CN113874722A - 痴呆症或其风险的检查方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于诊断痴呆症或轻度认知障碍的准确且低侵袭性的方法。一种轻度认知障碍或痴呆症的可能性、或痴呆症的风险的检查方法，其中，包括：测定从受试者采集的生物体试样中的脯氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D‑脯氨酸的水平与基准值进行比较的工序。

Description

痴呆症或其风险的检查方法

技术领域

本发明涉及一种使用了D-氨基酸的轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查方法。

背景技术

痴呆症是认知障碍的一种，是由于后天的脑的器质性障碍而导致的原本正常发展的智力不可逆地降低的状态。痴呆症有阿尔茨海默型痴呆症、脑血管性痴呆症、路易体痴呆症、额颞叶型(皮克型)痴呆症等种类，其原因也不同。

目前，在痴呆症的诊断中，除了认知功能测试、基因检查、脑脊髓液中的β淀粉样蛋白或Tau蛋白的代谢组测定、脑成像、行为评价以外，近年来还报告了对血液中的β淀粉样蛋白或Tau蛋白进行测定的方法等，但从准确性、成本方面考虑，未必是实用的。

此外，近年来，伴随痴呆症的早期诊断变得重要，意味着痴呆症的前驱状态的轻度认知障碍(Mild Cognitive Impairment(MCI))这样的状态受到关注，准确地诊断包括作为最初期的轻度认知障碍的痴呆症是重要的，需要开发生物标志物。

另一方面，甘氨酸以外的所有氨基酸中存在D体和L体这2种立体异构体。L-氨基酸是生物的蛋白质的构成要素，蛋白质中所含的氨基酸原则上是L-氨基酸，因此，认为主要是L体的氨基酸参与高等动物的生理活动，但随着近年来的分析技术的进步所带来的分离能力、灵敏度的提高，包括人在内的哺乳类中的D-氨基酸的存在及其作用变得明确。最近报告了健康者中的生物学材料中的D-氨基酸和L-氨基酸的量保持一定的平衡，在某种疾病中存在D-氨基酸与L-氨基酸的平衡的破坏(专利文献1)，在该文献中，还研究了阿尔兹海默病与血液中的D-氨基酸的关系，暗示了在阿尔茨海默病患者中，D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-蛋氨酸、D-白氨酸、D-天冬氨酸、D-苯丙氨酸或D-别异亮氨酸的平衡发生变化。然而，关于D-丝氨酸，暗示脑脊髓液中的D-丝氨酸可以成为早期阿尔茨海默诊断的生物标志物的报告(非专利文献1)、和没有发现脑脊髓液中的D-丝氨酸与阿尔茨海默病或轻度认知障碍的相关性的报告(非专利文献2)混杂存在等，没有得到统一的见解。

专利文献1：日本特开2017-223711号公报

非专利文献1：C Madeira,MV Lourenco,C Vargas-Lopes,CK Suemoto,COBrandao,T Reis,REP Leite,J Laks,W Jacob-Filho,CA Pasqualucci,LT Grinberg,STFerreira and R Panizzutti.,Transl Psychiatry.2015；5:1-9.doi:10.1038/tp.2015.52.Epub 2015May 5.

非专利文献2：Shorena Samakashvili,Clara Ibanez,Carolina Simo,FranciscoJ.Gil-Bea,Bengt Winblad,Angel Cedazo-Minguez,Alejandro Cifuentes.,Electrophoresis.2011；32(19):2757-2764.Doi:10.1002/elps.201100139.Epub 2011Aug29.

