CN112083111A - 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用 - Google Patents

一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112083111A
CN112083111A CN201910505661.2A CN201910505661A CN112083111A CN 112083111 A CN112083111 A CN 112083111A CN 201910505661 A CN201910505661 A CN 201910505661A CN 112083111 A CN112083111 A CN 112083111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cirrhosis
screening
induced liver
analysis
metabolites
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910505661.2A
Other languages
English (en)
Inventor
王伽伯
牛明
卫璐戈
刘晓熠
肖小河
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Original Assignee
Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fifth Medical Center of PLA General Hospital filed Critical Fifth Medical Center of PLA General Hospital
Priority to CN201910505661.2A priority Critical patent/CN112083111A/zh
Publication of CN112083111A publication Critical patent/CN112083111A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/062—Preparation extracting sample from raw material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用。通过对所发现的5个代谢物进行两两组合构建峰面积比值或者代谢物峰面积绝对定量即可用于区分慢性DILI肝硬化组与未肝硬化的慢性DILI组。目前肝脏穿刺病理检查是肝硬化诊断的金标准，但是肝脏穿刺病理检查与患者依从性及患者禁忌症有关，有时难以实施；并且由于是有创检查，难以作为LC‑DILI的动态监测及早期诊断方法。本发明所提供非侵入性诊断标志物及其应用可替代目前常见的有创的肝脏穿刺病理检查，具有更稳健的临床应用价值。

Description

一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其 应用
技术领域
本发明涉及代谢组学技术，尤指一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用。
背景技术
肝硬化是药物性肝损伤从肝脏急性炎症反应和损伤阶段进入慢性化并最终发展到终末期阶段的表现之一。而由于肝脏具有较强的功能代偿能力，处在代偿期的慢性DILI肝硬化患者(LC-DILI)往往与未肝硬化的慢性DILI患者(CH-DILI)具有类似的临床特征，个别生化指标差异对于区分两种疾病阶段常不具有临床意义，结果可能导致早期代偿期肝硬化进展为失代偿期肝硬化，临床预后很差。肝脏穿刺病理检查是肝硬化诊断的金标准，但是肝脏穿刺病理检查与患者依从性及患者禁忌症有关，有时难以实施；并且由于是有创检查，难以作为LC-DILI的动态监测及早期诊断方法。因此，亟需一种无创、准确的方法筛查慢性DILI可能出现肝硬化的患者。
代谢组学能够反映机体对病理、生理及基因改变引起的代谢变化，在疾病诊断、病理学、药物安全性评价等临床研究方面显示出明显的优势。患者的一份血清样本在检测转氨酶等生化指标的同时，还可以用来检测代谢组学生物标志物用于早期发现和辅助诊断LC-DILI和动态检测DILI进展具有重要临床价值。
在临床上应用生物标志物区分诊断疾病时如采用绝对定量，需要高度纯化的代谢物作为对照品，获得难度和成本较高；此外生物标志物绝对定量的实验结果往往受仪器和操作等因素影响，对不同实验室检测结果的重现性要求较高。
发明内容
