CN113917034A - 用于评估阿尔茨海默症的生物标记组合及其应用和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于评估受试者阿尔茨海默症的生物标记组合，包含该生物标记组合检测试剂的诊断产品及其应用。所述生物标记组合包括磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质，用于阿尔茨海默症的评估和诊断。

Description

用于评估阿尔茨海默症的生物标记组合及其应用和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物标记及其利用该标记的试剂盒和检测方法领域，具体为用于评估阿尔茨海默症的生物标记组合及其应用和试剂盒。
背景技术
现有临床诊断阿尔茨海默病(AD)采用的标志物主要包括脑脊液中β淀粉样蛋白(Aβ)、总tau蛋白(T-tau)、磷酸化tau蛋白(P-tau)；结构MRI和功能MRI影像学检测；Aβ的PET显像(使用11C-PIB和18F-FDDNP作为示踪剂)影像学检测；家族性阿尔茨海默症(FAD)中位于14、1、21号染色体上的早老素1(presenilin 1,PS1)基因、早老素2(presenilin 2,PS2)基因、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因的致病基因检测。但是这些方法的敏感性和特异性较差、对患者而言损伤较大、耗时长、价格昂贵。
目前AD的体液检测标志物主要集中在脑脊液中Aβ和tau蛋白的水平，但是这些标志物在鉴别正常人和AD患者或MCI(轻度认知障碍)患者转化为AD患者中效果较好，而在无症状正常人中的预测价值较小。与脑脊液检测相比，血液检测损伤小，不易造成老年病人的并发症。但是研究发现，血液中Aβ42或Aβ42/tau在血液中的水平与AD临床症状关联性很差，结果令人失望。
现有技术中，尚没有用于诊断AD的血液标志物，更没有利用血液标志物检测AD的检测试剂盒。因此，在目前的科研和实践中，需要在血液中找出特异性和敏感性强的生物标记物或组合物，并研发出相应的检测试剂盒和检测方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合，包括磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质。通过检测受试者血液里面多种磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质的浓度，可进行阿尔茨海默病(AD)的辅助检查。
本发明还提供了用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合在制备评估和诊断阿尔茨海默病(AD)的诊断产品方面的应用。诊断产品可以为诊断试剂、试剂盒或者诊断装置等多种形式。
本发明进一步提供了包含用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合的试剂盒及利用该试剂盒进行检测方面的应用。
用于评估阿尔茨海默病(AD)的上述生物标记组合在筛选预防或治疗阿尔茨海默症药物中的用途。
根据本发明的第一方面，用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合，包括磷脂酰胆碱类物质。磷脂酰胆碱类物质选自溶血磷脂酰胆碱C18:2(Lyso PC a C18:2)、二酰基磷脂酰胆碱C 36:6(PC aa C 36:6)、二酰基磷脂酰胆碱C 38:0(PC aa C 38:0)、二酰基磷脂酰胆碱C 38:6(PC aa C 38:6)、二酰基磷脂酰胆碱C40:1(PC aa C40:1)、二酰基磷脂酰胆碱C40:2(PC aa C40:2)、二酰基磷脂酰胆碱C40:6(PC aa C40:6)、酰基-烷基磷脂酰胆碱C40:6(PC ae C40:6)中的一种或多种。
用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合还包括肉碱类物质。肉碱类物质选自丙酰肉碱(Propionyl AC或C-3)。
用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合还包括神经递质类物质，可以选自乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸、谷氨酸中一种或多种。
本发明发现，这些磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质类物质在阿尔茨海默病(AD)患者的血液中浓度低于正常人，通过检测这些物质可以有效识别诊断阿尔茨海默病(AD)病人和正常人，有很好的灵敏度和特异性。基于此，形成了本发明的技术方案。
在一个具体实施方式中，本发明的生物标记组合包括丙酰肉碱、Lyso PC a C18:2、PC aa C-36:6、PC aa C-38:0、PC aa C-38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aa C40:6、PC ae C40:6、乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸和谷氨酸。
本发明的生物标记组合可以诊断产品的形式被制造和应用。具体地，诊断产品是诊断试剂、试剂盒或诊断装置。优选地，本发明的诊断产品以试剂盒的形式被制造和应用。试剂盒包括前述用于评估阿尔茨海默病(AD)的生物标记组合标准品和用于检测受试样品中前述生物标记组合含量的试剂。
受试样品来源于受试者血液，可以是血液、血清或血浆，优选血浆。
在一个具体的实施方式中，用于检测受试样品中生物标记组合含量的试剂包括样品萃取液和液相色谱流动相溶剂包。所述样品萃取液选自有机溶剂，如甲醇、乙腈、氯仿中的一种或多种。在一个具体的实施方式中，所述样品萃取液按照体积百分比包括：80-95％的甲醇和5-20％的乙腈。
在一个优选的实施方式中，试剂盒还包括液相色谱流动相溶剂包。优选地，所述液相色谱流动相溶剂包按照体积百分比包括：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水。
在一个具体的实施方式中，用于评估阿尔茨海默病(AD)的试剂盒包括生物标记组合标准品。优选地，所述标准品以内标品的形式存在。内标品包括磷脂酰胆碱内标品或/和肉碱内标品或/和神经递质内标品。每种内标品可以单独存在，也可以混合溶液形式存在，如磷脂酰胆碱内标品、肉碱内标品和神经递质内标品的混合溶液。在一个优选的实施方式中，内标品为磷脂酰胆碱内标品、肉碱内标品和神经递质内标品的混合溶液。在进一步优选的实施方式中，内标品的混合溶液中所述磷脂酰胆碱内标品的浓度为400-800ng/ml，优选为600ng/ml；所述肉碱内标品的浓度为10-30ng/ml，优选为20ng/ml；所述神经递质内标品浓度为40-60μg/mL，优选为50μg/mL。优选地，所述磷脂酰胆碱内标品为d4-PC-14；所述肉碱内标品为2H3-C-3；所述神经递质内标品为3,4-二羟基苄胺Dihydroxy benzyl amine(DHBA)。
在一个具体实施方式中，本发明的试剂盒还包括校准品，该校准品用来制作标准曲线。生物标记组合中的成分，如磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质均可以有校准品，如磷脂酰胆碱校准品、肉碱校准品和神经递质校准品；优选地，所述磷脂酰胆碱校准品为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，所述肉碱校准品为丙酰左旋肉碱盐酸盐，所述神经递质校准品为乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸、谷氨酸；更优选地，所述校准品为磷脂酰胆碱校准品、肉碱校准品和神经递质校准品的混合溶液，其中，所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)的浓度为20-40μg/mL；所述丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为6-10μg/mL；所述乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为2-3μg/mL；所述5-羟色胺和谷氨酸的浓度分别为10-15μg/mL。