发明内容

本发明涉及以下的1)～2)。

1)一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查方法，其中，包括：测定从受试者采集的生物体试样中的脯氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与基准值进行比较的工序。

2)一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查装置，其是用于实施上述1)的检查方法的装置，其中，包括：测定生物体试样中的氨基酸的立体异构体的量的单元；将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的单元；以及基于所述比较来输出所述受检者的病理状态或其风险信息的单元。

附图说明

图1是血清手性氨基酸(D,L-Pro、D,L-Ser、D,L-Ala)的色谱图。

图2是所提取的130名受试者的年龄和MMSE分数。

图3是血清D-氨基酸(D-Pro、D-Ser、D-Ala)的手性平衡与MMSE分数的相关性。

图4是健康对MCI的ROC曲线。

图5是健康对痴呆症的ROC曲线。

图6是纵向队列分析中的血清D-氨基酸(D-Pro、D-Pro×D-Ser)的手性平衡与MMSE评分的相关性。

图7是MMSE与D-Pro的经年变化的关系。

具体实施方式

本发明涉及一种用于诊断轻度认知障碍或痴呆症或其风险的准确且低侵袭性的方法。

本发明人等发现，将轻度认知障碍患者或痴呆症患者的血液中的脯氨酸的立体异构体中的D-脯氨酸的水平作为指标，可以检查轻度认知障碍或痴呆症或其风险，进一步，通过将其与D-丝氨酸、D-丙氨酸的水平组合，可以进行更准确的检查。

根据本发明的方法，可以低侵袭性且简便地检查轻度认知障碍或痴呆症或其风险，认知功能降低的早期变化理解和早期介入变得容易且精确。

在本发明中，“痴呆症”是认知障碍的一种，是由于后天脑的器质性障碍而导致的原本正常发展的认知智能不可逆地降低的状态。通常是由慢性或进行性的脑部疾病引起的，被定义为由记忆、思考、定向、理解、计算、学习、语言和判断等多种高级大脑功能障碍组成的综合征的疾病。

痴呆症已知有阿尔茨海默型痴呆症、脑血管性痴呆症、路易体痴呆症、额颞叶型(皮克型)痴呆症、青少年痴呆症、混合型痴呆症、神经原纤维缠结型老年性痴呆症、嗜银颗粒性痴呆症、额颞叶变性症、进行性核上性麻痹、大脑皮质基底核综合征、头部外伤后遗症、常压脑积水、酒精性痴呆症、慢性硬膜下血肿等种类。在本发明中，只要是呈现所述认知障碍的痴呆症，对其种类没有限定，但优选为阿尔茨海默型痴呆症、脑血管性痴呆症、路易体痴呆症、额颞叶型(皮克型)痴呆症、混合型痴呆症。

此外，“轻度认知障碍”被称为Mild Cognitive Impairment(MCI)，是指记忆力、注意力等脑的认知功能低于正常，但是没有达到痴呆症的水平的痴呆症的前驱状态或者痴呆症的最初期状态。是被定义为与年龄或正常的老化相比认知功能存在问题，但不干扰日常生活且不能判断为痴呆症的各种痴呆症的前阶段或边界区域的状态。例如，在精神状态短期检查(Mini Mental State Examination；MMSE)中，在其分数为21～26分的情况下判定为MCI。MCI如果放任不管的话，有很高的概率引发痴呆症，被认为处于有痴呆症的风险的状态。

在本发明中，“检查”包括痴呆症或轻度认知障碍的有无的检查、痴呆症或轻度认知障碍的症状的发展的检查、痴呆症的风险的检查，优选为痴呆症或轻度认知障碍的有无的检查。在此，“风险的检查”包括将来罹患痴呆症的可能性的有无的检查。“检查”包含“检测”、“判定”或“诊断”的概念，但并不包含医生的诊断等医疗行为。

本发明的轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查方法包括：测定从受试者采集的生物体试样中的脯氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与基准值进行比较的工序。

在本发明中，受试者没有特别限定，例如可以举出记忆障碍、定向障碍、理解·判断力的障碍、失语·失认·失用等痴呆症或具有轻度认知障碍特征的主观症状的患者，优选疑似有痴呆或轻度认知障碍的患者。

