CN111537749A - Myh9在制备重度少弱精症诊断试剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于少弱精诊断技术领域，具体涉及MYH9在制备重度少弱精症诊断试剂中的应用。本发明基于蛋白质组学方法，对正常和重度少弱精样本中的蛋白数据进行分析，以BSA蛋白信号强度为标准，检测上述样本中的蛋白丰度获得正常与患病样本中的差异蛋白。本发明通过该方法检测确认MYH9在重度少弱精样本中显著上调，具有良好的可信度，有望作为重度少弱精症的检测标志物，应用于相关检测试剂及试剂盒的开发。

Description

MYH9在制备重度少弱精症诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于少弱精诊断技术领域，具体涉及MYH9作为少精、弱精甚至重度少弱精症诊断标志物或治疗靶点，在制备诊断试剂或治疗少精、弱精及重度少弱精症药物中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
据世界卫生组织调查，15％的育龄夫妇存在不育问题，不育症已成为影响人类健康与社会发展的一个全球性医学和社会问题(Turner,T.T.and J.J.Lysiak,Oxidativestress:a common factor in testicular dysfunction.J Androl,2008.29(5):p.488-98)。根据世界卫生组织的定义，弱精子症是指精液中前向运动的精子少于32％。弱精子症是男性不育的主要原因之一。弱精子症约占男性不育的19％，而少精弱精或畸形弱精子症占男性不育的63％。尽管许多因素如生活方式、环境污染、精索静脉曲张以及感染等可能会导致弱精子症，严重影响人们的生活质量。
根据临床诊断标准，精子活力分为a、b、c、d四个等级：a级表示精子活动极好，呈快速直线向前运动；b级表示精子活动很好，直线向前运动；c级表示精子活动力一般，只向前曲线运动；d级表示精子活动能力差，只在原地蠕动。弱精症是指精液参数中前向运动的精子(a和b级)小于50％或a级运动的精子小于25％的病症，弱精症又称精子活力低下，具体分为三个等级：轻度弱精子症是指a级+b级精子<50％，但>30％或a级精子<25％，但>10％；中度弱精子症是指a级+b级精子<50％，但>30％，其中a级精子<10％；重度弱精子症是指b级+c级精子数量<30％，其中a级精子为零。
少精症是指每毫升精液中精子数目低于2000万的异常表现，当精子密度≦1×10/mL时，则诊断为重度少精症。少精症和弱精症概念不同，在诊断标准上具有差异，但都属于精子的质量问题，发病原因较为相似。针对少弱精症的治疗，目前尚没有有效的药物，多采用滋阴补肾的中药进行治疗。开展对于该疾病的机制研究，有利于早日提出更具有针对性的治疗策略和药物。
目前关于精子蛋白质组的研究有很多。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白。Gaigai Wang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白。络氨酸磷酸化对于精子的运动、获能、超激运动等过程重要作用。Chying-Chyuan Chan等通过对20组正常人和弱精症患者的精子进行蛋白质组学分析发现有12种包括TUBGCP2在内的蛋白发生了过磷酸化。蛋白质是生命活动的分子基础，将疾病状态下异常的或者数量变化极大的特异蛋白作为疾病的生物标志物进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。由于精子样本的易得性，精子成熟后其转录和翻译处于停滞状态，这也为我们在蛋白质水平上研究少弱精子症提供了方便。
发明内容
基于上述研究背景，本发明的目的提供一种基于精子蛋白质组学的重度少弱精蛋白标志物的检测方法与应用。本发明首先对正常和病人精子蛋白进行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)为标准品利用高分辨生物质谱和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白进行深度的质谱分析；然后利用蛋白定量分析方法对质谱数据进行搜索，尽可能大量的鉴定出精子中蛋白质；最后通过正常和病人精子蛋白组的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白，从而将其作为重度少弱精症的蛋白标志物。
基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供MYH9作为生物标志物在制备少精症、弱精症及重度少弱精症诊断试剂中的应用。
本发明通过蛋白质组学方法对正常和重度少弱精患者精子样本中的蛋白相对丰度进行检测，其中MYH9在正常样本和患者样本中的表达差异显著，患者样本中MYH9的表达含量上调三倍之多，证明MYH9与患病情况具有显著的相关性，有望作为重度少弱精症的诊断标志物。
本发明第二方面，提供MYH9作为生物标志物在制备少精症、弱精症及重度少弱精症治疗药物中的应用。
本发明第三方面，提供一种用于重度少弱精症诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括检测精子样本中MYH9含量的试剂。
本发明第四方面，提供一种用于重度少弱精症的药物，所述药物包括调节MYH9表达含量的活性成分。
优选的，所述活性成分为MYH9抑制剂。
本发明第五方面，提供一种重度少弱精症的诊断方法，所述诊断方法包括如下的步骤：提取待检测对象的精子样本，检测所述精子中的MYH9蛋白的检验丰度，所述检验丰度大于0.059时，判定为少弱精患者。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以重度少弱精症的精子样本作为研究对象，对正常样本与患者样本中蛋白的相对丰度进行检测，通过筛选获得具有较高检测价值的差异蛋白。通过质谱数据分析，MYH9在患者样本中表达含量显著上调3.1倍，ROC分析结果显示采用MYH9作为诊断标志物具有良好的诊断效果，应用于个体检测的假阳性概率为14.3％，证明该蛋白是一种具有较高的准确性和诊断价值的标志物。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中MYH9蛋白检测相对丰度的ROC曲线图。
图2为实施例1中健康和少弱精样本中MYH9蛋白检测强度比较图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，本发明提供了MYH9作为重度少弱精症诊断标志物的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一、检测方法
本实施例中，提供了基于精子蛋白质组学对少弱精标志物进行检测的方法，以下实施例中所用样本全部来源于山东大学附属生殖医院，少弱精子症患者样本精子前向运动在7.8％-17.3之间，精子浓度在3.8-14.8百万/mL之间，所述检测方法包括如下步骤：
(1)提取精子细胞全蛋白：将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，14,000g离心20min，取上层蛋白质清液，利用Bradford法测定清液中蛋白浓度；