在一个具体实施方式中，本发明的试剂盒还包括质控品用以控制所述产品的质量。优选质控品包括低浓度质控品和高浓度质控品。在一个优选的实施方式中，质控品包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、丙酰左旋肉碱盐酸盐、乙酰胆碱、5-羟色胺和γ-氨基酸丁酸和谷氨酸。在进一步优选的实施方案中，所述质控品为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、丙酰左旋肉碱盐酸盐、乙酰胆碱、5-羟色胺和γ-氨基酸丁酸和谷氨酸的混合溶液。若质控品包括低浓度质控品和高浓度质控品，那么每种物质的浓度范围可以选择：低浓度质控品中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为1-2μg/mL，丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为0.4-0.6μg/mL，乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为0.02-0.04μg/mL，5-羟色胺和谷氨酸的浓度分别为0.6-1.0μg/mL；高浓度质控品中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为20-25μg/mL，丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为4-8μg/mL，乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为1.5-2.5μg/mL，5-羟色胺和谷氨酸的浓度分别为8.0-10.0μg/mL。
进一步地，本发明还提供应用评估或诊断阿尔茨海默病(AD)的试剂盒对受试者血液样本进行检测的方法。该方法包括检测和结果分析两个步骤，也可以包含受试者样本预处理以及检测系统优化的步骤。
具体地，本发明应用评估或诊断阿尔茨海默病(AD)的试剂盒对受试者血液样本进行检测的方法包括检测步骤和检测结果分析步骤；其中：所述检测步骤包括：
标准曲线工作液制备步骤：利用所述样本萃取液将校准品进行连续稀释，得到不同稀释梯度的标准曲线工作液；
质控品工作液和内标工作液的制备步骤：以所述低浓度质控品和高浓度质控品作为质控品工作液使用；以所述的内标品的混合溶液作为内标工作液使用；
加液步骤：精密转移样本萃取液到96孔板的小孔中，分别在不同的孔中加入待测血浆样本、校准品工作液以及质控品工作液，然后在加上所述待测血浆样本、所述校准品工作液以及所述质控品工作液的每个小孔中再加入内标工作液，密封混匀，室温静置，离心取上清，加入到另一个96孔板中，密封后上串联质谱仪检测。
本发明的检测方法借助于液相色谱串联质谱法进行。通过采用高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测所述生物标记组合中各种生物标记的浓度。
本发明的技术方案具有如下有益效果：
根据国家卫生计生委2016年公布的《阿尔茨海默病临床路径》，患者确诊为AD疾病时已经有了认知功能障碍，并且针对AD患者的辅助检查有如下明显的缺陷：(1)血液检查中的项目为常规血检项目，只能排除其他病因导致的痴呆，并不代表AD的病理特征；(2)脑脊液检查中的不同指标含量，反映的是AD的病理特征，但只有通过脊髓穿刺才能获得脑脊髓液，对患者的损伤很大；(3)影像学检查，大多情况下只是排除其他可治疗性痴呆，某些情况下可以反映AD的病理特征，但是价格昂贵；(4)电生理检查，并不能严格区分AD和其他类型的痴呆，价格较贵；(5)基因检查，大多数情况下用于家族性AD患者的诊断，这种类型的患者只占所有AD患者的不超过1.3％，应用范围很小。
因此，目前临床AD诊断的缺点如下：(1)不能在认知功能障碍出现之前对AD就进行诊断；(2)对AD的辅助检查要么只能排除其他病因导致的痴呆，要么对患者损伤比较大，要么价格比较昂贵，要么应用范围比较局限。
本发明的生物标记组合及包含所述生物标记组合的试剂盒通过检测受试者血液里多种磷脂酰胆碱、肉碱物质和神经递质含量，可以进行AD辅助检查。这些磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质物质在AD患者的血液中浓度低于正常人，同时检测这些物质可以区分AD病人和正常人，有很好的灵敏度和特异性，为此这些磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质可以视为AD的血液标志物。检测这些磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质，相当于直接确定AD的病理，可以将AD患者和正常人区分开，同时对患者的损伤比脊髓穿刺小，价格比影像学和电生理便宜很多，且应用面不仅限于家族型AD。
另外，目前临床定量检测常用的技术方法主要有酶联免疫法和荧光PCR法。酶联免疫法用于各种蛋白和小分子的定量检测，荧光PCR用于基因的定量检测。采用这两种技术方法原理的体外诊断试剂盒缺点如下：(1)只能检测一个待测物；(2)检测的特异性比较低，待测物质的检测容易受到血液中其他物质的干扰，假阳性出现的情况比较高；(3)检测受到基质效应的影响比较大，导致定量准确度比较低；(4)酶联免疫试剂盒研发过程需要大规模筛选抗体，荧光PCR试剂盒则需要设计筛选大量引物，以上需要投入的人力物力比较多，能否获得满意的结果有很大的运气成分。
相比而言，液相色谱串联质谱法成功地克服了目前临床定量检测常用技术方法的缺点。该方法具有以下明显的优势：(1)一个试剂盒可以检测多种待测物质，为此可以同时检测多种疾病，更全面的反映患者的身体状况。目前获批的新生儿代谢疾病筛查试剂盒(串联质谱法)可以同时检测近20种代谢遗传病。(2)检测具有很高的特异性，每一种物质进入质谱碎片化后，都会产生具有独一无二质荷比的离子碎片，可以被质谱识别并定量。为此，待测物质的检测基本上不受血液中其他物质的干扰，患者检测结果的可信度显著提高。(3)很高的定量准确性，通过加入内标准品的方法，基质效应对定量准确性的影响可以降到最低。也正是由于这种高定量准确性，质谱学定量检测方法为国际一级参考测量程序采用方法的一种，酶联免疫法和荧光PCR法的检测结果在研发过程中往往会和质谱学方法的检测结果进行比对校准。因此质谱学的检测结果准确率很高。(4)单次检测的时间比现有的方法要快至少1倍，可以节省检测时间，提高诊断效率。
本发明创造性地提出了将液相色谱串联质谱法应用于AD辅助检查中的生物标记识别，系统构建了色谱柱条件等，为实现快速、高效、准确检测提供了技术路径。
附图说明
图1为串联质谱系统中，质谱进样与样品进入质量分析器示意图。
图2为串联质谱系统中，质量分析器中母离子物质鉴定和子离子定量示意图。
图3待测物PC1-8，C-3，Ach,5-HIAA,GABA,Glu离子图，包括图3-1至图3-14。
图4现有技术方法ROC结果图。
图5本发明方法ROC结果图。
具体实施方式
本发明提供用于检测或/和诊断阿尔茨海默症的生物标记组合，来源于血液，包括：PC-1、PC-2、PC-3、PC-4、PC-5、PC-6、PC-7、PC-8、C-3、Ach、5-HIAA、GABA、Glu中的一种或多种。在本发明的某一优选实施例中，用于检测或/和诊断阿尔茨海默症的生物标记为PC-1、PC-2、PC-3、PC-4、PC-5、PC-6、PC-7、PC-8、C-3、Ach、5-HIAA、GABA、Glu的组合。上述生物标记的名称如表1所示，磷脂酰胆碱中，C后第一个数字表示该胆碱的每个脂酰基或烷基的C数目，第二个数字(即“：”后的数字)代表每个脂酰基上的不饱和双键的数目。例如：PC aaC38:0可以解释为：PC aa表示二脂酰基磷脂酰胆碱，a是脂酰基的缩写，C38:0表示每个脂酰基有38个碳，且无不饱和双键。
PC ae C40:6可以解释为：PC ae表示脂酰基-烷基磷脂酰胆碱，a是脂酰基的缩写，e是烷基的缩写，C40:6表示脂酰基有40个碳，烷基也有40个碳，且脂酰基上有6个不饱和双键。其他磷脂酰胆碱的解释依此类推。
表1：各生物标记名称
Figure BDA0003310840180000061
本发明提供一种用于检测或/和诊断阿尔茨海默症的试剂盒，该试剂盒包括：采用高效液相色谱串联质谱法检测所述生物标记组合中各种生物标记浓度的试剂；优选地，所述试剂包括：血液样本的预处理试剂和高效液相色谱流动相溶剂，所述血液样本的预处理试剂包括：样本萃取液，
所述样本萃取液，按体积百分比，包括：80-95％(优选为90％)的甲醇，5-20％(优选为10％)的乙腈。
按体积百分比，所述高效液相色谱流动相溶剂包，包括：30-95％乙腈，5-70％体积比的纯水，并含有8-12mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸。
本发明的试剂盒可以对所述生物标记组合中的各种生物标记进行定量分析。
实现所述液相色谱串联质谱法的仪器可以是串联质谱系统，例如：Quattro MicroScreening System(Qmicro)筛查系统、WatersTM TQD System(TQD)系统、Shimadzu LC-8030TM三重四极杆LC/MS/MS系统、API 2000TM系统(MS2)、API 3200TM系统和/或AppliedBiosystems公司的API 4000TM三重四极杆质谱仪。
在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，该试剂盒还包括磷脂酰胆碱内标品或/和肉碱内标品或/和神经递质内标品。优选为：内标品为磷脂酰胆碱内标品、肉碱内标品和神经递质内标品的混合溶液，其中，磷脂酰胆碱内标准品为14:0PC-d4，即1,2-二豆蔻酰-d4-sn-磷脂酰胆碱(英文名为：1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine-1,1,2,2-d4,CAS:185906-01-8)，优选浓度为400-800ng/ml,更优选为600ng/ml；
该肉碱内标准品为：2H3-C-3，即丙酰基-L-肉碱-(N-甲基-d3)盐酸盐(英文名为：Propionyl-L-carnitine-(N-methyl-d3)hydrochloride)，优选浓度为10-30ng/ml，更优选为20ng/ml；
