CN111707748A - 一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用，属于生物医学和分子诊断技术领域。本发明首先对正常和病人精子蛋白进行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)为标准品利用高分辨生物质谱和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白进行深度的质谱分析；然后利用蛋白定量分析方法对质谱数据进行搜索，尽可能大量的鉴定出精子中蛋白质；最后通过正常和病人精子蛋白组的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白，从而将其作为重度少弱精症的蛋白标志物，筛选检测方法目标明确，试验结果准确可靠，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学和分子诊断技术领域，具体涉及一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年来呈上升的趋势。造成男性不育的主要原因是少精弱精症。根据世界卫生组织的定义，弱精子症是指精液中前向运动的精子少于32％。弱精子症是男性不育的主要原因之一。弱精子症约占男性不育的19％，而少精弱精或畸形弱精子症占男性不育的63％。尽管许多因素如生活方式、环境污染、精索静脉曲张以及感染等可能会导致弱精子症。但是遗传因素也是不可忽视的原因。
目前关于精子蛋白质组的研究已有报道。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白。Gaigai Wang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白。蛋白质是生命活动的分子基础，将疾病状态下异常的或者数量变化极大的特异蛋白作为疾病的生物标志物进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。因此，有必要提供一种简单易行、高通量的基于蛋白质组学对少弱精症相关蛋白进行筛选检测。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法及其应用。本发明首先对正常和病人精子蛋白进行提取酶解，然后以牛血清白蛋白(BSA)为标准品利用高分辨生物质谱和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白进行深度的质谱分析；然后利用蛋白定量分析方法对质谱数据进行搜索，尽可能大量的鉴定出精子中蛋白质；最后通过正常和病人精子蛋白组的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白，从而将其作为重度少弱精症的蛋白标志物，筛选检测方法目标明确，试验结果准确可靠，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，所述方法包括：
(1)提取精子细胞全蛋白；
(2)将精子细胞全蛋白利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法进行酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品混合肽段；
(3)对步骤(2)的样品混合肽段采用高效液相色谱(HPLC)进行分离得各分离样品；
(4)将步骤(3)获得的分离的样品采用纳流液相色谱-串联质谱分析；
(5)对质谱数据进行UNIPROT数据库检索，以检测特异肽段数进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度进行筛选，从而得到差异蛋白，从而得到少弱精症相关蛋白标志物。
本发明的第二个方面，提供上述筛选检测方法获得的少弱精症相关蛋白标志物。
所述少弱精症相关蛋白标志物包括但不限于ACPP、ACRBP、AKAP3、AKAP4、AZGP1、SPACA1、PDHA2和TUBA3C。
本发明的第三个方面，提供上述筛选检测方法和/或上述少弱精症相关蛋白标志物在如下1)-3)中任意一项中的应用：
1)诊断少弱精子症；
2)诊断待测者是否为少弱精子症患者；
3)防控少弱精子症。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
(1)上述技术方案首次建立了一种与少弱精子症相关的蛋白标志物的筛选检测方法，通过对大量样本精子蛋白的质谱数据进行分析处理；最后通过正常和病人精子蛋白组中蛋白的比较，得到与少弱精症相关的蛋白，从而将其作为少弱精症的分子标志物。
(2)上述技术方案进一步的对上述筛选方法得到的蛋白标志物进行研究，发现可以通过上述生物标志物的相对检测丰度来诊断少弱精症，为少弱精症提供了诊断和治疗靶点，因此具有良好的实际应用之价值。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中ACPP蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图2为本发明实施例中健康和少弱精样本的ACPP蛋白检测强度比较图。
图3为本发明实施例中ACRBP蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图4为本发明实施例中健康和少弱精样本的ACRBP蛋白检测强度比较图。
图5为本发明实施例中AKAP3蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图6为本发明实施例中健康和少弱精样本的AKAP3蛋白检测强度比较图。
图7为本发明实施例中AKAP4蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图8为本发明实施例中健康和少弱精样本的AKAP4蛋白检测强度比较图。
图9为本发明实施例中AZGP1蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图10为本发明实施例中健康和少弱精样本的AZGP1蛋白检测强度比较图。
图11为本发明实施例中SPACA1蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图12为本发明实施例中健康和少弱精样本的SPACA1蛋白检测强度比较图。
图13为本发明实施例中PDHA2蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图14为本发明实施例中健康和少弱精样本的PDHA2蛋白检测强度比较图。
图15为本发明实施例中TUBA3C蛋白检测相对丰度的ROC曲线。
图16为本发明实施例中健康和少弱精样本的TUBA3C蛋白检测强度比较图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，所述方法包括：
(1)提取精子细胞全蛋白；
(2)将精子细胞全蛋白利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法进行酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品混合肽段；
(3)对步骤(2)的样品混合肽段采用高效液相色谱(HPLC)进行分离得各分离样品；
(4)将步骤(3)获得的分离的样品采用纳流液相色谱-串联质谱分析；
(5)对质谱数据进行UNIPROT数据库检索，以检测特异肽段数进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度进行筛选，从而得到差异蛋白，从而得到少弱精症相关蛋白标志物。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白的具体方法包括：
将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声，置于低温孵育裂解，离心，取上层蛋白质清液，测定清液中蛋白浓度；
本发明的又一具体实施方式中，加入RIPA裂解液超声1～2min；
本发明的又一具体实施方式中，低温孵育裂解具体为：置于冰上孵育20～30min裂解；
本发明的又一具体实施方式中，离心具体方法为：在12,000～15,000g离心10～30min；优选为14,000g离心20min。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(2)中，利用基于超滤辅助样品制备方法对蛋白进行酶解具体为：