针对现有肝硬化诊断方法的有创伤性、侵入性等缺点，本发明提供了一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用，采用两个代谢物的峰面积比值进行相对定量，以期提高候选生物标志物的可应用性和稳健性，为慢性药物性相关肝硬化早期诊断提供依据，与何种药物导致的早期慢性药物性肝损伤相关肝硬化无关。
本发明所采用的方法具有灵敏度高、特异性好、无创且能动态监测等优点。本发明采用HPLC-MS连用的分析方法，对血清仅需简单处理，适大规模筛查，具有非常好的应用前景。在检测转氨酶等生化指标的同时，使用少量血清样本即可以用来检测代谢组学生物标志物，且采用两个代谢物的峰面积比值进行相对定量，比两个代谢物单独应用的效果更好，同时还可以更好地克服因仪器和操作不稳定等实验因素造成的系统误差，具有更稳健的临床应用价值。
因此，本发明提供了一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用，包括磷脂酰胆碱phosphatidylcholine(PC)、肌酸creatine、牛磺鹅去氧胆酸taurochenodeoxycholic acid(TCDCA)、牛磺胆酸taurocholic acid(TCA)或溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))中的一种或多种。可选的，所述诊断标志物为磷脂酰胆碱phosphatidylcholine(PC)、肌酸creatine、牛磺鹅去氧胆酸taurochenodeoxycholic acid(TCDCA)、牛磺胆酸taurocholic acid(TCA)或溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))中的一种或多种。
另一方面，本发明提供了一种以上诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用。
在本发明提供的以上诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用，血清样本在检测转氨酶等生化指标以外，还可以通过所述试剂盒或设备用来诊断早期慢性药物性肝损伤相关肝硬化。
在本发明提供的以上诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用，通过本发明提供的诊断标志物的绝对定量或者本发明提供的诊断标志物中任意两种诊断标志物的相对定量。
在本发明提供的以上诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用，本发明提供的诊断标志物的绝对定量或者任意两种诊断标志物的相对定量的诊断方法，可以与超声检查、肝脏穿刺病理检查等现有的肝病检验手段相结合，以提高诊断的正确率。
以上诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用，可以避免或减少在临床上应用生物标志物诊断疾病时采用绝对定量，需要高度纯化的代谢物作为对照品，获得难度和成本较高以及绝对定量的实验结果容易受到干扰等问题。
另一方面，本发明提供了一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法，包括以下步骤，
1)样品的收集与处理：收集代偿期肝硬化慢性药物性肝损伤病人和未肝硬化的慢性药物性肝损伤病人的血清样本，去除大分子；
步骤1)中所述去除大分子为：将血清加入甲醇稀释，涡旋混匀，离心后取上清液过微孔滤膜；所述甲醇的加入量为血清体积的3倍，所述离心为在4℃下12000r·min-1，离心10min，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。
2)液相色谱质谱分析测定：将步骤1)处理后的样本经过液相色谱质谱分析，获得的差异代谢物经过处理得到各个峰的参数数据；
3)特征代谢谱的构建：上述数据采用SIMCA-P 13.0软件进行主成分分析(PCA)和正交校正偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，结合VIP和|p(corr)|筛选，将具有显著性差异的代谢物在总离子流图中标注，得到代谢组特征谱；
4)代谢组学生物标志物通路富集分析：将正负离子筛选出的具有显著性差异的代谢物在Human Metabolome Database和Mass Hunter PCDL Manager(MHPM)生物学数据库进行比对筛查和代谢通路富集分析，找到差异代谢物。
5)差异代谢生物标志物筛查及ROC曲线分析：将步骤4)得到的差异代谢物进行ROC曲线分析，AUC大于0.6的差异代谢物的峰面积做比值相对定量进行ROC曲线分析，选取差异代谢物的峰面积比值AUC大于0.6的差异代谢物，即为慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物。
