CN112782297A - 一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用，属于生物医学和分子生物学技术领域。本发明基于HBV肝硬化病理环境下，相关的代谢小分子发生数量变化，进而在血中蛋白分子(质谱分析中以PSMs肽段形式展现)上非特异结合的代谢小分子也发生数量变化，从而建立检测目标分子连接组(Connectomes)策略，通过精准的质谱分析，检测到目前技术条件下的可识别、最准确的分子质量，从而发现一系列HBV相关肝硬化的非创诊断指标，为HBV肝硬化的及时诊断奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和分子生物学技术领域，具体涉及一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
慢性HBV感染进展为肝硬化的5年累积发生率为8％-20％，有研究认为肝硬化发生与HBeAg持续阳性有关，同时没有灵敏性和特异性较好的分子诊断指标。《肝衰竭诊治指南》指出，考虑到一旦因肝硬化引起肝衰竭，治疗极其困难，病死率高，因此重视乙型肝炎重症化或肝硬化发生的及时诊断和预警已成为共识。乙型肝炎肝硬化的及时诊断及有效分子指标的确定具有非常重要的意义。
HBV相关的代偿期肝硬化进一步进展可导致失偿期肝硬化和原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，临床上应用甲胎蛋白alpha-fetoprotein(AFP)来诊断肝癌(hepatocellular carcinoma)，但这个诊断的灵敏性和特异性比较低，所以发现灵敏性和特异性好的肝硬化指标非常重要。
蛋白质组学分析是近年国际比较先进的前沿分子生物学技术，广泛用于疾病诊断中的蛋白及相关分析。而能把蛋白质组学很好应用在临床诊断上的实践不是很多，经常出现蛋白组学的样品处理和分析方法不能正确适应临床疾病诊断等问题。因此临床分析样品需要进行与临床疾病诊断目的相匹配的处理方法，以及正确的质谱分析方法，同时质谱分析后的结果进行专业生物信息学分析，最后进行分析结果验证。同时，选择的分析目标策略应尽可能接近临床疾病中的生理病理环境。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种肝硬化相关生物标志物及其筛选方法和应用。本发明基于HBV肝硬化病理环境下，相关的代谢小分子发生数量变化，进而在血中蛋白分子(质谱分析中以PSMs肽段形式展现)上非特异结合的代谢小分子也发生数量变化，从而建立检测目标分子连接组(Connectomes)策略，通过精准的质谱分析，检测到目前技术条件下的可识别、最准确的分子质量，从而发现一系列HBV相关肝硬化的非创诊断指标，为HBV肝硬化的及时诊断奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明中，建立质谱分析目标分子的连接组(connectomes)策略，即是将连接组作为质谱分析的靶分子。连接组策略是结合代谢组学和蛋白质组学的结果，具体是代谢小分子和PSM肽段(是蛋白分子在质谱检测过程的表现形式)的结合物，反映的是生理和病理环境中，代谢小分子和蛋白之间非特异的广泛结合(主要通过化学反应形式)。这样可以以蛋白为载体，能够稳定反映结合在蛋白分子上的代谢小分子在不同生理病理下的变化。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种肝硬化相关生物标志物，所述生物标志物包括如下任意一种或多种：
质量偏移+163Da的PSMs、质量偏移+189.2Da的PSMs、质量偏移+5Da的PSMs和质量偏移-76Da的PSMs。
需要说明的是，所述质量偏移同时也包含上下浮动0.5Da的质量偏移数。
其中，肝硬化表现为由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生，结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形，变硬而发展为肝硬化。
在本发明中，所述肝硬化为肝炎肝硬化，即由甲型、乙型、丙型或丁型病毒性肝炎发展而成；优选的，所述肝硬化为HBV肝硬化。
本发明的第二个方面，提供上述生物标志物在制备肝硬化诊断或辅助诊断产品中的应用。
所述产品包括但不限于装置、试剂盒和设备。
所述装置包括但不限于液相色谱仪、质谱仪和蛋白质组学数据鉴定系统。
本发明的第三个方面，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或多个装置。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述装置。
本发明的第五个方面，提供一种用于诊断或辅助诊断肝硬化的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
本发明的第六个方面，提供一种肝硬化相关生物标志物的筛选方法，所述筛选方法包括：
1)提取血清蛋白并酶解；
2)采用液相色谱-串联质谱进行检测，获取质谱数据；
3)基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案基于建立检测目标分子连接组(Connectomes)策略，从而更好地反应HBV肝硬化的病理特征，并经过筛选获得一系列HBV肝硬化相关生物标志物，经试验验证，其能够有效区分HBV肝硬化组和慢性乙肝组及健康组。