(2)利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法对蛋白进行酶解：在10KD的超滤管中加入300μg蛋白溶液，600RPM震荡1min,14000g，20min离心,加入100μL8M Urea，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心,并重复一次；加入100μL50mM NH4HCO3，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心，并重复两次；更换超滤管套管，加入1fmol/μg BSA(300μg蛋白应加入19.929ng BSA)，并加入50mM NH4HCO3溶液，使总溶液体积保持在50-60uL，加入胰蛋白酶3-6μg，37℃过夜消化。
(3)对酶解后的肽段进行ziptip法脱盐，制备得到样品混合肽段；
(4)混合肽段的高效液相色谱(HPLC)分离：
A相：2％CH3CN，98％H2O，NH3H2O调pH 10.0；
B相：98％CH3CN，2％H2O。
300μg的混合肽段用80μL A相溶解，样品进样量为80μL。混合肽段溶液于C18XBridge BEH-130柱子上根据其亲水性进行分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min。紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在大约10min时用1.5mL离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，即0.7mL，最终收集90个组分，并按照收集的时间顺序对90个组分编号1～90。将90个组分于SpeedVac中真空干燥。用乙腈水混合液(50％乙腈，50％水)溶解90个组分交叉合并为20个组分，即1,21,41,61和81号五个组分合并为1号组分，2,22,42,62和82号五个组分合并为2号组分，以此类推，最终得到1～20号组分。将最终得到的20个组分于SpeedVac中真空干燥，于-80℃贮存。
(5)纳流液相色谱-串联质谱分析
纳流液相色谱分离：A相：10％CH3CN,90％H2O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH3CN,10％H2O中。
每个样品分别用13.5μL A相溶解，样品进样量为4μL，纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。样品分离之前分别用4μL A相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μm I.D.,C18填料粒径5μm,
Figure BDA0002552886740000051
)，分析柱(30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒径3μm,
Figure BDA0002552886740000052
Figure BDA0002552886740000053
Dr.Maisch GmbH,Germany)。平衡之后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离。150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B100min,32-80％流动相B，20min,80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。经过纳流液相分离的样品直接进入ESI离子喷雾源并进入Orbitrap Elite质谱仪中进行质谱检测。
质谱数据采集：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
(6)质谱数据分析
利用Proteome Discoverer软件把得到的质谱RAW数据转换成MGF文件，并利用Mascot和Maxquant进行Uniprot Human数据库搜索。
Maxquant搜库参数为，蛋白酶：胰蛋白酶(Trypsin)；最多允许遗漏酶切位点：2个；固定修饰：半胱氨酸的烷基化；一级谱搜索误差：20ppm；最小肽段长度：7个氨基酸；肽段、蛋白和蛋白修饰FDR设置为1％。
Maxquant得到的蛋白数据过滤掉污染蛋白和反库蛋白信息进行如下分析：Maxquant搜库得到的蛋白数据以检测特异肽段数(unique peptides>3)进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度。将正常与患病组的蛋白按照其相对检测丰度的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异蛋白。然后利用SPSS软件作出差异蛋白ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，进而判断其诊断价值。
二、实验结果分析
经过质谱数据分析，MYH9蛋白检测特异肽段数36条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著上调3.1倍，p值为1.7E-11<<0.05.
图1中ROC分析显示MYH9蛋白的AUC为0.895>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.059时，灵敏度为81.0％，特异度为85.7％。当进行个体检测时，相对检验丰度大于0.059时，被判为少弱精患者(假阳性率为14.3％)。
图2为MYH9蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.035而在病理样本中为0.111(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地增加。
鉴于上述结果，MYH9蛋白可以作为少弱精子症的潜在特异蛋白标志物，从而对这一病症进行预测。
实施例2临床检测验证
根据实例1的方法首先对收集到的10组少弱精子症患者精子进行蛋白提取和纳流液相色谱-串联质谱分析，每组数据进行三次重复，然后对质谱数据进行分析。表1示出了分析结果，利用上述方法9人被检测出少弱精子症。本组数据准确率高达90％。
表1
Figure BDA0002552886740000061
Figure BDA0002552886740000071
续表
Figure BDA0002552886740000072
续表
Figure BDA0002552886740000073
续表
Figure BDA0002552886740000074
Figure BDA0002552886740000081
续表
Figure BDA0002552886740000082
续表
Figure BDA0002552886740000083
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.MYH9作为生物标志物在制备少精症、弱精症及重度少弱精症诊断试剂中的应用。
2.MYH9作为生物标志物在制备少精症、弱精症及重度少弱精症治疗药物中的应用。
3.一种用于重度少弱精症诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测精子样本中MYH9含量的试剂。
4.一种用于重度少弱精症的药物，其特征在于，所述药物包括调节MYH9表达含量的活性成分。
5.如权利要求4所述用于重度少弱精症的药物，其特征在于，所述活性成分为MYH9抑制剂。
6.一种重度少弱精症的诊断方法，所述诊断方法包括如下的步骤：提取待检测对象的精子样本，检测所述精子中的MYH9蛋白的检验丰度，所述检验丰度大于0.059时，判定为少弱精患者。
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