inc.，中国台湾)进行了检查。如前所述，使用Miseq PE300平台对细菌16S rRNA基因的V4区进行测序。上述实验操作由上海OE生物技术有限公司(中国)执行。
原始测序数据为FASTQ格式，使用Trimmomatic软件对成对末端的读段进行预处理，以检测并切断不明确的碱基(N)。使用滑动窗口修整方法剪切了平均质量得分低于20的低质量序列。使用FLASH软件组装成对的末端读数。组装参数为：最小重叠的10bp，最大重叠的200bp和最大不匹配率的20％。对序列进行去噪：放弃具有歧义，同源序列或低于200bp的读数。保留具有高于Q20的75％碱基的读数。检测并去除了嵌合体读物。这两个步骤是使用QIIME软件(版本1.8.0)实现的。使用具有97％相似性截止值的Vsearch软件，对纯净读段进行引物序列去除和聚类，以生成可操作的分类单位(OTU)。使用QIIME软件包选择每个OTU的代表性读物。使用RDP分类器对所有代表性读物进行注释并针对Silva数据库版本132(或Greengens)(16S rDNA)进行分析(置信度为70％)，使用RDP分类器对所有代表性读物进行注释并针对Silva数据库版本132(18S rDNA)进行分析(置信度为70％)。
2.结果
2.1盐酸莫西沙星片导致的肝损伤
图1显示了莫西沙星引起的转氨酶的变化和肝损伤的组织病理学，除了MDA和SOD以外，其他生化指标也有不同程度的明显变化。与同期对照组相比，在第3、7、14、21天，不同剂量的AST和ALT水平明显升高。与对照组相比，TBIL水平随着时间延长呈现出明显的增加趋势，而ALP水平在14天后发生了显着变化。同时，肝组织切片的病理结果显示，高剂量组第7天出现病理改变。在莫西沙星处理的大鼠中，肝细胞的脂肪变性明显，产生脂肪泡。这些结果表明，大鼠灌胃服用莫西沙星后产生病理性肝损伤，并且在7天后发生了显着变化。
2.2代谢组学表型和代谢通路
为了筛选特有的代谢物，比较了肝损伤最明显(第7天)时对照组和莫西沙星处理组的代谢情况。从极性代谢物数据中揭示了31种特有的生物标记物(p<0.05)和7个相关的代谢途径。使用基于SMICA-P的分析与Lipidmaps数据库相结合，从与莫西沙星诱导的肝损伤相关的非极性提取物中发现了9种差异脂质代谢产物(p<0.05)(图2A)。
如图2B所示，参与能量代谢的三个重要途径包括糖酵解或糖异生，三羧酸循环(TCA循环)和丙酮酸代谢。此外，丁酸代谢和其他三个氨基酸相关途径(酪氨酸代谢，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的降解以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成)也被标记出来。图3显示了从代谢组学数据得出的上述40种代谢物分别在第3天，第7天，第14天和第21天的变化。与对照组相比，发现10个显著增加的代谢物，22个显著降低的代谢物(p<0.05)。此外，2个代谢物先升后降，而4个代谢物的含量先降后升。将给药组的每个代谢物值与同时间点对照组进行比较计算其相对(倍数变化)值。观察到氨基酸，有机酸，碳水化合物，复杂脂质，脂肪酸及激素，生物碱，生物胺以及其他物质的变化。在所有时间点，氨基酸中的L-缬氨酸和3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(左旋多巴)值均明显降低。除了参与TCA循环的若干代谢物外，3-甲基-2-酮丁酸的丰度随着时间延长逐渐增加，并且在给药的第7天，β-羟丁酸的含量急剧增加。碳水化合物和相关物质，包括肌苷酸(IMP)，D-甘露糖，甘油和葡萄糖，在几乎每个时间点都不同程度地下降。在复杂的脂质和脂肪酸中，花生四烯酸，棕榈酸和亚油酸在不同时间分别达到2倍变化。甘油磷酰乙醇胺的相对丰度比对照低9倍，在上述四个时间点之间变化很大。乙醛和甲基乙二醛也逐渐升高。
2.3肠道菌群的变化