在本发明中，生物体试样主要可以列举血液、淋巴液、唾液、尿等体液，优选为血液试样。作为血液试样，例如包含血液(全血)及源自血液的血清、血浆等，但优选为血清。

血液可以从体循环的血管(动脉(外周动脉)、静脉(外周静脉)、毛细血管)或肺循环的血管(肺动脉、肺静脉、肺毛细血管)进行采血，但从采血的简便性的观点出发，优选从体循环的血管、特别是静脉(外周静脉)进行采血。

生物体试样中的脯氨酸的立体异构体量的测定只要可以分离生物体试样中的D-氨基酸和L-氨基酸并进行测定即可，其方法没有限定，通常可以采用使用了将液相色谱(LC)和质谱(MS)组合的LC-MS、LC-MS/MS等的分离定量方法。在此，作为手性氨基酸的分离方法，例如，除了使用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并噁唑(NBD-F)试剂使氨基酸成为NBD衍生物后，利用使用了反相柱(第一维：分子种类分离)和具有担载有手性标识符的固定相的手性柱(第二维：手性分离)的二维液相色谱(LC)法的分离定量(J Chromatogr A.2010Feb 12；1217(7):1056-62.doi:10.1016/j.chroma.2009.09.002.Epub 2009Sep 6)；或使用了1根反相柱(ODS柱)的一维LC法(Anal Chim Acta.2015May 22；875:73-82.doi:10.1016/j.aca.2015.02.054.Epub 2015Feb 23)；对氨基酸进行6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)衍生物化，使用了1根手性柱的一维LC法(J Pharm Biomed Anal.2015Nov10；115:123-9.doi:10.1016/j.jpba.2015.05.024.Epub 2015Jun 16)以外，还已知有对氨基进行AQC衍生物化后，使用连接了具有弱阴离子交换型的固定相的第一手性柱和具有两性离子交换型的固定相的第二手性柱的液相色谱仪进行分离的方法(日本特开2018-100906号公报)，优选使用日本特开2018-100906号公报的方法。

D-脯氨酸的水平可以是D-脯氨酸的含量或组成值，但优选为下式1：[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100所示的脯氨酸的手性平衡，即脯氨酸的D化率。

如后述实施例所示，发现脯氨酸的手性平衡与作为认知功能检查之一通用的MMSE的分数有良好的分类相关，在对痴呆症和轻度认知障碍这两者显示良好的相关性的方面，比丝氨酸和丙氨酸的手性平衡更优异。而且，在组合了脯氨酸的手性平衡和丝氨酸的手性平衡的情况下，确认有更良好的相关性。

因此，通过至少测定脯氨酸的立体异构体的量，将D-脯氨酸的水平与基准值进行比较，可以评价轻度认知障碍或痴呆症的有无和/或痴呆症的风险。进而，同样地测定丝氨酸和/或丙氨酸的立体异构体的量，将D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平与D-脯氨酸的水平适当组合，由此在由D-脯氨酸的水平获得的评价中可以进行更精确的评价。

需要说明的是，D-丝氨酸的水平优选为下式2：[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100所示的丝氨酸的手性平衡，D-丙氨酸的水平优选为下式3：[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100所示的丙氨酸的手性平衡。

作为D-脯氨酸的水平与D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平的组合，例如优选为它们的乘积，具体而言，为下式4：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积、下式5：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积、下式6：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积，优选为式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积。

在本发明中，对D-脯氨酸的水平进行比较的基准值可以由本领域技术人员适当选择，例如可以使用预先设定的临界值。

即，当以脯氨酸的手性平衡或脯氨酸与丝氨酸和/或丙氨酸的手性平衡的乘积作为指标的情况下，当试样中的相同氨基酸的手性平衡大于预先设定的临界值时，可以判定为有痴呆症或轻度认知障碍的存在和/或发病的可能性。

上述临界值可以通过各种统计分析方法求出。例如，例示了MMSE的中央值或平均值、基于ROC曲线分析的值(例如，约登指数(Youden’sindex)、距ROC曲线的左上角坐标(0,1)的距离值等)。也可以设定多个临界值。