在超滤管中加入上述上层蛋白质清液，震荡，离心，加入尿素，继续震荡离心；加入NH4HCO3震荡离心；更换超滤管套管，加入BSA，并加入NH4HCO3溶液，再加入胰蛋白酶，过夜消化。
对酶解后的肽段进行脱盐采用ziptip法进行。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(3)中，高效液相色谱分离具体方法为：
样品混合肽段用A相溶解后过柱分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min；紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在10min时离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，并按照收集的时间顺序对组分编号；将组分真空干燥；用乙腈水混合液(50％乙腈，50％水)溶解并交叉合并，将最终得到的组分真空干燥，低温贮存备用；
本发明的又一具体实施方式中，过柱采用色谱柱为C18 XBridge BEH-130柱，其分离效果更佳。
流动相中，
A相：2％CH3CN，98％H2O，NH3H2O调pH 10.0；
B相：98％CH3CN，2％H2O。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(4)中，采用纳流液相色谱-串联质谱分析具体方法为：
每个样品分别用A相溶解，样品分离之前分别用A相平衡自制的预柱和分析柱；平衡后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离；
150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B100min，32-80％流动相B，20min，80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。
质谱检测条件：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
纳流液相色谱分离：A相：10％CH3CN，90％H2O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH3CN，10％H2O；
纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(5)具体方法为：将质谱数据利用Mascot和Maxquant进行Uniprot Human数据库搜索；
其中，Maxquant搜库参数为，蛋白酶：胰蛋白酶(Trypsin)；最多允许遗漏酶切位点：2个；固定修饰：半胱氨酸的烷基化；一级谱搜索误差：20ppm；最小肽段长度：7个氨基酸；肽段、蛋白和蛋白修饰FDR设置为1％。
Maxquant得到的蛋白数据过滤掉污染蛋白和反库蛋白信息进行如下分析：Maxquant搜库得到的蛋白数据以检测特异肽段数(unique peptides>3)进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异蛋白即少弱精症相关蛋白标志物。
本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(5)还包括：作出差异蛋白ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，判断其诊断价值。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述筛选检测方法获得的少弱精症相关蛋白标志物。
所述少弱精症相关蛋白标志物包括但不限于ACPP、ACRBP、AKAP3、AKAP4、AZGP1、SPACA1、PDHA2和TUBA3C。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述筛选检测方法和/或上述少弱精症相关蛋白标志物在如下1)-3)中任意一项中的应用：
1)诊断少弱精子症；
2)诊断待测者是否为少弱精子症患者；
3)防控少弱精子症。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
本实施例所用样本全部来源于山东大学附属生殖医院，少弱精子症患者样本精子前向运动在7.8％-17.3之间，精子浓度在3.8-14.8百万/mL之间。
一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，包括如下步骤：
(1)提取精子细胞全蛋白：将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，14,000g离心20min，取上层蛋白质清液，利用Bradford法测定清液中蛋白浓度；
(2)利用基于超滤辅助样品制备(FASP)方法对蛋白进行酶解：在10KD的超滤管中加入300μg蛋白溶液，600RPM震荡1min,14000g，20min离心,加入100μL 8M Urea，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心,并重复一次；加入100μL 50mM NH4HCO3，600RPM震荡1min，并14000g，20min离心，并重复两次；更换超滤管套管，加入1fmol/μg BSA(300μg蛋白应加入19.929ng BSA)，并加入50mM NH4HCO3溶液，使总溶液体积保持在50-60uL，加入胰蛋白酶3-6μg，37℃过夜消化。
(3)对酶解后的肽段进行ziptip法脱盐，制备得到样品混合肽段；
(4)混合肽段的高效液相色谱(HPLC)分离：
A相：2％CH3CN，98％H2O，NH3H2O调pH 10.0
B相：98％CH3CN，2％H2O
300μg的混合肽段用80μL A相溶解，样品进样量为80μL。混合肽段溶液于C18XBridge BEH-130柱子上根据其亲水性进行分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min。紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在大约10min时用1.5mL离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，即0.7mL，最终收集90个组分，并按照收集的时间顺序对90个组分编号1～90。将90个组分于SpeedVac中真空干燥。用乙腈水混合液(50％乙腈，50％水)溶解90个组分交叉合并为20个组分，即1,21,41,61和81号五个组分合并为1号组分，2,22,42,62和82号五个组分合并为2号组分，以此类推，最终得到1～20号组分。将最终得到的20个组分于SpeedVac中真空干燥，于-80℃贮存。
(5)纳流液相色谱-串联质谱分析
纳流液相色谱分离：A相：10％CH3CN,90％H2O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH3CN,10％H2O中，每个样品分别用13.5μL A相溶解,样品进样量为4μL，纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。样品分离之前分别用4μL A相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μm I.D.,C18填料粒径5μm,
Figure BDA0002552870910000101
Figure BDA0002552870910000102
)，分析柱(30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒径3μm,
Figure BDA0002552870910000103
Dr.Maisch GmbH,Germany)。平衡之后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离。150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B100min,32-80％流动相B，20min,80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。经过纳流液相分离的样品直接进入ESI离子喷雾源并进入Orbitrap Elite质谱仪中进行质谱检测。