该神经递质内标品为：3,4-Di hydroxy benzyl amine(DHBA)，优选浓度为40-60μg/mL，更优选为50μg/mL；
上述ng/ml的内标品可直接用于样品浓度检测，即可直接作为内标工作液。
该试剂盒还包括高水平浓度校准品混合溶液，包括：
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，PC-14(DMPC)，优选浓度为20-40μg/ml，更优选为30μg/ml；
和丙酰左旋肉碱盐酸盐，C-3(levocarnitine propionate hydrochloride)，优选浓度为6-10μg/ml；更优选为8μg/ml；
和乙酰胆碱，Ach(Acetylcholine),优选浓度为2-3μg/ml；更优选为2.5μg/ml；
和γ-氨基酸丁酸，γ-amino acid butyric acid(GABA)，优选浓度为2-3μg/ml；更优选为2.5μg/ml；
和5-羟色胺，5-hydroxy indole acetic acid(5-HIAA)，优选浓度为10-15μg/ml；更优选为12.5μg/ml；
和谷氨酸(Glumatic acid)，优选浓度为10-15μg/ml；更优选为12.5μg/ml；
该高水平浓度校准品混合溶液在用于检测前需要先进行浓度梯度稀释，以得到各种浓度的校准品工作液。
该试剂盒还包括多个浓度水平质控品混合溶液，在本发明的实施例中有高浓度质控品和低浓度质控品，每个浓度质控品中均包含二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、丙酰左旋肉碱盐酸盐和多种神经递质，具体如下：
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，PC-14(DMPC)，优选低浓度质控品中PC-14的浓度为1-2μg/mL，更优选为1.8μg/ml；优选高浓度质控品中PC-14的浓度为20-25μg/ml，更优选为22.5μg/ml。
丙酰左旋肉碱盐酸盐(levocarnitine propionate hydrochloride)，C-3,优选低浓度质控品中C-3的浓度为0.4-0.6μg/mL，更优选为0.48μg/ml；优选高浓度质控品中C-3的浓度为4-8μg/ml，更优选为6μg/ml。
乙酰胆碱，Ach(Acetylcholine)和γ-氨基酸丁酸，GABA(γ-amino acid butyricacid)优选低浓度质控品中的浓度为0.02-0.04μg/mL，更优选为0.03μg/ml；优选高浓度质控品中的浓度为1.5-2.5μg/ml，更优选为1.8μg/ml。
5-羟色胺，5-HIAA(5-hydroxy indole acetic acid)和谷氨酸，Glu(Glutamicacid),优选低浓度质控品中的浓度为0.6-1.0μg/mL，更优选为0.75μg/ml；优选高浓度质控品中的浓度为8-10μg/ml，更优选为9.5μg/ml。
上述质控品的单位为μg/ml，可直接用于测试，作为质控品工作液。
本发明还提供了多种磷脂酰胆碱/肉碱和神经递质的检测方法，即试剂盒的使用方法，该检测方法为液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法，用于测量和评估血浆中的磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质的浓度。
该检测方法包括以下步骤：
S1、标准曲线工作液制备步骤：
利用所述样本萃取液将高浓度水平校准品混合溶液进行连续梯度稀释，得到标准曲线校准品工作液；
S2、质控品工作液和内标工作液的制备步骤：
上述高浓度质控品和低浓度质控品可作为质控品工作液直接使用；上述内标品的混合液可作为内标工作液直接使用；
S3、样品预处理：
精密转移135μL样本萃取液到96孔板的每个小孔中，分别在不同的孔中加入20μL的待测血浆样本、空白对照、阴性对照、阳性对照、校准品工作液、质控品工作液，再在加有上述物质的每个孔中分别加入45μL的内标工作液(3种混合内标：d4-PC-14，2H3-C-3，DHBA，即上述的内标品混合溶液)，密封，混匀2min，室温静置5min，4000g离心10分钟，用移液器吸取上清，加入到另一个96孔板中，密封后上串联质谱仪检测。
阴性对照是采用无AD病史的健康人200例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘；阳性对照是采用AD患者200例(2ml/人)的血浆混合而成。
S4、测试：
将步骤S3得到的96-孔板放入串联质谱系统的进样器(质谱流动相溶剂已经加入该系统中)，启动质谱控制程序，进行检测。
上述串联质谱系统包括：
自动进样模块，将经萃取样品传递到质谱模块的离子源；优选地，该自动进样模块是由自动进样器、微型泵，与溶剂真空除气模块组成的液相色谱(LC)系统。
质谱模块，与自动进样模块连接，将经萃取样品形成离子；
分析模块，与质谱模块连接，检测离子的含量。
上述串联质谱系统中所用的仪器可以选择以下的任何一个，单独采用以下任何一个仪器均可以独立完成本发明的检测：Quattro Micro Screening System(Qmicro)筛查系统、WatersTM TQD System(TQD)系统、Shimadzu LC-8030TM三重四极杆LC/MS/MS系统、API2000TM系统(MS2)、API 3200TM系统和Applied Biosystems公司的API 4000TM三重四极杆质谱仪。
离子源能够形成由带电液滴组成的均匀喷雾，离子在溶剂蒸发后从中形成。这些离子被导入质量分析仪中检测(附图1)。
在串联质谱系统中，离子穿过一个真空界面。该界面可排除不带电荷的物质并辅助溶剂分子与离子分离。离子穿过界面后就会进入仪器的质量过滤与分析部分。不带电荷的分子由真空系统泵走，聚焦的离子束则被引入第一级四极杆质量过滤器Q1。在Q1里，离子按照各自的质荷比而分离，并进入碰撞室(非质量过滤设备)。带有微量气压的气体被导入碰撞室。穿过碰撞室的离子与气体分子碰撞后，裂解为更小的离子。该过程称为碰撞激活性解离(CAD)。较小的子代离子随后被导入第二级的质量分析仪内(Q3)并根据质荷比进行分离，最终送到检测器内得到信号。
每次检测中，可检测生物标记物PC1-8、C-3和神经递质中的一种或几种，优选为全部检测。
在对受试者血浆样品进行LC-MS/MS分析的同时设置质量控制，质控品的用量参见如上所述，质控品的处理方式与血浆样品的处理方式相同。质量控制的目的是为了排除检测过程中因为仪器不正常和人员操作失误导致的结果不可信的情况。
试剂盒中的各个水平质控品应在每一个96-孔板进行3个孔的复孔运行；质控品应该和样品在同样条件下运行。注意：质控品的平均值通过使用本试剂盒运行复孔测量得出；取所有运行的平均值来赋值。
本发明的检测方法中所包括的校准曲线制作方法如下。
制作校准曲线(PC-14、C-3，Ach,5-HIAA,GABA和Glu)的工作液是采用连续稀释法以样本萃取液作为稀释剂稀释PC-14、C-3，Ach,5-HIAA,GABA和Glu的高浓度校准品混合溶液得到的。校准曲线的线性度是通过每种磷脂酰胆碱和肉碱的六个不同浓度来确定。PC-14的校准线点的浓度分别为0.6、1.2、3.0、6.0、15.0、30.0μg/ml；C-3的校准线点的浓度为0.16、0.32、0.8、1.6、4.0、8.0μg/ml；Ach和GABA的校准线点的浓度分别为0.05、0.10、0.25、0.5、1.25、2.5μg/ml；5-HIAA和Glu的校准线点的浓度分别为0.25、0.50、0.75、2.5、6.25、12.5μg/ml，也就是说，每种工作液包括六种不同浓度，同时以生理盐水作为完全空白对照，人血浆(该人血浆是确诊为阿尔兹海默症的200例患者的血浆混合而成的血盘)作为基质空白对照(即，阳性对照)，在利用LC-MS/MS分析前，这六种不同浓度的工作液、完全空白对照、基质空白对照均需要按照血浆样品的预处理方法进行预处理，然后，再进行LC-MS/MS分析，利用LC-MS/MS分析方法得到的PC-14,C-3，Ach,GABA,5-HIAA和Glu的校准点对应的质谱信号峰面积结果，然后以浓度(μg/ml)作为横坐标，以质谱信号峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。本实施例得到的相应校准线可以用于查询受试者血浆样本中相应磷脂酰胆碱(PC1-8)、肉碱(C-3)、乙酰胆碱(Ach)、γ-氨基酸丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HIAA)和谷氨酸(Glu)的浓度。
LC-MS/MS检测分析的优化条件为：
本实施例得到优化后的LC-MS/MS检测分析条件以及采用的设备可以记载于本申请试剂盒的说明书上。或者/和将优化LC-MS/MS检测分析条件所需的试剂作为本发明试剂盒中试剂的一部分。
LC-MS/MS分析是在一个与Waters ACQUITY UPLC I-Class液相色谱仪相结合的Waters TQD质谱仪上进行。在阳离子模式下的电喷雾电离化(ESI)采用多反应监测(MRM)。使用Waters MassLynx软件控制仪器和数据采集。