例如，在将式1所示的脯氨酸的手性平衡作为指标的情况下，在低于0.38％时可以评价为健康者，在0.38％～0.45％时可以评价为轻度认知障碍者，或者在超过0.45％时可以评价为有痴呆症患者的可能性。

此外，在将式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积作为指标的情况下，在低于0.30％时可以评价为健康者，在0.30％～0.50％时可以评价为轻度认知障碍者，或者在超过0.50％时可以评价为有痴呆症患者的可能性。

此外，在将式5所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积作为指标的情况下，在低于0.20％时可以评价为健康者，在0.20％以上时可以评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性。

此外，在将式6所示的脯氨酸和丝氨酸和丙氨酸的手性平衡的乘积作为指标的情况下，健康者小于0.20％，随着认知障碍的发展有时达到0.20％以上，上升至约0.50％。进一步发展而成为痴呆症时，为0.35％至0.20％之间的值。因此，在以脯氨酸和丝氨酸和丙氨酸的手性平衡的乘积作为指标的情况下，在0.20％以上时，可以评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性，该指标可以作为其他评价方法的辅助来利用。

即，通过将式1所示的脯氨酸的手性平衡作为指标的评价，评价轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性，除此之外，在将式2～式6所示的手性平衡作为指标成为同样的评价结果的情况下，可以评价为该可能性更高。

需要说明的是，本发明也可以与本发明以外的其他痴呆症的诊断组合来使用，可以多方面地评价轻度认知障碍或痴呆症。

本发明的轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查装置是用于实施上述本发明的检查方法的装置，其中，包括：测定生物体试样中的氨基酸的立体异构体的量的单元；将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的单元；以及基于所述比较来输出所述受检者的病理状态或其风险信息的单元。

测定生物体试样中的氨基酸的立体异构体的量的单元具有利用反相柱等的HPLC分离和峰值检测部。作为将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的单元，具有：存储用于求出手性平衡或其乘积的判别式、健康者、痴呆症患者及轻度认知障碍者的基准值等数据的存储部；和基于该数据进行运算处理的运算部。输出病理状态或其风险信息的单元具有病理状态信息选择部及病理状态信息输出部。此外，还包括统一控制整体的CPU等的控制部、与输入装置以及输出装置连接的输入输出接口部、以及与网络可以通信地连接的通信接口部。

关于上述的实施方式，在本发明中还公开了以下的方式。

＜1＞一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查方法，其中，包括：测定从受试者采集的生物体试样中的脯氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与基准值进行比较的工序。

＜2＞根据＜1＞的方法，其中，D-脯氨酸的水平为下式1：[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100所示的脯氨酸的手性平衡。

＜3＞根据＜2＞的方法，其中，在式1所示的脯氨酸的手性平衡小于0.38％的情况下评价为健康者，在式1所示的脯氨酸的手性平衡为0.38％～0.45％的情况下评价为轻度认知障碍者，或者在式1所示的脯氨酸的手性平衡超过0.45％的情况下评价为有痴呆症患者的可能性。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项的方法，其中，还包括：测定生物体试样中的丝氨酸和/或丙氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平的组合与基准值进行比较的工序。

＜5＞根据＜4＞的方法，其中，D-丝氨酸的水平为下式2：[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100所示的丝氨酸的手性平衡，D-丙氨酸的水平为下式3：[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100所示的丙氨酸的手性平衡。

＜6＞根据＜5＞的方法，其中，D-脯氨酸的水平与D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平的组合为下式4：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积、下式5：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积、或者下式6：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积。

＜7＞根据＜6＞的方法，其中，在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积小于0.30％的情况下评价为健康者，在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积为0.30％～0.50％的情况下评价为轻度认知障碍者，或在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积超过0.50％的情况下评价为有痴呆症患者的可能性。

＜8＞根据＜6＞的方法，其中，在式5所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积小于0.20％的情况下评价为健康者，在式5所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积为0.20％以上的情况下评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性。