上述技术方案进一步的对上述筛选方法得到的生物标志物进行研究，发现可以通过上述生物标志物的检验频次来诊断HBV肝硬化，从而为HBV相关肝硬化疾病提供了新的非创诊断指标，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例基于质量偏移(+163.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图2为本发明实施例基于质量偏移(+189.2Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图3为本发明实施例基于质量偏移(+5.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图4为本发明实施例基于质量偏移(-76.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图5是本发明实施例HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组中质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图6是本发明实施例基于质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)的ROC曲线图。
图7是本发明实施例HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组中质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图8是本发明实施例基于质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)的ROC曲线图。
图9是本发明实施例HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组中质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图10为本发明实施例基于质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)的ROC曲线图。
图11为本发明实施例HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组中质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值图。
图12为本发明实施例基于质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)的ROC曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
本发明中，特征肽段：1)因肝硬化疾病引起数量变化的代谢小分子，当结合在PSM(peptide-spectrum match)肽段上时，而让PSM肽段发生质量改变(mass shift,mass gap,delta mass)；2)这些PSM(peptide-spectrum match)肽段连同代谢小分子一起构成质谱检测目标---连接组，这也是本文新提出的质谱分析策略；3)质量改变(mass shift,massgap,delta mass)为正值，PSM肽段和代谢小分子结合后发生脱氢、脱水、脱胺等分子后而改变的质量；4)质量改变(mass shift,mass gap,delta mass)为负值：因肽段上氨基酸和代谢小分子发生反应，肽段上氨基酸因脱去基团而减少的分子质量；5)通过肝硬化疾病影响而带有的特征质量变化PSM肽段数与总肽段数的比值来反映肝硬化疾病。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种肝硬化相关生物标志物，所述生物标志物包括如下任意一种或多种：
质量偏移+163Da的PSMs、质量偏移+189.2Da的PSMs、质量偏移+5Da的PSMs和质量偏移-76Da的PSMs。
需要说明的是，所述质量偏移同时也包含其上下浮动0.5Da的质量偏移数。
其中，所述PSMs即肽匹配图谱(Peptide-spectrum matches)，其通过对受试者血清样品进行处理后获得。
本发明的又一具体实施方式中，所述处理具体方法包括：
血清样品采用胰酶进行酶解，采用液相色谱-串联质谱进行检测，并基于PSMs的定量方法进行质谱分析。
其中，肝硬化表现为由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生，结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形，变硬而发展为肝硬化。
本发明的又一具体实施方式中，所述肝硬化为肝炎肝硬化，即由甲型、乙型、丙型或丁型病毒性肝炎发展而成；优选的，所述肝硬化为HBV肝硬化。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述生物标志物在制备肝硬化诊断或辅助诊断产品中的应用。