在对受试者血浆样品进行检测工作之前，对检测条件进行了综合优化，以下为优化后的参数：正离子电喷雾电压：3000V；锥孔电压：53V；汽化温度，550℃；汽化气流速：800L/小时；锥孔气流速：30L/小时；扫描模式，SRM。色谱分离是在Phenomenex KinetexHILIC 2.6μm 100x2.1mm的色谱柱进行的。色谱柱温度设定在40℃。流动相溶剂包包括：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水。进样量为10μl，流量设置为0.5ml/min。应用以下梯度：0到0.5分钟，A/B(65/35％)；0.5到1.5分钟，A/B(65/35％)；1.5到3.6分钟，A/B(2/98％)；3.6到3.7分钟，A/B(2/98％)；3.7到5分钟，A/B(65/35％)。
利用LC-MS/MS分析方法得到的PC1-8、C-3、Ach、GABA、5-HIAA和Glu的产物离子谱参见附图3，图中标明了出峰时间(横坐标)、峰强度(纵坐标)以及荷质比。
本发明还提供了对检测结果的分析方法：
上述检测后，通过统计学中Lasso套索回归分析法，建立模型并赋予待测物权重因子，以得出关于使用PC1-8、C-3和神经递质含量(是指待使用检测血液样品的检测结果与内标准品的检测结果的比值计算出的浓度)评估AD风险的一个综合的检测结果：
Y＝0.880(PC-1)+1.107(PC-2)+0.664(PC-3)+0.331(PC-4)-0.815(PC-5)-1.552(PC-6)+1.225(PC-7)+0.045(PC-8)-0.503(C-3)+0.367(Ach+5-HIAA)+0.0541(GABA)-1.003(Glu)，
其中，PC-1至PC-8分别代表检测步骤得到的Lyso PC a C18:2、PC aa C 36:6、PCaa C 38:0、PC aa C 38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aa C40:6、PC ae C40:6的相对浓度；C-3代表检测步骤得到的丙酰肉碱的相对浓度；Ach代表检测步骤得到的乙酰胆碱的相对浓度；5-HIAA代表检测步骤得到的5-羟色胺的相对浓度；GABA代表检测步骤得到的γ-氨基酸丁酸的相对浓度；Glu代表检测步骤得到的谷氨酸的相对浓度。
当初次检测结果处于异常截取值(6.0)以上时推断为阳性，不需重新检测；
当初次检测结果位于异常截取值和临界截取值(4.0)之间时为临界结果；对于初次检测为临界结果的样品需要重新检测，当重新测试的检测结果高于异常截取值时为推断阳性，当第二次的检测结果仍然为异常截取值和临界截取值之间时，建议被测试者接受专业AD诊断项目，比如影像学检查。
当初次检测结果低于异常截取值时推断为阴性，不需重新检测。
上述临界截取值和异常截取值，是通过采用上述试剂盒和检测方法对大量正常健康人和AD病患的血浆待测物浓度进行回归分析建模，然后做ROC曲线，并与临床金指标比对后得到截取值。
本发明的相关解释：
表2：多种磷脂酰胆碱/肉碱和神经递质测定试剂盒(串联质谱法)测量的分析物变化情况。
Figure BDA0003310840180000121
注：“↑”代表高于健康人对应值，“↓”代表低于健康人对应值。
使用试剂盒测量到的上述任一分析物或多种分析物(表2)相对于内标品的浓度后，将所测浓度带入模型，得到评估系数Y，然后将Y与临界截取值和异常截取值进行比较，由此可确定被检测者(通常是老年人)是否患有阿尔茨海默病(AD)。表2中的分析物为阿尔茨海默病(AD)血浆标志物。
使用本试剂盒能够对8种磷脂酰胆碱、1种肉碱和4种神经递质同时进行测量。试剂盒内供有用于肉碱的全套内标准品和质控品(表3)，还供应有一套内标准品和质控品用于测量磷脂酰胆碱类和神经递质类物质。这是由于类似结构的磷脂酰胆碱具有相似的性能特征。因此，举例说，PC-14内标准品可以用来校正磷脂酰胆碱系列PC-1，PC-2，PC-3，PC-4，PC-5，PC-6，PC-7和PC-8的浓度，内标DHBA可以用来校正神经递质系列Ach,5-HIAA,GABA和Glu。
本方法假定准确度可能会受影响，但精密度不受影响。表3描述了使用多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质测定试剂盒测量的分析物及其相应的内标准品和质控品。
表3：使用多种磷脂酰胆碱/肉碱和神经递质测定试剂盒测量的分析物及其相应的内标准品和质控品。
Figure BDA0003310840180000131
检测原理
使用本发明的试剂盒对于多种磷脂酰胆碱/肉碱和神经递质的测量过程，包括使用含有内标准品的溶液对血浆样品进行处理以及使用串联质谱(MSMS)系统进行分析。每种分析物与内标准品的响应程度成线性比例关系。
多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质测定试剂盒通过多反应监控(MRM)模式获取数据。在获取数据过程中，每种分析物碰撞诱导后的产物在设定的时间段内被测量。数据采集与处理由系统内的软件包执行。
用于测量的三重-四极杆质谱仪是由计算机控制的设备，可根据离子的质荷(m/z)比对其进行分离与定量测定。每个四极杆都是由四个水平方位的金属杆组成的质量过滤器。通过调节所用的射频(RF)电压可控制这些金属杆周围的磁场，这样就可以根据离子的质荷比来对离子进行过滤。由自动进样器、微型泵与溶剂真空除气装置组成的液相色谱(LC)系统将萃取的样品传递到质谱仪的离子源。离子源能够形成由带电液滴组成的均匀喷雾，离子在溶剂蒸发后从中形成。这些离子被导入质量分析仪中检测(图1)。
在串联质谱系统中，离子穿过一个真空界面。该界面可排除不带电荷的物质并辅助溶剂分子与离子分离。离子穿过界面后就会进入仪器的质量过滤与分析部分。不带电荷的分子由真空系统泵走，聚焦的离子束则被引入第一级四极杆质量过滤器Q1。在Q1里，离子按照各自的质荷比而分离，并进入碰撞室(非质量过滤设备)。带有微量气压的气体被导入碰撞室。穿过碰撞室的离子与气体分子碰撞后，裂解为更小的离子。该过程称为碰撞激活性解离(CAD)。较小的子代离子随后被导入第二级的质量分析仪内(Q3)并根据质荷比进行分离，最终送到检测器内得到信号。
在MRM获取模式中，Q1被设来选择特定的母离子。选择Q1之后，母离子被导入发生碰撞激活性解离(CAD)的碰撞室。母离子碎片化之后，只有指明的产物离子才被允许通过Q3进入检测器。所有未指明的产物离子均被过滤除去。这样，该MSMS MRM质谱检测系统所报告的就是产生需要产物的前体物离子的质荷比(图2)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本实施例为本发明的试剂盒的组成和检测方法。
一、本实施例的试剂盒包括：
内标准品混合溶液：d4-PC-14，浓度为600ng/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；2H3-C-3，浓度为20ng/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；DHBA，浓度为50μg/mL(溶剂为：80％甲醇水)；
高浓度校准品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为30μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；C-3，使用浓度为8μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；Ach和GABA，使用浓度为2.5μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；5-HIAA和Glu，使用浓度为12.5μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；
多浓度水平质控品混合溶液：(1)低质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为1.8μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；C-3，使用浓度为0.48μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；Ach和GABA，使用浓度为0.03μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；5-HIAA和Glu，使用浓度为1.8μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；(2)高质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为22.5μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；C-3，浓度为6μg/ml(溶剂为：甲醇/乙腈9:1)；Ach和GABA，使用浓度为0.75μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；5-HIAA和Glu，使用浓度为9.5μg/ml(溶剂为：80％甲醇水)；
样本萃取液：90％体积比的甲醇，10％体积比的乙腈形成的混合溶液；
流动相溶剂包：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