＜9＞根据＜6＞的方法，其中，在式6所示的脯氨酸和丝氨酸和丙氨酸的手性平衡的乘积小于0.20％的情况下评价为健康者，在式6所示的脯氨酸和丝氨酸和丙氨酸的手性平衡的乘积为0.20％以上的情况下评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性。

＜10＞根据＜1＞～＜9＞中任一项的方法，其中，从受试者采集的生物体试样为血液试样。

＜11＞一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查装置，其中，是用于实施＜1＞～＜10＞中任一项的检查方法的装置，包括：测定生物体试样中的氨基酸的立体异构体的量的单元；将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的单元；以及基于所述比较来输出所述受检者的病理状态或其风险信息的单元。

实施例

以下，示出实施例，更具体地说明本发明。

实施例1人血清中手性氨基酸同时分离分析

(1)关于人试验

以居住在东京都板桥区的65岁以上的高龄女性约1,200名作为对象，进行认知功能与血液成分的关联分析。采集静脉血后，通过离心分离从血液试样采集血清，在-80℃下冷冻保存至下述氨基酸测定。在认知功能评价法中，选择简易精神状态检查(Mini MentalState Examination(MMSE))，事先接受过培训的测试者单独进行了询问。

MMSE由分为11个类别的一系列的提问和课题构成。即，是与时间有关的定向、与场所相关的方向、记忆、注意和计算、再现、称呼、复述、理解、认字、写字、绘画这11个类别。在大多数情况下，MMSE可以在5～10分钟施行。如果所有问题被正确回答，则获得最高评分30分。MMSE的施行和评分可以由接受过临床访谈和行为测定的训练的人进行。MMSE的解释是只有在认知性精神状态检查中完成了相关的学习课题和训练，并且具有资格的专家才能进行的领域(参考株式会社日本文化科学公司MMSE-J使用者指南)。

(2)试样溶液及标准品的制备

将50μL的人血清放入10mL Spitz Glass(商品名：强化硬质螺纹口试管)中，混合甲醇:水(9:1，v/v)溶液450μL后，用离心机(HITACHI制造/CF5RE)在室温下以3000rpm进行离心分离5分钟，由此进行除蛋白，采集上清液的氨基酸。接着，另外将0.2mol/L硼酸缓冲液(pH8.9)、采集溶液、AccQ·Tag Ultra衍生物化试剂即AQC溶液(Waters制造：将AQC粉末以3mg/mL、即10mmol/L的浓度溶解于乙腈)分别按70μL、10μL、20μL(7:1:2)的顺序混合于10mLSpitz Glass中，立即搅拌后，在55℃下加热10分钟，由此制备试样溶液。同样地，依次将0.2mol/L硼酸缓冲液(pH8.9)、100μmol/L D,L-氨基酸标准溶液(氨基酸：Ala/丙氨酸、Arg/精氨酸、Asn/天冬酰胺、Asp/天冬氨酸、Cys/半胱氨酸、Gln/谷氨酰胺、Glu/谷氨酸、Gly/甘氨酸、His/组氨酸、Ile/异亮氨酸、Leu/亮氨酸、Lys/赖氨酸、Met/蛋氨酸、Phe/苯丙氨酸、Pro/脯氨酸、Ser/丝氨酸、Thr/苏氨酸、Trp/色氨酸、Tyr/酪氨酸、Val/缬氨酸、Cit/瓜氨酸、Orn/鸟氨酸、0.2mol/L硼酸缓冲液溶解)、AQC溶液分别以70μL、10μL、20μL(7:1:2)混合，立即搅拌后，在55℃下加热10分钟，由此制备氨基酸标准溶液。

(3)LC-MS/MS分析

将(2)中制备的试样溶液在下述的条件下进行LC-MS/MS分析，进行各种手性氨基酸的分离检测和定量。

(装置)