在本发明提供的慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法中，步骤2)中所述液相色谱质谱分析的条件为：
在筛选中的仪器分析平台为LC-Q-TOF/MS(1290infinity HPLC，6550ifunnel Q-TOF/MS)分离色谱柱为ZORBAX SB 300 C18(100mm×2.1，1.8μm)。进样顺序完全随机化，以排除进样顺序带来的偏差。
色谱分离条件为：柱温：35℃；流速：0.3mL/min；流动相组成：A：水，B：乙腈；梯度洗脱：5.00％B at 0-1min；40％B at 1-9min；90％B at 9-19min；100％B at 19-25min；其中B的百分含量为体积百分含量；进样量：4μl；整个检测过程中，保持进样器温度为4℃。
质谱条件：采用电喷雾离子源的负离子模式ESI-，毛细管电压为-3000V，喷嘴电压为-500V，喷嘴压力设置为45psig，干燥气温度为225℃，流速为11L/min。质荷比采集范围为80-1200Da。采集期间持续性的注入校正离子以获取高精度的信号。实验中所用试剂均为色谱纯，实验用水为去离子水，校正离子为三氟乙胺TFANH4、嘌呤Purine。
在本发明提供的慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法中，步骤3)中数据在进行主成分分析(PCA)之前，均由安捷伦Masshunter Profinder软件进行预处理，并根据分子特征选取峰高超过300的化合物，以CSV格式导入MetaboAlalyst 3.0在线分析软件进行进一步数据过滤和归一化处理；再将归一化的得到的数据进行导入SIMCA-P 13.0软件进行主成分分析(PCA)和正交校正偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)；
在本发明提供的慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法中，步骤3)中选出具有显著性差异的代谢物具体为选出P≤0.05且fold change＞1.5的代谢物；所述VIP取值大于1，所述|p(corr)|取值大于0.5。
在本发明提供的慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法中，步骤4)中所述比对筛查的质量误差为15ppm，所述代谢通路富集分析为将比对筛查后的差异代谢物通过Metaboanalyst进行通路富集；再根据皮尔森公式计算相关系数值大于0.6，筛选出高度相关的差异代谢物。
本发明的提供了一种新的慢性药物性肝损伤相关肝硬化的诊断标志物。无需肝脏穿刺病理检查，使用患者血清样本在检测转氨酶等生化指标的同时，取少量血清样本即可以用来检测代谢组学生物标志物，对于早期发现和辅助诊断LC-DILI和动态检测DILI进展具有重要临床价值。
本发明所提供的方法具有无创、快捷并且可以动态监测疾病进展的特点，为早期诊断慢性药物性肝硬化提供了辅助鉴别诊断方法。
采用两个代谢物的峰面积比值进行相对定量，以期提高候选生物标志物的可应用性和稳健性，比两个代谢物单独应用的效果更好，同时还可以更好地克服因仪器和操作不稳定等实验因素造成的系统误差，具有更稳健的临床应用价值。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组正离子模式下PCA得分图，其中CH-DILI为慢性药肝，LC-DILI为药物性肝硬化组，QC为质量控制组。
图2为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组负离子模式下PCA得分图，其中CH-DILI为慢性药肝，LC-DILI为药物性肝硬化组，QC为质量控制组。
图3为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组正离子模式下OPLS-DA得分图，其中CH-DILI为慢性药肝，LC-DILI为药物性肝硬化组。
图4为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组负离子模式下OPLS-DA得分图，其中CH-DILI为慢性药肝，LC-DILI为药物性肝硬化组。
图5为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组负离子模式下代谢特征谱，其中CH-DILI为慢性药肝，LC-DILI为药物性肝硬化组。