在本实施例的应用中，每个多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质测定试剂盒含96人份试剂。未开封试剂盒的失效日期标在外部标签上。按照对应标签上的说明储存每一个试剂盒组分。
上述试剂盒的具体组成成分和保质期及存储条件见表4。
表4：多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质测定试剂盒测量的组成结构以及相应储存条件和保质期。
Figure BDA0003310840180000151
二、本实施例的检测方法中所用的仪器和用具如下。
本实施例的试剂盒是由试剂和仪器组成的完整系统的一部分。以下仪器为本试剂盒检测需要的仪器：
1、串联质谱系统-Waters公司的Waters TQDTM三重四极杆质谱仪。
2、还需要其它用具：(1)手动或自动移液器(10–1000μL)，(2)移液吸头，(3)用于测量mL容量试剂的移液器或带刻度量筒，(4)试剂库，(5)化学通风橱，(6)低温高速离心机。
三、本实施例的检测方法包括如下步骤。
步骤一、制备血浆样品
本试剂盒的样本为人血浆，样本的准备方法参照卫生部《WST 225-2002临床化学检验血液标本的收集与处理》中静脉采血和血浆制备的相关要求。具体的样本准备过程和注意事项如下：
(一)静脉采血
1、除卧床病人外，采血一般取坐位或卧位，最好于采血前保持同一体位至少20min，以避免体位变化引起测量结果的变化。
2、用橡皮条勒紧献血者手臂中上部，用75％乙醇消毒采血部位。
3、用含有EDTA抗凝剂的采血管和采血针进行采血部位的静脉采血，采血量根据采血管的规格来确定。
4、采血后，上下缓慢颠倒采血管2到3次，防止血液凝固。
5、做好血样标记，标明采血时间和采血者编号，该编号应当和采血者的临床病例相对应。
(二)血浆样本制备
1、将采血管进行离心，制备血浆。采血管收集血浆后，应该在24小时内离心制备血浆，期间采血管中的血液4℃保存。
2、离心阶段：离心时间5～10min、RCF(以g来表示)为1000～1200g，4℃分离。
3、吸取上清，即为血浆样本，4℃或-20℃存储。
步骤二、样品检测：
1、制备校准曲线工作溶液：在一次检测中，一般情况下稀释一份高水平浓度校准品即可，即利用样本萃取液将高水平浓度校准品按照线性点浓度要求进行连续梯度稀释，直至得到6个线性校准品即可制备成校准曲线工作溶液。
例如：制备6个浓度梯度的校准曲线工作溶液，需要取0.1mL高水平浓度校准品混合溶液，即为线性最高点；取线性最高点0.1mL，用0.1mL的样本萃取溶液进行稀释，即可得到第二个校准线性点；再继续使用样本萃取液对线性最高点进行连续稀释，直至得到另外4个线性校准点。
2、制备质控品工作溶液和内标品工作液：在一次检测中，可直接将本实施例第1部分的多浓度水平质控品混合溶液作为质控品工作液使用，将本实施例第1部分的内标准品混合溶液作为内标工作液使用。
3、96-孔板样本制备：精密移取135μL样本萃取液，分别加入到96孔板的各孔中，每孔再分别加入20μL的待测血浆样品、空白对照、阴性对照、阳性对照)、校准品、质控品，然后向加有上述物质的各孔中再加入45μL的内标工作液(3种混合内标)，密封，混匀2min，室温静置5min，4000rpm离心10min，用移液器吸取上清，加入到另一个96孔板中，密封后上串联质谱仪检测。
本步骤中阴性对照为无AD病史的健康人200例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘，阳性对照为AD患者200例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘。空白对照为生理盐水。
4、将带有封套的微孔板置入串联质谱系统的自动进样器中；该高效色谱流动相溶剂已经事先加入串联质谱系统中。
5、启动相应质谱控制程序，创建工作列表，并使用如上所述的工作参数运行测试并采集数据，系统自动生成PC1-8，C-3，Ach,5-HIAA,GABA和Glu的信号数据。
6、然后根据标准曲线利用每种分析物的信号强度查找相应分析物的浓度，并将每种分析物的浓度除以内标物的浓度，从而得到各种分析物的相对浓度。
每次进行受试者样品检测时一块96孔板中均应包括有：
空白对照；
标准曲线工作液；
低、高质控品工作液；
待测血浆样本；
阳性对照血浆样本；
阴性对照血浆样本。
上述各个物质处理方法应严格按照步骤二样品检测所描述，再进入串联质谱系统的自动进样器，运行，出结果。
步骤三、检测试剂盒性能参数
1、磷脂酰胆碱、酰基肉碱和神经递质精密度结果
根据试剂盒准备提供的两个水平质控品溶液，采用样本萃取液加标方式配制低、中、高值质控品，每个浓度平行制备6份，分别计算测定值的平均值和标准差SD；每个分析批制备和检测1次，以当批次新制备标准曲线换算质控品浓度，连续3批次，通过计算相对标准差(RSD)来评价批内批间精密度，通过相对偏差(RE)来评价批内批间准确度。
表5：PC14批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000171
Figure BDA0003310840180000181
表6：C-3批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000182
表7：Ach批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000183
Figure BDA0003310840180000191
表8：GABA批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000192
表9：5-HIAA批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000193
Figure BDA0003310840180000201
表10：Glu批内和批间精密度准确度评价结果
Figure BDA0003310840180000202
表5-10数据显示，连续3批的精密度和准确度实验数据，PC-14，C-3，Ach,5-HIAA,GABA和Glu批内和批间精密度RSD≤15％，批内批间准确度RE在±20％之间，精密度和准确度评价满足方法学要求。
2、血浆中待测磷脂酰胆碱(PC1-8)、酰基肉碱(C-3)和神经递质精密度评价
使用PC-14在替代基质中的标准曲线标定PC-14内标d4-PC-14的浓度，得到校正因子f。
Figure BDA0003310840180000203
其中，PC-14浓度、d4-PC-14内标浓度是：上机时使用的对应物质的工作液浓度；
PC-14响应、d4-PC-14内标响应是指：液质联用对样本进行分析后获得的相应物质的峰值。
在血浆样本中加入相同浓度的d4-PC-14，使用校正因子f，和待测磷脂酰胆碱(PC1-8响应和d4-PC-14响应值，对待测磷脂酰胆碱(PC1-8)进行定量计算。
Figure BDA0003310840180000211
其中，PC(1-8)是指血浆样本中8种PC中任意一种相对于d4-PC-14内标的相对浓度；PC(1-8)响应是指液质联用对样本进行分析后获得的8种PC中相应PC的峰值。
实际上，可以利用该公式计算PC1至PC8中任意一种磷脂酰胆碱在血浆样本中的浓度，当检测PC1浓度时，该公式中PC(1-8)响应即为PC1响应。
酰基肉碱(C-3)的定量由替代基质中C-3标准曲线及2H3-C-3响应由内标法完成。实验重复三次并计算日内日间RSD％。
表11:血浆中磷脂酰胆碱(PC1-8)批内，批间精密度评价结果
Figure BDA0003310840180000212
Figure BDA0003310840180000221
Figure BDA0003310840180000231
表12:血浆中酰基肉碱(C-3)批内，批间精密度评价结果
Figure BDA0003310840180000232
表13:血浆中个神经递质批内，批间精密度评价结果
Figure BDA0003310840180000233
Figure BDA0003310840180000241
实验结果表明，血浆中PC1-8，C-3，Ach，GABA，5-HIAA和Glu的批内批间RSD％≤15％，均满足方法学评价。
步骤四、结果计算：
将每个样品中的各种分析物的相对浓度使用回归分析法进行分析，带入建模公式：Y＝0.880(PC-1)+1.107(PC-2)+0.664(PC-3)+0.331(PC-4)-0.815(PC-5)-1.552(PC-6)+1.225(PC-7)+0.045(PC-8)-0.503(C-3)+0.367(Ach+5-HIAA)+0.0541(GABA)-1.003(Glu)得到结果。
PC-1至PC-8分别代表检测步骤得到的Lyso PC a C18:2、PC aa C 36:6、PC aa C38:0、PC aa C 38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aa C40:6、PC ae C40:6的相对浓度；C-3代表检测步骤得到的丙酰肉碱的相对浓度；Ach代表检测步骤得到的乙酰胆碱的相对浓度；5-HIAA代表检测步骤得到的5-羟色胺的相对浓度；GABA代表检测步骤得到的γ-氨基酸丁酸的相对浓度；Glu代表检测步骤得到的谷氨酸的相对浓度。