Exion LC系列(AB SCIEX公司)、质谱仪/QTRAP6500⁺

线性离子阱型(AB SCIEX公司)

(色谱分离)

分离手性柱：将CHIRALPAK QN-AX＜DAICEL公司＞2.1mm内径×150mm、粒径5μm(第一手性柱)及CHIRALPAK ZWIX(+)＜DAICEL公司＞3.0mm内径×150mm、粒径3μm(第二手性柱)按照该顺序串联连接(45℃)

洗脱液：含有0.1％(v/v)甲酸和55mM甲酸铵的甲醇:水(90:10，v/v)溶液

洗脱法：等度洗脱

流动相流量：0.25mL/min

注入量：5μL

(质谱)

离子化法：电喷雾离子化法(ESI)

极性：正离子

气帘气(Curtain Gas，CUR)：30psi

离子喷雾电压(Ionspray voltage，IS)：4500V

温度(Temperature，TEM)：600℃

离子源气体1(Ion Source Gas1，GS1)：80psi

离子源气体1(Ion Source Gas1，GS2)：80psi

碰撞气体(Collision Gas，CAD)：10

(检测模式)

利用在前体离子中设定了质子离子附加分子([M+H]⁺)、在产物离子中设定了AQC碎片离子(m/z＝171)的正离子模式的SRM(选择反应监测，selected reactionmonitoring)检测和利用在产物离子中设定了AQC碎片离子(m/z＝171)的正离子模式的前体离子扫描检测。

(4)数据分析

1)手性氨基酸的分析

将(3)中得到的数据展开为具有保持时间和离子强度这2个轴的色谱图，进行血清中的AQC衍生物化各种手性氨基酸(D,L-Pro、D,L-Ser、D,L-Ala)的分析。代表性的色谱图如图1所示。

判明了均不受干扰成分的影响，除了L-氨基酸以外，还检测出微量的D-氨基酸。在作为伯胺的丝氨酸和丙氨酸中，D体先洗脱，另一方面，在作为仲胺的脯氨酸中，L体先洗脱。

表1中显示了SRM跃迁，在Q1(第一阶段MS)中设定了前体离子，在Q3(第二阶段MS)中设定了产物离子。

[表1]

2)MMSE分数

图2显示了对象者中随机抽取的全部130人的年龄和MMSE分数。将正常认知功能(健康者)分类为27～30分、轻度认知障碍者(MCI)分类为21～26分、疑似痴呆症(痴呆症)分类为20分以下(参考株式会社日本文化科学公司MMSE-J使用者指南)。

3)血清手性氨基酸的手性平衡与MMSE分数的相关性

将由(3)中测得的血清手性氨基酸量(Pro、Ser、Ala)的测定值求出的手性平衡(D化率：D/(D+L)×100(％))与MMSE分数的相关性示于图3中。

判明了脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸的手性平衡及它们的乘积与MMSE分数或健康、MCI、痴呆症分类群相关，确认了参与认知功能。可知D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸分别显示不同的分布。特别是，确认了脯氨酸的手性平衡或者脯氨酸和丝氨酸的手性平衡的乘积与MMSE强相关，可以成为以临床前期为代表的早期认知功能降低风险指标。

(5)有用性验证

使用Excel统计处理软件(Bell Curve for Excel，社会信息服务株式会社)绘制ROC(接受者操作特性，Receiver Operating Characteristic)曲线，分别计算出截止点(Cut off)、ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Sensitivity)和特异度(Specificity)。图4示出健康对MCI的ROC曲线，表2示出健康对MCI的判别特性(Cut off·AUC·Sensitivity·Specificity)，图5示出健康对痴呆症的ROC曲线，表3示出健康对痴呆症的判别特性(Cutoff·AUC·Sensitivity·Specificity)。Cut off设定为离左上角最近的点，在将零假设设为AUC＝0.50的检验中，在组合D-Pro的情况下，成为显著的结果，确认有预测能力。此外，当检验AUC差时，发现在各组之间预测能力有差异。