图4显示了门菌落水平上肠道菌群的结构和组成(排名前15个)。在门水平上，相对丰度最高的前四个细菌是拟杆菌门，厚壁菌门，变形杆菌和放线菌门，如α多样性所示。样本内多样性，通常使用单个种群内观察到的细菌分类单元的数量(丰富度)和分布(均匀度)进行分析。莫西沙星给药组的多样性指数显着低于对照组，这表明口服莫西沙星后大鼠肠道菌群的物种丰富度下降。β多样性是指样本之间的多样性，它测量样本对之间的距离。进行了基于操作分类单位(OTU)信息的非度量多维标度(NMDS)分析，以证明每组的生物重复性(press＝0.094)。在给药的第7天和第14天，每个剂量组的一致性良好，并标明了不同组之间的差异。结果表明，同一组中的样本是聚集的，而不同组中的样本则有明显的区别。LefSe分析(线性判别分析与效应量测量结合)用于鉴定不同组之间差异表达的菌株。标记了不同菌株的分支进化图和不同菌株相对丰度的原始数据直方图，如图5(A与B)所示，共获得了十个在不同分类学水平(LDA得分>4)的差异表达菌株。合并并保留最低分类标准的重复结果后，仅保留了两个不同的菌株，分别属于Firmicutes和Bacteroidetes。它们是Firmicutes-Clostridia-Clostridiales-Lachnospiraceae，Bacteroidetes-Bacteroidia-Bacteroidales-Muribaculaceae-Muribaculum和Bacteroidetes-Bacteroidia-Bacteroidales-Prevotellaceae-Prevotella_9。与对照组相比，Lachnospiraceae明显减少，而Muribaculaceae明显增加。
3.讨论
肠—肝轴是药物性肝损伤的研究热点。本发明成功建立了莫西沙星诱导的药物性肝损伤大鼠模型，应用LC-HRMS与包括Mummichog和OPLS-DA分析在内的多元数据分析方法相结合进行了代谢网络分析。极性和非极性提取物数据共揭示了40个特有生物标记物(p<0.05)和七个相关的代谢途径。莫西沙星给药组的血清中柠檬酸循环和氧化磷酸化中间体包括柠檬酸，草酰乙酸，琥珀酸和异柠檬酸的水平发生了异常变化。草酰乙酸是关键的限速底物，影响TCA循环的速度。以往研究表明，草酰乙酸添加到神经元SHSY5Y细胞后，ATP的产生和呼吸通量得到增强，另一项相关研究报道草酰乙酸可促进脑线粒体的生物变化。此外，通过抗结核药物的肝毒性研究中发现，试验组中异柠檬酸。显着降低，网络分析表明，异柠檬酸与脂质过氧化相关的化合物有关。随着莫西沙星给药时间的延长，草酰乙酸和异柠檬酸逐渐降低，表明肝线粒体和三磷酸腺苷(ATP)的功能可能受到损害。β-羟丁酸作为酮体之一，在此过程中急剧上升，这也得到了验证。葡萄糖通常通过氧化磷酸化被完全氧化为水和二氧化碳。在异常情况下，葡萄糖会降解为丙酮酸，并在此过程中产生有限量的ATP。糖酵解与氧化磷酸化之间存在动态平衡，如果线粒体受损，细胞将加强糖酵解以产生ATP。糖酵解产生高反应性有毒副产物甲基乙二醛。在正常的生理条件下，只有少量的葡萄糖可以转化为甲基乙二醛。现有研究表明其参与胰岛素抵抗和β细胞功能障碍，在糖化和高血糖之间形成恶性循环。在当前的研究中，糖酵解或糖异生和丙酮酸代谢通路在实验组中被映射到，以及酮体和甲基乙二醛异常升高，这证实了氧化磷酸化和糖酵解障碍似乎是莫西沙星引起的肝损伤的特征。
除了上述观察到的氧化磷酸化和糖酵解的异常变化外，一些脂质内源性化合物(包括花生四烯酸，亚油酸和棕榈酸)也值得关注。花生四烯酸是一种多不饱和脂肪酸，由亚油酸合成。它可以直接或在转化为类花生酸(包括前列腺素，血栓烷和白三烯)后介导炎症。通常，衍生自花生四烯酸的二十烷类具有促炎作用。莫西沙星处理的大鼠中花生四烯酸浓度的显着上调产生促炎反应，这可能与莫西沙星的肝毒性有关。亚油酸是花生四烯酸的底物，据报道亚油酸的增加是肝脂质代谢紊乱的原因之一。棕榈酸是动物脂肪中天然存在的主要饱和脂肪酸，在许多以细胞功能失调或细胞死亡为特征的细胞模型中已有广泛报道。在棕榈酸的存在下，肝细胞线粒体膜电位被破坏，引起内质网应激和肝细胞凋亡。综上所述，在本发明中，我们观察到与能量代谢有关的代谢产物明显紊乱。能量代谢的调节变化被认为是莫西沙星处理组肝细胞脂肪变性病理变化的关键。同时，氧化磷酸化，糖酵解和肝脂质代谢紊乱应该是莫西沙星毒性作用的表现。