对步骤四中得到的结果与异常截取值(6.0)和临界截取值4.0)进行比对，将上述结果划分为：推断阳性(大于6.0)、推断阴性(小于4.0)、临界(大于等于4.0小于等于6.0)。
对于上述三种结果进行如下处理：
推断阳性：异常截取值(6.0)以上的结果应视为推断阳性。样本检测结果表明为推断阳性时，建议使用原有方法对原有样本进行重新测试。处理及报告推断阳性结果时，请遵守当地规定和指导方针。注意：无论重复测试的原因是初次测试结果为临界或推断阳性，如果重新测试的结果高于异常截取值时，那么结果应视为推断阳性。
临界：位于异常截取值(6.0)和临界截取值(4.0)之间的结果应视为临界结果。对于初次结果为临界的样本，建议使用原有方法对原有样本进行重新测试。
推断阴性：如果标本的全部初次结果都低于所有的临界截取值和异常截取值时，可将结果视为推断阴性(或低风险)并做出相应报告。
实施例2
本实施例为本发明的试剂盒的组成和检测方法。
一、本实施例的试剂盒包括：
内标准品：d4-PC-14，浓度为600ng/ml，2H3-C-3，浓度为20ng/ml；DHBA，浓度为50μg/mL；
高浓度校准品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为30μg/ml；C-3，使用浓度为8μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为2.5μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为12.5μg/ml；
多浓度水平质控品混合溶液：(1)低质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为1.8μg/ml；C-3，使用浓度为0.48μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.03μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为1.8μg/ml；(2)高质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为22.5μg/ml；C-3，浓度为6μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.75μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为9.5μg/ml；
样品萃取液：90％体积比的甲醇，10％体积比的氯仿的混合溶液；
流动相溶剂包：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
上述试剂盒的具体组分、装量、保质期、储存条件、保质期、注意事项与实施例1相同。
二、本实施例的检测方法中所用的仪器和用具与实施例1相同，包括如下步骤：
步骤一、具体操作与实施例1相同。
步骤二、样品检测：具体操作与实施例1相同。
步骤三、具体操作与实施例1相同。
步骤四、结果分析：
实施例2考察了样本萃取液配方对于血浆中待测物质的萃取效果的影响。结果显示，在使用90％体积比的甲醇，10％乙腈混合溶液时，较90％体积比的甲醇，10％氯仿溶液对于血浆中多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的萃取率更高，乙腈较氯仿也更具有操作安全性：
表14:90/10甲醇/乙腈萃取液和90/10甲醇/氯仿萃取液萃取效率结果对比
分析物 90/10甲醇/乙腈 90/10甲醇/氯仿
PC-1 7289.6 5906.4
PC-2 245.3 102.3
PC-3 3220.0 1248.7
PC-4 50231 25637
PC-5 810.5 645.7
PC-6 625.3 444.6
PC-7 16892 10275
PC-8 368.9 210.1
C-3 270.4 205.3
Ach 31.8 14.6
GABA 145.9 105.6
5-HIAA 508.2 441.2
Glu 3012.7 1588.6
实施例3
本实施例为本发明的试剂盒的组成和检测方法。
一、本实施例的试剂盒包括：
内标准品：d4-PC-14，浓度为600ng/ml，2H3-C-3，浓度为20ng/ml；DHBA，浓度为50μg/mL；
高浓度校准品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为30μg/ml；C-3，使用浓度为8μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为2.5μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为12.5μg/ml；
多浓度水平质控品混合溶液：(1)低质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为1.8μg/ml；C-3，使用浓度为0.48μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.03μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为1.8μg/ml；(2)高质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为22.5μg/ml；C-3，浓度为6μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.75μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为9.5μg/ml；
样品萃取液：90％体积比的甲醇与，10％体积比的纯水的混合溶液；
流动相溶剂包：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
上述试剂盒的具体组分、装量、保质期、储存条件、保质期、注意事项与实施例1相同。
二、本实施例的检测方法中所用的仪器和用具与实施例1相同，包括如下步骤：
步骤一、具体操作与实施例1相同。
步骤二、样品检测：具体操作与实施例1相同。
步骤三、具体操作与实施例1相同。
步骤四、结果分析：
实施例3考察了样本萃取液配方对于血浆中待测物质的萃取效果的影响。结果显示，在使用90％体积比的甲醇，10％乙腈混合溶液时，较90％体积比的甲醇，10％纯水溶液对于血浆中多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的萃取率更高：
表15:90/10甲醇/乙腈萃取液和90/10甲醇/纯水萃取液萃取效率结果对比
分析物 90/10甲醇/乙腈 90/10甲醇/纯水
PC-1 7289.6 6400.2
PC-2 245.3 96.8
PC-3 3220.0 1504.7
PC-4 50231 26897
PC-5 810.5 534.2
PC-6 625.3 322.6
PC-7 16892 9853.2
PC-8 368.9 118.7
C-3 270.4 198.5
Ach 31.8 10.6
GABA 145.9 85.8
5-HIAA 508.2 362.7
Glu 3012.7 1084.6
实施例4
本实施例为本发明的试剂盒的组成和检测方法。
一、本实施例的试剂盒包括：
内标准品：d4-PC-14，浓度为600ng/ml，2H3-C-3，浓度为20ng/ml；DHBA，浓度为50μg/mL；
高浓度校准品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为30μg/ml；C-3，使用浓度为8μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为2.5μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为12.5μg/ml；
多浓度水平质控品混合溶液：(1)低质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为1.8μg/ml；C-3，使用浓度为0.48μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.03μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为1.8μg/ml；(2)高质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为22.5μg/ml；C-3，浓度为6μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.75μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为9.5μg/ml；
样品萃取液：90％体积比的甲醇与，10％体积比的乙腈混合得到的溶液；
流动相溶剂包：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
样本稀释液：牛血清白蛋白，＝浓度为40mg/ml溶于PBS，醋酸铵2×10-3mg/ml溶于PBS；
上述试剂盒的具体组分、装量、保质期、储存条件、保质期、注意事项与实施例1相同。