[表2]

[表3]

实施例2纵向队列中人血清中的手性氨基酸同时分离分析

(1)关于人试验

以居住在东京都板桥区的75岁以上的高龄女性约200名作为对象，进行认知功能和血液成分的纵向队列分析(2008年、2014年、2018年)。采集静脉血后，通过离心分离从血液试样采集血清，在-80℃下冷冻保存至下述氨基酸测定。在认知功能评价法中，选择简易精神状态检查(Mini Mental State Examination(MMSE))和精神状态问卷(Mental StatusQuestionnaire(MSQ))，事先接受过培训的测试者单独进行了询问。

(2)试样溶液及标准品的制备

将25μL的人血清放入10mL Spitz Glass(商品名：强化硬质螺纹口试管)中，混合甲醇:水(9:1，v/v)溶液475μL后，用离心机(HITACHI制造/CF5RE)在冷藏5℃下以3000rpm进行5分钟离心分离，由此进行除蛋白质，采集上清液的氨基酸。接着，另外将0.2mol/L硼酸缓冲液(pH8.9)、采集溶液、AccQ·Tag Ultra衍生物化试剂即AQC溶液(Waters制造：将AQC粉末以3mg/mL、即10mmol/L的浓度溶解于乙腈)分别按70μL、10μL、20μL(7:1:2)的顺序混合于10mL Spitz Glass，立即搅拌后，在55℃下加热10分钟，由此制备试样溶液。同样地，依次将0.2mol/L硼酸缓冲液(pH8.9)、100μmol/L D,L-氨基酸标准溶液(氨基酸：Ala/丙氨酸、Arg/精氨酸、Asn/天冬酰胺、Asp/天冬氨酸、Cys/半胱氨酸、Gln/谷氨酰胺、Glu/谷氨酸、Gly/甘氨酸、His/组氨酸、Ile/异亮氨酸、Leu/亮氨酸、Lys/赖氨酸、Met/蛋氨酸、Phe/苯丙氨酸、Pro/脯氨酸、Ser/丝氨酸、Thr/苏氨酸、Trp/色氨酸、Tyr/酪氨酸、Val/缬氨酸、Cit/瓜氨酸、Orn/鸟氨酸、0.2mol/L硼酸缓冲液溶解)、AQC溶液分别以70μL、10μL、20μL(7:1:2)混合，立即搅拌后，在55℃下加热10分钟，由此制备氨基酸标准溶液。

(3)LC-MS/MS分析

与实施例1同样地，将(2)中制备的试样溶液在下述条件下进行LC-MS/MS分析，进行各种手性氨基酸的分离检测和定量。

(装置)

Exion LC系列(AB SCIEX公司)、质谱仪/QTRAP6500⁺线性离子阱型(AB SCIEX公司)

(色谱分离)

分离手性柱：将CHIRALPAK QN-AX＜DAICEL公司＞2.1mm内径×150mm、粒径5μm(第一手性柱)和CHIRALPAK ZWIX(+)＜DAICEL公司＞3.0mm内径×150mm、粒径3μm(第二手性柱)按照该顺序串联连接(45℃)

洗脱液：含有0.1％(v/v)甲酸和55mM甲酸铵的甲醇:水(90:10，v/v)溶液

洗脱法：等度洗脱

流动相流量：0.25mL/min

注入量：5μL

(质谱)

离子化法：电喷雾离子化法(ESI)

极性：正离子

气帘气(Curtain Gas，CUR)：30psi

离子喷雾电压(Ionspray voltage，IS)：4500V

温度(Temperature，TEM)：600℃

离子源气体1(Ion Source Gas1，GS1)：80psi

离子源气体1(Ion Source Gas1，GS2)：80psi

碰撞气体(Collision Gas，CAD)：10

(检测模式)