图6为慢性药肝、慢性药物性肝硬化组通路富集气泡图，通路a为戊糖和葡萄糖醛酸相互转化，通路b为初级胆汁酸代谢，通路c为脂质代谢，通路d为卟啉代谢，通路e为精氨酸和脯氨酸代谢，通路f为色氨酸代谢。
图7为相关系数代谢通路网络图，其中Pentose and glucuronateinterconversions：糖和葡萄糖醛酸相互转化；Primary bile acid biosynthesis：初级胆汁酸代谢；Glycerophospholipid metabolism：脂质代谢；Porphyrin metabolism：卟啉代谢；Arginine and proline metabolism：精氨酸和脯氨酸代谢。
图8为代谢通路中的候选生物标志物进行热图分析。磷脂酰胆碱phosphatidylcholine(PC)、肌酸creatine、牛磺鹅去氧胆酸taurochenodeoxycholic acid(TCDCA)、牛磺胆酸taurocholic acid(TCA)、溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))、卟啉IXprotoporphyrin IX、甘氨胆酸glycocholic acid(GCA)、果胶酸pectic acid、吲哚乙醛indoleacetaldehyde、3-脱氢-L-古洛糖酸3-Dehydro-L-gulonate、鹅去氧胆酸甘氨酸共轭物chenodeoxycholic acid glycine conjugate、葡萄糖醛酸D-Glucuronic acid。
图9为ROC值大于0.6生物标志物。
图10为ROC值大于0.6生物标志物的峰面积比值AUC值。
图11为卵磷脂与溶血卵磷脂峰面积比值AUC值。
图12、图13测试组生物标志物AUC值。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
具体实施方式中实施例和应用例的血清样本的来源：检索中国人民解放军第302医院2015年10月—2017年5月非感染科药物性肝损伤病例数据库，采用中华医学会肝病学分会药物性肝病学组发布的《药物性肝损伤诊治指南》和中华中医药学会《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》对病例进行评价入组，其中纳入肝硬化患者为肝脏穿刺病理检查确诊。将存放于-80℃冰箱中DILI血清样品分别进行下列操作，4℃复融，预冷的甲醇稀释，涡旋混匀，吸取上清液，过微孔滤膜，即为备用样品；质控样品(QC)是从每个待分析的样本取10μL混匀制备所得。使用的慢性药物性肝损伤(DILI)血清既包括了未硬化的慢性药物性肝损伤(CH-DILI)血清也包括代偿期的慢性药物性肝硬化(LC-DILI)血清。
实施例1
1)样本收集与处理：
将存放于-80℃冰箱中DILI血清样品，其中慢性药物性肝损伤组血清34份，慢性药物性肝硬化组血清15份，分组进行如下操作：4℃复融，精密吸取200μL置于EP管中，加入3倍量的预冷的甲醇稀释，涡旋混匀，在4℃下以12000r·min-1离心10min，用1mL注射剂吸取上清液，过0.22μm微孔滤膜。
2)相色谱质谱分析测定
将步骤1)所得滤液进行液相色谱质谱分析。
仪器与试剂如下：
仪器分析平台为LC-Q-TOF/MS(1290infinity HPLC，6550ifunnel Q-TOF/MS)分离色谱柱为ZORBAX SB 300 C18(100mm×2.1，1.8μm)。进样顺序完全随机化，以排除进样顺序带来的偏差。
色谱分离条件为：柱温：35℃；流速：0.3mL/min；流动相组成：A：水，B：乙腈；梯度洗脱：5.00％B at 0-1min；40％B at 1-9min；90％B at 9-19min；100％B at 19-25min；其中B的百分含量为体积百分含量；进样量：4μl；整个检测过程中，保持进样器温度为4℃。
质谱条件：采用电喷雾离子源的负离子模式ESI-，毛细管电压为-3000V，喷嘴电压为-500V，喷嘴压力设置为45psig，干燥气温度为225℃，流速为11L/min。质荷比采集范围为80-1200Da。采集期间持续性的注入校正离子以获取高精度的信号。实验中所用试剂均为色谱纯，实验用水为去离子水，校正离子为三氟乙胺TFANH4、嘌呤Purine。
3)数据处理统计学分析
将步骤2)中液相色谱质谱分析获得的所有数据均由安捷伦MasshunterProfinder软件进行预处理，并根据分子特征选取峰高超过300的化合物,以CSV格式导入MetaboAlalyst 3.0在线分析软件进行进一步数据过滤和归一化处理，将归一化得到数据导入SIMCA-P 13.0软件进行主成分分析(PCA)和正交校正偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。