二、本实施例的检测方法中所用的仪器和用具与实施例1相同，包括如下步骤：
步骤一、具体操作与实施例1相同。
步骤二、样品检测：具体操作与实施例1相同。
步骤三、具体操作与实施例1相同。
步骤四、结果分析：
实施例4考察了样本稀释配方对于血浆中待测物质的萃取效果的影响。结果显示，在使用90％体积比的甲醇，10％乙腈混合溶液时，较含牛血清蛋白的稀释液对于血浆中多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的萃取结果因生物基质带来的基质效应干扰更小，萃取率更高：
表16:90/10甲醇/乙腈稀释液和含牛血清蛋白稀释液萃取效率结果对比
Figure BDA0003310840180000281
Figure BDA0003310840180000291
实施例5
本实施例为本发明的试剂盒的组成和检测方法。
一、本实施例的试剂盒包括：
内标准品：d4-PC-14，浓度为600ng/ml，2H3-C-3，浓度为20ng/ml；DHBA，浓度为50μg/mL；
高浓度校准品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为30μg/ml；C-3，使用浓度为8μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为2.5μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为12.5μg/ml；
多浓度水平质控品混合溶液：(1)低质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为1.8μg/ml；C-3，使用浓度为0.48μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.03μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为1.8μg/ml；(2)高质控品混合溶液：PC-14(DMPC)，使用浓度为22.5μg/ml；C-3，浓度为6μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.75μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为9.5μg/ml；
多浓度水平质控品干血片：(1)低质控品干血片：PC-14(DMPC)，使用浓度为2μg/ml；C-3，使用浓度为0.5μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为0.05μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为2.0μg/ml；(2)高质控品干血片：PC-14(DMPC)，使用浓度为25.0μg/ml；C-3，浓度为6μg/ml；Ach和GABA，使用浓度为1.0μg/ml；5-HIAA和Glu，使用浓度为10.0μg/ml；
样品萃取液：90％体积比的甲醇与，10％体积比的乙腈混合得到的溶液；
流动相溶剂包：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
上述试剂盒的具体组分、装量、保质期、储存条件、保质期、注意事项与实施例1相同。
二、本实施例的检测方法中所用的仪器和用具与实施例1相同，包括如下步骤：
步骤一、具体操作与实施例1相同。
步骤二、样品检测：具体操作与实施例1相同；其中质控品干血片由原本萃取液进行萃取。
步骤三、具体操作与实施例1相同。
步骤四、结果分析：
实施例5考察了本发明的检测试剂盒对于干血片质控品的萃取效果。结果显示，在使用本试剂盒中的方法检验干血片中多种磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的萃取结果与血浆样本接近，萃取率均在±15％内：
表17:干血片质控品萃取效率结果
Figure BDA0003310840180000301
检测例1
本检测例是检测实施例1的产品性能指标，包括线性度、重现性、干扰性。本实施例的试剂盒组成、检测方法与实施例1相同。
1、线性度
用试剂盒中包含的样本萃取液稀释高浓度水平校准品，制备一系列的梯度校准品，用实施例1的试剂盒检测样本血浆中待测物浓度，每个血浆样本用试剂盒平行测定3次，求出每个稀释比例的血浆中八种待测物的浓度均值(Yi)。以校准品PC-14的浓度Xi为自变量，以Yi为因变量求出不同待测物的线性回归方程，计算线性回归的相关(r)，确定线性范围(r2≥0.99)，斜率和截距。八种磷脂酰胆碱的线性范围如下表9。
表18：磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的线性范围
Figure BDA0003310840180000302
Figure BDA0003310840180000311
表18的数据表明，各物质在质谱中能检测的范围远大于人体自然环境下的含量，证明本方法在定量、线性方面的可靠性。
2、重现性
用三个不同批次的试剂盒测定高值人血浆(即AD患者的血浆)和低值人血浆(高值人血浆用5vol％牛血清白蛋白溶液稀释10倍)，各重复测定10次，计算测定结果的平均浓度
Figure BDA0003310840180000313
与标准差(SD)，计算批间变异系数(CV，％)，批内变异系数(CV)应不高于30.0％。
表19：磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质的重现性
Figure BDA0003310840180000312
表19的数据说明本发明的试剂盒重现性高，质量稳定，得出的检测结果可信度高。
3、干扰性
干扰性研究中评估了常见的异常标本的潜在影响。选择的异常标本包括脂血和黄疸2种类型。通过使用胆红素(342μmol/L)和三油酸甘油酯(37mmol/L)对正常人血浆进行加样，分别制备黄疸和脂血异常模拟样本，后通过实施例1的试剂盒测试，分析这2种异常样本和阴性样本对照(未加入胆红素和三油酸甘油酯的正常人的血浆)，从而评估这2种异常物质对检测结果的潜在影响，详细结果见表20和表21。
表20：脂血异常样本的干扰评价
Figure BDA0003310840180000321
表21：黄疸异常样本的干扰评价
Figure BDA0003310840180000322
Figure BDA0003310840180000331
由表20和21的数据可见，即使在样本中有血脂异常、黄疸异常的干扰的条件下，本发明的试剂盒依然可以得到较为客观、真实的检测数据；本发明的试剂盒适用范围广，可信度高。
检测例2
辅助诊断是否患有AD的临床试验，采用盲测的方式，受试对象如下：
AD患者：通过Aβ的PET显像(使用11C-PIB和18F-FDDNP作为示踪剂)影像学检测；以及脑脊液中Aβ和tau蛋白的化验确诊的患者，共计50为受试者；
对照组(即正常健康人群)：年龄、性别配对的志愿者(男女各一半，年龄分布在20-50岁之间)，无任何疾病的志愿者，共计50名志愿者。
排除条件：
(a)肾功能衰竭；
(b)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
(c)有颅内出血病史；
(d)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
血浆样品采集、样品预处理以及检测方法和判断标准具体参见实施例1所述。
检测结果：推断阳性的为47例，推断阴性的为53例，其中假阴性3例，假阳性为0例，因此，本发明试剂盒准确度和特异性高，可以辅助诊断是否患有AD疾病。
检测例3
对于无明显症状的AD潜伏者的诊断试验。共400例，连续追踪三年(2013-2016年)，400例人的具体情况参见表22-23。
表22：2013年400例人具体情况
Figure BDA0003310840180000332
Figure BDA0003310840180000341
400例人血浆样品采集、样品预处理以及检测方法和判断标准具体参见实施例1所述步骤及一种现有对比方法。现有对比方法采用蛋白沉淀法提取血浆中多种磷脂酰胆碱和肉碱(丙酰AC、LYSO PC A C18:2、PC AA C-36:6、C16:1-OH、PC AA C-38:0、PC AA C-38:6、PC AA C40:1、PC AA C40:2、PC AA C40:6和PC AE C40:6)，并用质谱法联合多反应监测(MRM)测量其含量，通过LASSO Coefficient analysis(套索系数分析)得到其ROC曲线结果。本方法与现有对比方法比较结果可知，本方法采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，对比现有对比方法无高效液相分离步骤的情况下，能更加有效并准确得定量待测物的含量；本方法还同时测量了4种神经递质在人体血浆中的含量，较单纯测量全部或几种磷脂酰胆碱和肉碱情况下，对于AD预测的准确性有很大的提高，实现AD症状早筛的目的；配合本发明实施例1中的模型，使用LASSO Coefficient analysis(套索系数分析)的得到的ROC曲线结果，对比方法的AUC(Area under the curve)值为0.70，本方法的AUC(Area under thecurve)值为0.88，证明本方法的模型预测性的可靠性和准确性更高,可有效区分潜在AD患者，符合追踪3年后的AD确诊结果。