利用在前体离子中设定了质子离子附加分子([M+H]⁺)、在产物离子中设定了AQC碎片离子(m/z＝171)的正离子模式的SRM(选择反应监测，selected reactionmonitoring)检测和利用在产物离子中设定了AQC碎片离子(m/z＝171)的正离子模式的前体离子扫描检测。

(4)数据分析

1)手性氨基酸的分析

与实施例1同样地，将(3)中得到的数据展开为具有保持时间和离子强度这2个轴的色谱图，进行AQC衍生物化各种手性氨基酸(D,L-Pro、D,L-Ser)的分析。

2)血清手性氨基酸的手性平衡与MMSE分数的相关性

将根据对象者中随机抽取的23人的各年度的MMSE分数和(3)中测得的血清手性氨基酸量(D,L-Pro、D,L-Ser)的测定值求出的手性平衡的关系示于表4、图6、图7。

[表4]

不仅在横向研究中，在纵向研究中也判明了Pro关联指标(Pro单独手性平衡或者Pro与Ser的多手性平衡)显示出与MMSE分数显著的负相关(图6)，重新确认了对认知功能评价有用(确认了认知功能降低的一方的手性平衡较高)。此外，还判明了不仅可以是评价健康者、轻度认知障碍或痴呆症的状态的指标，还可以评价以各个人为对象的治疗·介入等效果(图7)。例如，如在MMSE一定的情况下手性平衡也一定(No.2)，发现MMSE的变动的情况下手性平衡也变动(No.15)那样，确认了也可以进行MMSE的恢复、即认知功能的恢复评价或预后预测。发现了对认知功能监测的有用性。

Claims (11)

1.一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查方法，其中，

包括：测定从受试者采集的生物体试样中的脯氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与基准值进行比较的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

D-脯氨酸的水平为下式1：[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100所示的脯氨酸的手性平衡。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，

在式1所示的脯氨酸的手性平衡小于0.38％的情况下评价为健康者，在式1所示的脯氨酸的手性平衡为0.38％～0.45％的情况下评价为轻度认知障碍者，或者在式1所示的脯氨酸的手性平衡超过0.45％的情况下评价为有痴呆症患者的可能性。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

还包括：测定生物体试样中的丝氨酸和/或丙氨酸的立体异构体的量的工序；以及将D-脯氨酸的水平与D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平的组合与基准值进行比较的工序。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，

D-丝氨酸的水平为下式2：[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100所示的丝氨酸的手性平衡，D-丙氨酸的水平为下式3：[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100所示的丙氨酸的手性平衡。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，

D-脯氨酸的水平与D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的水平的组合为：下式4：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积、下式5：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积、或者下式6：[[D-脯氨酸量/(D-脯氨酸量+L-脯氨酸量)]×100]×[[D-丝氨酸量/(D-丝氨酸量+L-丝氨酸量)]×100]×[[D-丙氨酸量/(D-丙氨酸量+L-丙氨酸量)]×100]所示的脯氨酸与丝氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，

在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积小于0.30％的情况下评价为健康者，在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积为0.30％～0.50％的情况下评价为轻度认知障碍者，或者在式4所示的脯氨酸与丝氨酸的手性平衡的乘积超过0.50％的情况下评价为有痴呆症患者的可能性。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，

在式5所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积小于0.20％的情况下评价为健康者，在式5所示的脯氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积为0.20％以上的情况下评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，

在式6所示的脯氨酸与丝氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积小于0.20％的情况下评价为健康者，在式6所示的脯氨酸与丝氨酸与丙氨酸的手性平衡的乘积为0.20％以上的情况下评价为有轻度认知障碍者或痴呆症患者的可能性。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，

从受试者采集的生物体试样为血液试样。

11.一种轻度认知障碍或痴呆症或其风险的检查装置，其中，

为用于实施权利要求1～10中任一项所述的检查方法的装置，

包括：测定生物体试样中的氨基酸的立体异构体的量的单元；将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的单元；以及基于所述比较来输出所述受检者的病理状态或其风险信息的单元。

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