特征代谢谱的构建：结合PCA分析(见图1、2)所示，在正、负离子共同模式下，QC样本聚集在得分矩阵投影图中间附近位置，显示样本分析过程稳定。另外，可观察到在正离子模式下，CH-DILI组和LC-DILI组能较好的区分，表明两组之间存在较明显的代谢水平差异。通过OPLS-DA模型的分析，寻找两组之间的差异性变量(见图3、4)，选出具有显著性差异的变量(代谢物)，筛选标准为P≤0.05且fold change＞1.5，结合VIP>1和|p(corr)|>0.5筛选，将具有显著性差异的代谢物在总离子流图中标注，得到代谢组特征谱(见图5)。
4)代谢组学生物标志物通路富集分析：将正负离子筛选出的具有显著性差异的代谢物在Human Metabolome Database和Mass Hunter PCDL Manager(MHPM)等生物学数据库进行比对筛查，质量误差限定为15ppm。将鉴定出的差异代谢物通过Metaboanalyst进行通路富集，通路富集结果见图6。为了探讨差异代谢物之间的潜在联系，根据皮尔森公式计算相关系数值大于0.6，筛选出高度相关的差异代谢物，通过Cytoscape软件构建了相关系数代谢通路网络图，即图7。综合来看，CH-DILI与LC-DILI的差异代谢物主要富集在初级胆汁酸代谢、脂质代谢等代谢通路上，其中，胆汁酸代谢、糖代谢和氨基酸代谢等在LC-DILI组表现为代谢上调。
5)差异代谢生物标志物筛查及ROC曲线分析：对代谢通路中的候选生物标志物(见图8)进行热图分析(ROC曲线分析)，发现部分差异代谢物能较好的区分CH-DILI和LC-DILI(见图9)，结果提示有一定的辅助诊断药物性肝硬化的功能，同时在某种程度上也可以解释慢性DILI机制差异。将这些差异代谢物进行ROC曲线分析，有5个差异代谢物的对于两组区分效果较好(AUC>0.6)，分别是磷脂酰胆碱phosphatidylcholine(PC)，肌酸creatine，牛磺鹅去氧胆酸taurochenodeoxycholic acid(TCDCA)，牛磺胆酸taurocholic acid(TCA)，溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))(见图9)；此外，结果可见磷脂代谢物的区分效果最好。为了进一步提高生物标志物临床区分诊断LC-DILI的适用性，避免不同实验室仪器差异及样本处理过程的操作误差，通过采用相对定量的方法(见图10),将差异代谢物的峰面积做比值进行相对定量，结果发现磷脂类代谢物峰面积比值的区分效果较好，即磷脂酰胆碱与其下游代谢产物溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))进行峰面积比值相对定量，相较于单独的磷脂酰胆碱和溶血卵磷脂，峰面积比值区分CH-DILI和LC-DILI效果更好，AUC为0.867(见图11)。
应用例1：血清前处理试剂盒
一、实验原理：
通过化学反应改变血清中磷脂酰胆碱、肌酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、溶血卵磷脂五种代谢物的存在形式，利用相应反应产物的极性变化，进而对目标物分离纯化，最后还原为原本的代谢物并用液相质谱检测。
二、慢性药物性肝损伤相关肝硬化诊断质谱前处理试剂盒组成：
试剂A氯仿：甲醇(体积比1:1)
试剂B柠檬酸缓冲液
三、试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
四、样本处理及要求
1.取100微升血样，加入300微升甲醇，涡旋60秒，低温离心机4℃，14000转离心20分钟。
2、取步骤1上清，加入600微升提取液(甲醇：氯仿：柠檬酸缓冲液＝2：2：0.8＝315：155：130微升)(在加入过程中会有机无机发生分层，建议分别加入)，涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡2h，静止10min。
2、室温下14000rpm离心10min，取上清。
3、再加500微升提取液于离心管(甲醇：氯仿：柠檬酸缓冲液＝2：2：0.8＝260：130：110微升)，涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡30min，静止10min。
4、室温下14000rpm离心10min，第3步上清合并第2步下层液体，用氮气吹干。
5、加入氯仿300微升和柠檬酸缓冲液300微升，振荡1min，14000rpm离心10min，取上清，真空干燥3小时，样品置于-20℃保存。
6、使用前用400微升75％甲醇溶解.