所述产品包括但不限于装置、试剂盒和设备。
所述装置包括但不限于液相色谱仪、质谱仪和蛋白质组学数据鉴定系统。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或多个装置。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述装置。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断或辅助诊断肝硬化的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种肝硬化相关生物标志物的筛选方法，所述筛选方法包括：
1)提取血清蛋白并酶解；
2)采用液相色谱-串联质谱进行检测，获取质谱数据；
3)基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤1)中，
酶解采用胰酶(优选采用测序级胰酶)进行处理；
采用ziptip对酶解后的肽段进行脱盐。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤2)中，
液相色谱分离的色谱条件为：
流动相A：含有0.1％甲酸的水，流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈；液相质谱分析系统为高效液相色谱(HPLC,Thermo EASY-nLC System)；
洗脱条件为：5分钟95％流动相A，95分钟梯度5％-45％流动相B，10分钟梯度45％-90％流动相B和10分钟90％流动相B(共计120分钟)；
流速为200nL/min。
所述质谱分析条件为：采用DDA(data dependent acquisition)模式分析进行，肽段分析以阳离子模式进行；一级质谱在轨道井以14000分辨率在300-1800质荷比范围内进行分析；二级质谱以高能碰撞解离(HCD)模式进行，从而获得质谱数据。质谱分析系统选用Quadrupole-Orbitrap(Thermo Fisher scientific)质谱。
所述步骤3)中，所述基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量具体方法为：基于PSMs的波谱计数定量方法，并应用Open Pfind软件进行PSMs肽段鉴定分析。
其中，Open Pfind软件参数设定：
1)选择人的蛋白组学数据库(downloaded from UniProt on 20Oct 2019)；
2)固定修饰和可变修饰选择null；
3)MStol＝20ppm&MSMStol＝0.8Da；
4)Enzyme＝Trypsin KR_C；
5)PSM_FDR＝0.01。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
血清样品制备
血清样品由临床检验部的检验剩余样品中获得。依据国际人类蛋白组组织HUPO(Human Proteome Organization)血浆蛋白组项目的样品分析指导，为了减少个体差异对样品分析的影响，每个分析样本由6个病人/健康人的血清样混合，每个分析组包括4个分析样品(相当于4x6＝24个血清样品)，每个分析组相当于4次生物学重复分析。分析组包括：HBV肝硬化分析组；慢性乙肝(CHB)分析组；健康分析组。
建立检测目标分子连接组(Connectomes)策略
选择建立代谢小分子和PSMs相结合的连接组作为鉴定HBV肝硬化指标的策略进行质谱分析。这些连接组内的小分子在概念范围与酶调节的修饰有一些不同。这些连接组主要是代谢小分子和来自蛋白的PSMs通过广泛的化学反应的结合产物。与酶调节的与少数氨基酸特异结合的修饰不同，这些与连接组上PSMs结合的代谢小分子能够通过化学反应广泛的与很多的氨基酸结合。其中广泛结合在连接组上、受HBV肝硬化特异影响的代谢小分子数量变化能更好地反应HBV肝硬化的病理特征。
胰酶溶液内酶解
每个20微升血清样品用80微升8摩尔尿素裂解buffer(包含8摩尔尿素,100mMTris和100mM碳酸氢铵)冰上处理30分钟，然后用3kDa的超滤管在4度条件下12000g过滤20分钟，再用200微升100毫摩尔的碳酸氢铵洗3次变性的蛋白。
蛋白用20毫摩尔DTT，在56度条件下还原30分钟；然后用50毫摩尔IAA在26度避光条件下处理20分钟；最后用测序级胰酶(Trypsin)在37度条件下处理24小时。处理后的蛋白溶液15000g超滤30分钟,超滤下的肽段用C18 ZipTip柱除盐，除盐后C18 ZipTip上的肽段用包含0.1％甲酸的50％甲醇洗脱，搜集洗脱的肽段，用冻干机冻干，-80度保存待分析。
液相色谱-串联质谱分析
肽段用高效液相色谱分离(HPLC,Thermo EASY-nLC System)，然后进入Quadrupole-Orbitrap(Thermo Fisher scientific)质谱进行DDA(data dependentacquisition)模式分析。对于每次样品分析，样本先过C18预柱，然后在C18反相分析柱上分离。分析柱上的肽段用线性梯度洗脱液(A液:0.1％甲酸水；B:100％乙腈/0.1％甲酸)洗脱。以200纳升/分钟洗脱120分钟(5分钟95％流动相A，95分钟梯度5％–45％流动相B，10分钟梯度45％–90％流动相B，和10分钟90％流动相B)。肽段分析以阳离子模式进行。一级质谱在轨道井以14000分辨率在300-1800质荷比范围内进行分析。二级质谱以高能碰撞解离(HCD)模式进行。