根据综合代谢分析，给予莫西沙星后，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成和降解受到严重影响。肝脏富含参与氨基酸代谢的酶。异亮氨酸和缬氨酸是具有脂肪族侧链的标准氨基酸，因此它们被称为支链氨基酸(BCAA)。研究显示，莫西沙星给药后血清中的缬氨酸浓度显着降低，异亮氨酸上调。这些发现表明，莫西沙星给药后可能会阻止循环BCAA的利用。以往研究表明，临床应用BCAA治疗肝病患者具有决定性作用，而BCAA的水平可作为肝功能障碍的诊断方法。左旋多巴表现出最显着的变化，减少了9倍。左旋多巴是人体内去甲肾上腺素和多巴胺的前体，是帕金森氏病对症治疗不可替代的特异性。左旋多巴与肝毒性之间尚无报道。它是否可以用作莫西沙星诱发的肝损伤的潜在生物标记物，还需要进一步验证。
进行16S rRNA基因测序以分析莫西沙星给药前后大鼠肠道菌群的组成。结果证实，肠道微生物群的组成受到莫西沙星的显著影响。在本发明中，Muribaculaceae显着增加，Lachnospiraceae显着降低。Muribaculaceae与内粘液层(IML)屏障功能保持正相关，而IML是保护结肠上皮不受肠腔内威胁和炎症因子影响的关键屏障。另一项研究表明，Muribaculaceae增加了对脂肪的抵抗力。因此，Muribaculaceae可能与肠道粘膜的免疫功能以及脂肪的吸收和利用有关。但是，目前关于Muribaculaceae与肝脏疾病之间的关联分析甚少。Lachnospiraceae是一种Firmicutes，与短链脂肪酸(SCFA)的生成相关。细菌多样性的减少，尤其是那些参与生产保护性SCFA的细菌的多样性的减少，表明该过程可能与药物性肝损伤的发展有关。肠道屏障的维持与SCFA的产生有关，包括丁酸。丁酸还可以减轻炎症和肝线粒体氧化应激的机理，影响药物性肝损伤的发生和发展。本发明结果与以往研究一致，丁酸代谢在代谢组学分析中被映射在破坏的途径中。因此，我们推测莫西沙星通过降低Lachnospiraceae的丰度来降低SCFAs的生成，包括丁酸，导致肠粘膜机械屏障和免疫屏障受损。大量有害物质(包括内毒素的代表脂多糖(LPS)和促炎因子)可能会释放到血液中，并由于肠道通透性增加而对肝脏产生毒性作用。
4.结论
本发明首次报道了莫西沙星诱导肝毒性的代谢变化和微生物组成差异。我们提出了一个研究思路，将代谢组学与肠-肝轴上的肠道菌群相关联以研究莫西沙星诱发的肝损伤，丁酸缺乏引起的与能量相关的代谢紊乱和肠道微生态失调造成肝损害。本发明研究结果有助于阐明莫西沙星引起的肝毒性的发病机制，提高我们对于药物性肝损伤的认识。
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<120> 莫西沙星相关肝损伤的生物标志物、试剂盒及应用
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Claims (5)

1.莫西沙星相关肝损伤的生物标志物在制备莫西沙星诱导的肝损伤诊断试剂盒或诊断设备中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括L-酪氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、左旋多巴和L-异亮氨酸。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括丙酮酸、草酰乙酸、琥珀酸、3-甲基-2-酮丁酸、柠檬酸、乙酰乙酸、S-乳酸、3-氧代丙酸、琥珀酸半醛、R-乳酸、异柠檬酸和β-羟丁酸。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物包括肌苷酸、D-甘露糖、二羟基丙酮、β-D-葡萄糖和α-D-葡萄糖。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物包括花生四烯酸、棕榈酸、D-甘油、甘油磷酰乙醇胺、亚油酸、甘油三酯18:0、甘油三酯18:1、磷脂酰胆碱18:0、磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:1、溶血磷脂酰胆碱18:2、溶血磷脂酰胆碱20:3和鞘氨酸。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标志物还包括L-肾上腺素、吲哚-3-乙酸、酪胺、乙醛和甲基乙二醛。
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