7、用液相质谱联用技术检测样品。
第一步，血清样本经液质联用血清代谢组学技术分析以及ProFinder提取后，获取磷脂酰胆碱、肌酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸和溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))标志物的提取离子流的峰面积平均值；(进行绝对定量或相对定量)
第二步，根据诊断标准判断峰面积是否符合慢性药物性肝损伤肝硬化的诊断标准，所述LC-DILI的诊断标准为：
按顺序首先对磷脂酰胆碱峰面积≤145333.6；肌酸峰面积≥7762.246；牛磺鹅去氧胆酸峰面积≥2432527；牛磺胆酸峰面积≥680408.7；溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))峰面积≥676236.5则能够判断患者是否为慢性药物性肝损伤肝硬化；或者
溶血卵磷脂lysoPC(18:1(9Z))与磷脂酰胆碱峰面积比值≥2.709133，则能够判断患者为慢性药物性肝损伤肝硬化。
五、需要而未提供的试剂和器材：
1.低温离心机
2.高精度加样器及枪头：20-200uL、200-1000uL
3.水浴锅
4.真空干燥机
5.涡旋仪
六、注意事项：
严格按照规定的时间和温度进行操作以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即4℃冷藏保存试剂。
应用例2
临床收集CH-DILI 27例，LC-DILI 15例作为验证试剂盒灵敏性及生物标志物稳定性的测试集，按照应用例1处理血清样本，结果见图12和图13，发现ROC曲线下的AUC值更高，区分CH-DILI与LC-DILI效果更好。
由以上内容可以得出，本专利申请所保护的慢性药物性肝损伤相关肝硬化诊断标志物筛选方法及诊断标志物的试剂盒其灵敏度和特异性均高于目前现有的检测技术。本发明提出以2种生物标志物组合的方法构建了慢性药物性肝损伤相关肝硬化的鉴别诊断模型，对临床鉴别药物性肝硬化有重要意义。
除此之外，为了加快效率，可以同时采集多人的血清样本进行编号，将多个样本一次性进行LC-MS检测、图谱处理，PLS-DA分析，标志物筛选，代谢物的挖掘鉴定。
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但发明的保护范围仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (9)

1.一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物，包括磷脂酰胆碱、肌酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺胆酸或溶血卵磷脂中的一种或多种。
2.一种权利要求1所述的诊断标志物在制备慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断、检测或预防试剂盒或设备中的应用。
3.一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物的筛选方法，其中，包括以下步骤，
1)样品的收集与处理：收集代偿期肝硬化慢性药物性肝损伤病人和未肝硬化的慢性药物性肝损伤病人的血清样本，去除大分子；
2)液相色谱质谱分析测定：将步骤1)处理后的样本经过液相色谱质谱分析，经过处理得到各个峰的参数数据；
3)特征代谢谱的构建：上述数据采用SIMCA-P13.0软件进行主成分分析和正交校正偏最小二乘法判别分析，结合VIP和|p(corr)|筛选，将具有显著性差异的代谢物在总离子流图中标注，得到代谢组特征谱；
4)代谢组学生物标志物通路富集分析：将正负离子筛选出的具有显著性差异的代谢物在Human Metabolome Database和Mass Hunter PCDL Manager生物学数据库进行比对筛查和代谢通路富集分析，找到差异生物标志物和差异代谢通路；
5)差异代谢生物标志物筛查及ROC曲线分析：将步骤4)得到的差异生物标志物进行ROC曲线分析，选取AUC大于0.6的差异代谢物，即为慢性药物性肝损伤相关肝硬化非入侵诊断标志物。
4.根据权利要求3所述诊断标志物的筛选方法，其中，
步骤1)中所述去除大分子为：将血清加入甲醇稀释，涡旋混匀，离心后取上清液过微孔滤膜。
5.根据权利要求4所述的诊断标志物的筛选方法，其中，所述甲醇的加入量为血清体积的3倍，所述离心为在4℃下12000r·min-1，离心10min，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。
6.根据权利要求4所述诊断标志物的筛选方法，其中，
步骤2)中所述液相色谱质谱分析的条件为：
仪器分析平台为LC-Q-TOF/MS(1290infinity UHPLC，6550ifunnel Q-TOF/MS)分离色谱柱为ZORBAX SB 300 C18(100mm×2.1，1.8μm)；进样顺序完全随机化，以排除进样顺序带来的偏差；
色谱分离条件为：柱温：35℃；流速：0.3mL/min；流动相组成：A：水，B：乙腈；梯度洗脱：5.00％B at0-1min；40％B at1-9min；90％B at9-19min；100％B at19-25min；其中B的百分含量为体积百分含量；进样量：4μl；整个检测过程中，保持进样器温度为4℃；
质谱条件：采用电喷雾离子源的负离子模式ESI-，毛细管电压为-3000V，喷嘴电压为-500V，喷嘴压力设置为45psig，干燥气温度为225℃，流速为11L/min；质荷比采集范围为80-1200Da；采集期间持续性的注入校正离子以获取高精度的信号；
过程中所用试剂均为色谱纯，用水为去离子水，校正离子为三氟乙胺TFANH4、嘌呤Purine。
7.根据权利要求4所述诊断标志物的筛选方法，其中，