PSMs定量
基于PSMs的波谱计数定量方法是经典的质谱分析定量方法，相对于离子密度定量，这种方法的优点是波谱计数的数据直接来源于质谱，PSMs定量可以避免质谱之外的其他仪器对精度的干扰。比如样品滞留时间RT(retention time)，这个滞留时间是离子密度定量方法的一个计算因子，在液相色谱-质谱串联分析过程中，色谱中的C18分析柱压力变化和周围环境温度变化都时刻对滞留时间RT(retention time)有影响，进而影响了密度定量方法的精度。所以本技术选择基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量。
应用Open Pfind软件进行PSMs肽段鉴定分析，软件参数设定：1)选择人的蛋白组学数据库(downloaded from UniProt on 20 Oct 2019)；2)固定修饰和可变修饰选择null；3)MStol＝20ppm&MSMStol＝0.8Da；4)Enzyme＝Trypsin KR_C；5)PSM_FDR＝0.01.
统计分析
在样本分析组和验证组中，两组间的对比分析选择非配对Welch’s t-test(先进行齐次分析)统计方法。有统计意义的质量偏移(mass gaps，mass shifts)变化以p值小于0.05为标准。
实验结果
将HBV肝硬化组与CHB(慢性乙肝)组及健康对照组的肽段样品进行质谱分析、应用Open Pfind软件进行肽段PSMs搜索分析和数据对比，从而在质谱分析中找到可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(mass shifts,delta mass,massgaps)。
最后找到4个具有可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)，+163Da，+189.2Da,+5Da,-76Da.
1、质量偏移+163Da是在PSMs上增加一个络氨酸(Tyrosinyl(-Y-,-Tyr-))(https://abrf.org/delta-mass)，基于建立的连接组模型策略，在质谱检测分析中，与连接组中PSMs结合的络氨酸越多【连接组：PSM(由质谱直接检测到的肽段，这些肽段来源于Trypsin胰酶酶解前血清中的蛋白)+代谢小分子】，表示因HBV肝硬化疾病调节产生且结合在PSMs肽段上的络氨酸代谢分子越多。同时文献报道络氨酸与肝病有关(MARSHA YMORGAN,Gut,1982,Plasma amino-acid patterns in liver disease.)，但到现在为止，还没有在质谱分析中把PSMs上增加+163Da质量与肝硬化相关联的报道。
经过分析发现，1)HBV肝硬化分析组对比慢性乙肝(CHB)分析组:质量增加+163Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.21倍，非配对welch's t-test p值＝0.0479<0.05；2)HBV肝硬化分析组对比健康分析组:质量增加+163Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.82倍，非配对welch's t-test p值＝0.0016<0.01；3)慢性乙肝(CHB)分析组对比健康分析组:质量增加+163Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.51倍，非配对welch's t-testp值＝0.0024<0.01。
2、质量偏移+189.2Da是在PSMs上增加一个+189.2Da的代谢小分子
经过分析发现，1)HBV肝硬化分析组对比慢性乙肝(CHB)分析组：质量增加+189.2Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.35倍，非配对welch's t-test p值＝0.0239<0.05；2)HBV肝硬化分析组对比健康分析组:质量增加+189.2Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.64倍，非配对welch's t-test p值＝0.0273<0.05；3)慢性乙肝(CHB)分析组对比健康分析组：质量增加+189.2Da的PSMs肽段数与总肽段数比值无变化，非配对welch's t-test p值＝0.2128>0.05。
3、质量偏移+5Da是在PSMs上增加一个+5Da的代谢小分子
经过分析发现，1)HBV肝硬化分析组对比慢性乙肝(CHB)分析组：质量增加+5Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.50倍，非配对welch's t-test p值＝0.0427<0.05；2)HBV肝硬化分析组对比健康分析组：质量增加+5Da的PSMs肽段数与总肽段数比值增加1.52倍，非配对welch's t-test p值＝0.0177<0.05；3)慢性乙肝(CHB)分析组对比健康分析组：质量增加+5Da的PSMs肽段数与总肽段数比值无变化，非配对welch's t-test p值＝0.4814>0.05。