表23：2016年400例人具体情况
Figure BDA0003310840180000342
对比方法ROC结果参见附图4；本方法ROC结果见图5。

Claims (10)

1.一种用于评估受试者阿尔茨海默症的生物标记组合，其特征在于：包括磷脂酰胆碱类物质、肉碱类物质和神经递质类物质，优选地，所述磷脂酰胆碱类物质选自Lyso PCaC18:2、PC aa C 36:6、PC aa C 38:0、PC aa C 38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aaC40:6、PC ae C40:6中的一种或多种；肉碱类物质为丙酰肉碱；神经递质类物质选自乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸、谷氨酸中一种或多种。
2.如权利要求1所述的生物标记组合，其特征在于：包括丙酰肉碱、Lyso PCa C18:2、PCaa C 36:6、PC aa C 38:0、PC aa C 38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aa C40:6、PC aeC40:6、乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸和谷氨酸。
3.权利要求1至2任一项所述的生物标记组合在制备评估或诊断阿尔茨海默症的诊断产品中的用途，或者权利要求1至2任一项所述的生物标记组合在筛选预防或治疗阿尔茨海默症药物中的用途；
优选地，该诊断产品是诊断试剂、试剂盒或诊断装置。
4.一种用于评估阿尔茨海默症的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2任一项所述的生物标记组合标准品和用于检测受试样品中权利要求1-2任意一项所述生物标记组合含量的试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测受试样品中权利要求1-2任意一项所述生物标记含量的试剂包括：
样品萃取液和液相色谱流动相溶剂包；所述样品萃取液选自甲醇、乙腈、氯仿有机溶剂中的一种或多种；
优选地，所述样品萃取液，按照体积百分比包括：80-95％的甲醇，和5-20％的乙腈；
优选地，所述液相色谱流动相溶剂包，按照体积百分比包括：流动相A：乙腈；和流动相B：含5-20mM醋酸铵和0.05-0.15vol％甲酸的水；
优选地，所述受试样品为来自受试者的血液、血清或血浆。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述生物标记组合标准品包括：磷脂酰胆碱内标品或/和肉碱内标品或/和神经递质内标品；优选所述内标品为磷脂酰胆碱内标品、肉碱内标品和神经递质内标品的混合溶液；
优选地，所述磷脂酰胆碱内标品为d4-PC-14；所述肉碱内标品为2H3-C-3；所述神经递质内标品为3,4-二羟基苄胺；
更优选地，所述内标品的混合溶液中，所述磷脂酰胆碱内标品的浓度为400-800ng/ml，优选为600ng/ml；所述肉碱内标品的浓度为10-30ng/ml，优选为20ng/ml；所述神经递质内标品浓度为40-60μg/mL，优选为50μg/mL。
7.如权利要求4-6任一项所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括：
校准品，用来制作标准曲线，包括磷脂酰胆碱校准品、肉碱校准品和神经递质校准品；优选地，所述磷脂酰胆碱校准品为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，所述肉碱校准品为丙酰左旋肉碱盐酸盐，所述神经递质校准品为乙酰胆碱、5-羟色胺、γ-氨基酸丁酸、谷氨酸；
更优选地，所述校准品为磷脂酰胆碱校准品、肉碱校准品和神经递质校准品的混合溶液，其中，所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为20-40μg/mL；所述丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为6-10μg/mL；所述乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为2-3μg/mL；所述5-羟色胺和谷氨酸的浓度分别为10-15μg/mL。
8.如权利要求4-7任一项所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括质控品，所述质控品包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、丙酰左旋肉碱盐酸盐、乙酰胆碱、5-羟色胺和γ-氨基酸丁酸和谷氨酸；
更优选地，所述质控品为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、丙酰左旋肉碱盐酸盐、乙酰胆碱、5-羟色胺和γ-氨基酸丁酸和谷氨酸的混合溶液；
进一步优选地，所述质控品包括低浓度质控品和高浓度质控品；其中，所述低浓度质控品中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为1-2μg/mL，优选为1.8μg/ml，丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为0.4-0.6μg/mL，优选为0.48μg/ml，乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为0.02-0.04μg/mL，优选为0.03μg/ml，5-羟色胺和谷氨酸的浓度分别为0.6-1.0μg/mL，优选为9.5μg/ml；所述高浓度质控品中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的浓度为20-25μg/mL，优选为22.5μg/ml；丙酰左旋肉碱盐酸盐的浓度为4-8μg/mL，优选为6μg/ml；乙酰胆碱和γ-氨基酸丁酸的浓度分别为1.5-2.5μg/mL，优选为1.8μg/ml；5-羟色胺和谷氨酸的浓度为8-10μg/ml，优选为9.5μg/ml。
9.应用权利要求4-8任一项所述试剂盒进行检测的方法，其特征在于：包括检测步骤和检测结果分析步骤；其中：
所述检测步骤包括：
标准曲线工作液制备步骤：
利用所述样本萃取液将校准品进行连续稀释，得到不同稀释梯度的标准曲线工作液；
质控品工作液和内标工作液的制备步骤：以权利要求8所述低浓度质控品和高浓度质控品作为质控品工作液使用；以权利要求6所述的内标品的混合溶液作为内标工作液使用；
加液步骤：
精密转移样本萃取液到96孔板的小孔中，分别在不同的孔中加入待测血浆样本、校准品工作液以及质控品工作液，然后在加上所述待测血浆样本、所述校准品工作液以及所述质控品工作液的每个小孔中再加入内标工作液，密封混匀，室温静置，离心取上清，加入到另一个96孔板中，密封后上串联质谱仪检测；
检测步骤：
将所述孔板放入高效液相色谱串联质谱系统的进样器，启动控制程序，进行检测；其中所述液相色谱流动相溶剂包已在所述检测步骤之前加入所述高效液相色谱串联质谱系统中；
受试样品中权利要求1-2任一项所述生物标记组合浓度的换算步骤：利用检测步骤对标准曲线工作液的测试结果绘制标准曲线，然后利用检测步骤对受试样品的测试结果和标准曲线得到受试样品中权利要求1-2任一项所述生物标记组合中各种分析物相对于对应内标品的相对浓度；
所述受试样品优选为血浆。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：
所述检测结果分析步骤包括：
通过统计学中Lasso套索回归分析法，建立模型并赋予待测物权重因子，以得出关于使用磷脂酰胆碱、肉碱和神经递质相对含量评估AD风险的综合检测结果，即评估系数Y；其中，所述模型如下：
Y＝0.880(PC-1)+1.107(PC-2)+0.664(PC-3)+0.331(PC-4)-0.815(PC-5)-1.552(PC-6)+1.225(PC-7)+0.045(PC-8)-0.503(C-3)+0.367(Ach+5-HIAA)+0.0541(GABA)-1.003(Glu)，
其中，PC-1至PC-8分别代表检测步骤得到的Lyso PCa C18:2、PC aa C 36:6、PC aaC38:0、PC aa C 38:6、PC aa C40:1、PC aa C40:2、PC aa C40:6、PC ae C40:6的相对浓度；C-3代表检测步骤得到的丙酰肉碱的相对浓度；Ach代表检测步骤得到的乙酰胆碱的相对浓度；5-HIAA代表检测步骤得到的5-羟色胺的相对浓度；GABA代表检测步骤得到的γ-氨基酸丁酸的相对浓度；Glu代表检测步骤得到的谷氨酸的相对浓度。
当受试样品的评估系数Y处于异常截取值以上时推断为阳性；
当受试样品的评估系数Y位于异常截取值和临界截取值之间时为临界结果；对所述受试样品重新检测和分析，再次得到的评估系数Y高于异常截取值时推断为阳性，低于异常截取值时推断为阴性；
当受试样品的评估系数Y低于临界截取值时推断为阴性；
优选地，所述异常截取值为6.0，所述临界截取值为4.0。
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