步骤3)中数据在进行主成分分析之前，均由安捷伦Masshunter Profinder软件进行预处理，并根据分子特征选取峰高超过300的化合物，以CSV格式导入MetaboAlalyst 3.0在线分析软件进行进一步数据过滤和归一化处理；再将归一化的得到的数据进行导入SIMCA-P13.0软件进行主成分分析和正交校正偏最小二乘法判别分析。
8.根据权利要求4所述诊断标志物的筛选方法，其中，
步骤3)中具有显著性差异的代谢物为P≤0.05且fold change＞1.5的代谢物；所述VIP取值大于1，所述|p(corr)|取值大于0.5。
9.根据权利要求4所述的诊断标志物的筛选方法，其中，
步骤4)中所述比对筛查的质量误差为15ppm，所述代谢通路富集分析为将比对筛查后的差异生物标志物通过Metaboanalyst进行通路富集；再根据皮尔森公式计算相关系数值大于0.6，筛选出高度相关的差异代谢物。
CN201910505661.2A 2019-06-12 2019-06-12 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用 Pending CN112083111A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910505661.2A CN112083111A (zh) 2019-06-12 2019-06-12 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910505661.2A CN112083111A (zh) 2019-06-12 2019-06-12 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112083111A true CN112083111A (zh) 2020-12-15

Family

ID=73733325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910505661.2A Pending CN112083111A (zh) 2019-06-12 2019-06-12 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112083111A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782297A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 郭继生 一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用
CN113777199A (zh) * 2021-09-29 2021-12-10 复旦大学附属中山医院 粪便中胆汁酸代谢物在肝纤维化、肝硬化中的应用
CN114152688A (zh) * 2021-11-23 2022-03-08 华中农业大学 从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用
CN114527209A (zh) * 2022-01-28 2022-05-24 中国人民解放军总医院第五医学中心 用于肝硬化预后评估的标志物组合

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102119933A (zh) * 2011-03-03 2011-07-13 山东农业大学 牛磺鹅去氧胆酸防治肝损伤的用途
JP2012002610A (ja) * 2010-06-16 2012-01-05 National Institute Of Biomedical Innovation 肝障害検査用バイオマーカー及びそれを用いた肝障害の予測方法
WO2012143514A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune Method for the diagnosis of liver injury based on a metabolomic profile
CN108588210A (zh) * 2018-04-27 2018-09-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用
CN108990420A (zh) * 2016-05-29 2018-12-11 深圳市绘云生物科技有限公司 肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012002610A (ja) * 2010-06-16 2012-01-05 National Institute Of Biomedical Innovation 肝障害検査用バイオマーカー及びそれを用いた肝障害の予測方法
CN102119933A (zh) * 2011-03-03 2011-07-13 山东农业大学 牛磺鹅去氧胆酸防治肝损伤的用途
WO2012143514A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune Method for the diagnosis of liver injury based on a metabolomic profile
CN108990420A (zh) * 2016-05-29 2018-12-11 深圳市绘云生物科技有限公司 肝病相关生物标志物和使用方法及相关应用