4、质量偏移-76Da是在PSMs上氨基酸和代谢小分子发生反应，肽段上氨基酸因脱去基团而减少-76Da质量
经过分析发现，1)HBV肝硬化分析组对比慢性乙肝(CHB)分析组:质量变化-76Da的PSMs肽段数与总肽段数比值减少1.25倍，非配对welch's t-test p值＝0.0054<0.01；2)HBV肝硬化分析组对比健康分析组：质量变化-76Da的PSMs肽段数与总肽段数比值减少1.23倍，非配对welch's t-test p值＝0.0371<0.05；3)慢性乙肝(CHB)分析组对比健康分析组：质量变化-76Da的PSMs肽段数与总肽段数比值无变化，非配对welch's t-test p值＝0.4119>0.05。
本实施例中经过质谱测定和Open Pfind软件分析，找到4个具有可识别HBV肝硬化(其他肝硬化)标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(mass shifts,deltamass,mass gaps)，+163Da，+189.2Da，+5Da，-76Da。
1)可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(massshifts,delta mass,mass gaps)，+163Da(包括但不限于四舍五入等于+163Da的质量偏移，如质量偏移四舍五入等于+163.1Da、+163.2Da、+163.3Da、+163.4Da、+162.5Da、+162.6Da、+162.7Da、+162.8Da、+162.9Da等)。
2)可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(massshifts,delta mass,mass gaps)，+189.2Da(包括其上下浮动0.5Da的质量偏移数，如质量偏移+189.3Da、+189.4Da、+189.5Da、+189.6Da、+189.7Da、+189.1Da、+189.0Da、+188.9Da、+188.8Da、+188.7Da等)。
3)可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(massshifts,delta mass,mass gaps)，+5Da(包括但不限于四舍五入等于+5Da的质量偏移，如质量偏移四舍五入等于+5.1Da、+5.2Da、+5.3Da、+5.4Da、+4.5Da、+4.6Da、+4.7Da、+4.8Da、+4.9Da等)。
4)可识别HBV肝硬化标识的PSMs(peptide-spectrum match)质量偏移(massshifts,delta mass,mass gaps)，-76Da(包括但不限于四舍五入等于-76Da的质量偏移，如质量偏移四舍五入等于-76.1Da、-76.2Da、-76.3Da、-76.4Da、-75.5Da、-75.6Da、-75.7Da、-75.8Da、-75.9Da)。
本实施例生物标志物可以有效分辨HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组的区别
1)选择质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+163.0Da和质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+189.2Da来分辨HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组的区别
1.1)计算方式：带有以上质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值。
1.2)HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组：非配对two-sides，welch's t-test p值＝0.0046<0.01；HBV肝硬化组/对照组(慢乙肝组和健康组)比值:fold＝1.46.
1.3)ROC面积：0.9375；特异度100％时，灵敏度75％。
2)选择质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+163.0Da、质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+189.2Da和质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+5.0Da来分辨HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组的区别
2.1)计算方式：带有以上质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值。
2.2)HBV肝硬化组和慢性乙肝(CHB)组及健康组：非配对two-sides，welch's t-test p值＝0.0029<0.01；HBV肝硬化组/对照组(慢乙肝组和健康组)比值:fold＝1.48.