CN108588210A (zh) * 2018-04-27 2018-09-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 包含生物小分子及基因的肝损伤生物标志物、方法及应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WENBO WANG ET AL: "Metabolomics-based evidence of the hypoglycemic effect of Ge-Gen-Jiao-Tai-Wan in type 2 diabetic rats via UHPLC-QTOFMS analysis", 《JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY》 *
ZHONGYANG XIE ET AL: "Metabolomics and Cytokine Analysis for Identification of Severe Drug-Induced Liver Injury", 《J. PROTEOME RES.》 *
唐进法等: "基于代谢组学的壮骨关节丸致特异质肝损伤相关易感生物标志物筛查", 《中华中医药杂志》 *
张磊 等: "HPLC/MS分析乙肝相关性肝细胞 分析乙肝相关性肝细胞癌的血清代谢轮廓分析", 《南方医科大学学报》 *
徐茜等: "肝炎及肝硬化患者血代谱及生物标记物相关性研究", 《检验医学与临床》 *
李小芬等: "基于超高效液相色谱质谱的药物性肝损害患者血清代谢组学研究", 《中国微生态学杂志》 *
王肖辉 等: "酒精性肝病合并药物性肝损伤的代谢组表征和生物标志物研究", 《中国科学：生命科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782297A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 郭继生 一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用
CN113777199A (zh) * 2021-09-29 2021-12-10 复旦大学附属中山医院 粪便中胆汁酸代谢物在肝纤维化、肝硬化中的应用
CN114152688A (zh) * 2021-11-23 2022-03-08 华中农业大学 从蜂花粉提取物中筛选出特征标志物的方法及特征标志物在鉴定蜂花粉中的应用
CN114527209A (zh) * 2022-01-28 2022-05-24 中国人民解放军总医院第五医学中心 用于肝硬化预后评估的标志物组合

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112083111A (zh) 一种慢性药物性肝损伤相关肝硬化非侵入性诊断标志物及其应用
CN111289736A (zh) 基于代谢组学的慢阻肺早期诊断标志物及其应用
US20050101023A1 (en) Methods for diagnosing urinary tract and prostatic disorders
CN108414660B (zh) 一组与肺癌早期诊断相关的血浆代谢小分子标志物的应用
CN106093227A (zh) 一种高通量检测生物体血液样本中113种脂质的液质联用方法
US7485852B2 (en) Mass analysis method and mass analysis apparatus
CN111562338B (zh) 透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用
CN112630311B (zh) 用于检测情感障碍的代谢标记物和试剂盒及使用方法
US10928363B2 (en) Method and device for chromatographic mass spectrometry
CN110057954B (zh) 血浆代谢标志物在诊断或监测hbv的应用
CN112305121B (zh) 代谢标志物在动脉粥样硬化性脑梗死中的应用
KR101946884B1 (ko) 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법
US20200173996A1 (en) Device for diagnosing colorectal cancer and method for providing colorectal cancer diagnosis information
KR20190045841A (ko) 소변 대사체 분석을 이용한 베체트병의 진단방법
CN112183616A (zh) 一种脑胶质瘤诊断的诊断标志物、试剂盒及筛选方法和脑胶质瘤诊断模型的构建方法
CN110308227B (zh) 一种基于睡眠障碍出现原发性骨质疏松症患者血浆代谢组学分析方法
WO2016049828A1 (zh) 肥胖人群特异性生物标志组合物及其用途
CN113552227A (zh) 一组用于诊断儿童哮喘病的联合标志物及其应用和检测试剂盒
CN109946467B (zh) 一种用于胸椎黄韧带骨化诊断的生物标记物
CN114137226B (zh) 脑梗塞早期诊断标志物、筛选方法及应用和脑梗塞早期诊断模型的构建方法及应用
CN114047263A (zh) 代谢标志物在制备用于诊断ais的检测试剂或检测物的用途及试剂盒
CN115684451A (zh) 基于代谢组学的食管鳞癌淋巴结转移诊断标志物及其应用
CN116087488A (zh) 糖尿病患者早期预测心血管疾病（cvd）的生物标志物及其用途
Veiga et al. Quantitative metabolomics in Alzheimer’s disease: Technical considerations for improved reproducibility
Julià et al. Metabolomics in rheumatic diseases

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201215