2.3)ROC面积：0.9688；特异度100％时，灵敏度87.5％。
效果验证：
1HBV肝硬化验证组：选择5个单独的HBV肝硬化样本(非混合样本)；对照组：选择3个慢乙肝(CHB)样本和3个健康者样本。
2样本制备、样本质谱分析前处理、质谱分析、PSMs肽段定量及统计分析方法同上。
3选择质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+163.0Da和质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+189.2Da来分辨HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组的区别
3.1)计算方式：带有以上质量偏移(+163.0Da和+189.2Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值。
3.2)HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组：非配对two-sides，welch'st-test p值＝0.0185<0.05；HBV肝硬化验证组/对照组(慢乙肝组和健康组)比值:fold＝1.83.
3.3)ROC面积：0.9667；特异度100％时，灵敏度83.3％。
4选择质量偏移(mass shifts,delta mass,mass gaps)+163.0Da、质量偏移(massshifts,delta mass,mass gaps)+189.2Da和质量偏移(mass shifts,delta mass,massgaps)+5.0Da来分辨HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组的区别
4.1)计算方式：带有以上质量偏移(+163.0Da、+189.2Da和+5.0Da)PSMs肽段数与总PSMs肽段数比值。
4.2)HBV肝硬化验证组和慢性乙肝(CHB)组及健康组：非配对two-sides，welch'st-test p值＝0.0108<0.05；HBV肝硬化验证组/对照组(慢乙肝组和健康组)比值：fold＝1.60.
4.3)ROC面积：0.9667；特异度100％时，灵敏度83.3％。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肝硬化相关生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括如下任意一种或多种：
质量偏移+163Da的PSMs、质量偏移+189.2Da的PSMs、质量偏移+5Da的PSMs和质量偏移-76Da的PSMs；
所述质量偏移同时也包含上下浮动0.5Da的质量偏移数；
所述PSMs即肽匹配图谱，其通过对受试者血清样品进行处理后获得。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述处理具体方法包括：
血清样品采用胰酶进行酶解，采用液相色谱-串联质谱进行检测，并基于PSMs的定量方法进行质谱分析。
3.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述肝硬化为肝炎肝硬化；优选的，所述肝硬化为HBV肝硬化。
4.权利要求1-3任一项所述生物标志物在制备肝硬化诊断或辅助诊断产品中的应用；
优选的，所述产品包括但不限于装置、试剂盒和设备；
进一步优选的，所述装置包括但不限于液相色谱仪、质谱仪和蛋白质组学数据鉴定系统。
5.一种装置，其特征在于，所述装置包括：
检测权利要求1-3任一项生物标志物的一个或多个装置。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5所述装置。
7.一种用于诊断或辅助诊断肝硬化的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
8.一种肝硬化相关生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：
1)提取血清蛋白并酶解；
2)采用液相色谱-串联质谱进行检测，获取质谱数据；
3)基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，
酶解采用胰酶(优选采用测序级胰酶)进行处理；
采用ziptip对酶解后的肽段进行脱盐；
所述步骤2)中，
液相色谱分离的色谱条件为：
流动相A：含有0.1％甲酸的水，流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈；
洗脱条件为：5分钟95％流动相A，95分钟梯度5％-45％流动相B，10分钟梯度45％-90％流动相B和10分钟90％流动相B；
流速为200nL/min；
所述质谱分析条件为：采用DDA模式分析进行，肽段分析以阳离子模式进行；一级质谱在轨道井以14000分辨率在300-1800质荷比范围内进行分析；二级质谱以高能碰撞解离模式进行，从而获得质谱数据。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基于PSMs的定量方法进行质谱分析定量具体方法为：基于PSMs的波谱计数定量方法，并应用Open Pfind软件进行PSMs肽段鉴定分析。
其中，Open Pfind软件参数设定：
1)选择人的蛋白组学数据库；
2)固定修饰和可变修饰选择null；
3)MStol＝20ppm&MSMStol＝0.8Da；
4)Enzyme＝Trypsin KR_C；
5)PSM_FDR＝0.01。
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