质谱数据采集：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
(6)质谱数据分析：利用Proteome Discoverer软件把得到的质谱RAW数据转换成MGF文件，并利用Mascot和Maxquant进行Uniprot Human数据库搜索。
Maxquant搜库参数为，蛋白酶：胰蛋白酶(Trypsin)；最多允许遗漏酶切位点：2个；固定修饰：半胱氨酸的烷基化；一级谱搜索误差：20ppm；最小肽段长度：7个氨基酸；肽段、蛋白和蛋白修饰FDR设置为1％。
Maxquant得到的蛋白数据过滤掉污染蛋白和反库蛋白信息进行如下分析：Maxquant搜库得到的蛋白数据以检测特异肽段数(unique peptides>3)进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度。将正常与患病组的蛋白按照其相对检测丰度的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异蛋白。然后利用SPSS软件作出差异蛋白ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，进而判断其诊断价值。
实验结果
经过质谱数据分析，筛选到一系列差异蛋白，可以作为与少弱精子症相关的蛋白标志物，列举如下：
(1)ACPP蛋白检测特异肽段数36条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著上调3.8倍，p值为6.4E-06<<0.05。
图1中ROC分析显示ACPP蛋白的AUC为0.822>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.090时，灵敏度为76.2％，特异度为77.8％。当进行个体检测时，相对检验丰度大于0.090时，被判为少弱精患者(假阳性率为22.2％)。
下面比较了ACPP蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图2)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.081而在病理样本中为0.308(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地增加。
(2)ACRBP蛋白检测特异肽段数21条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调4.5倍，p值为5.2E-16<<0.05。
图3中ROC分析显示ACRBP蛋白的AUC为0.951>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.0097时，灵敏度为90.5％，特异度为90.5％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.0097时，被判为少弱精患者(假阳性率为9.5％)。
下面比较了ACRBP蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图4)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.022而在病理样本中为0.005(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
(3)AKAP3蛋白检测特异肽段数7条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调3.8倍，p值为2.6E-10<<0.05.
图5中ROC分析显示AKAP3蛋白的AUC为0.956>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.106时，灵敏度为90.5％，特异度为95.2％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.106时，被判为少弱精患者(假阳性率为4.8％)。
下面比较了AKAP3蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图6)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.225而在病理样本中为0.060(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
(4)AKAP4蛋白检测特异肽段数18条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调3.9倍，p值为2.1E-10<<0.05。
图7中ROC分析显示AKAP4蛋白的AUC为0.961>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.339时，灵敏度为87.3％，特异度为90.5％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.339时，被判为少弱精患者(假阳性率为9.5％)。
下面比较了AKAP4蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图8)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.799而在病理样本中为0.204(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
(5)AZGP1蛋白检测特异肽段数11条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著上调5.5倍，p值为5.2E-06<<0.05。
图9中ROC分析显示AZGP1蛋白的AUC为0.839>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.027时，灵敏度为76.2％，特异度为90.5％。当进行个体检测时，相对检验丰度大于0.027时，被判为少弱精患者(假阳性率为9.5％)。
下面比较了AZGP1蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图10)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.026而在病理样本中为0.143(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地增加。
(6)SPACA1蛋白检测特异肽段数17条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调5.7倍，p值为6.2E-15<<0.05。
图11中ROC分析显示SPACA1蛋白的AUC为0.964>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.0189时，灵敏度为90.5％，特异度为92.1％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.0189时，被判为少弱精患者(假阳性率为7.9％)。
下面比较了SPACA1蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图12)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.050而在病理样本中为0.009(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
(7)PDHA2蛋白检测特异肽段数13条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调4.4倍，p值为5.4E-15<<0.05。
图13中ROC分析显示PDHA2蛋白的AUC为0.959>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.014时，灵敏度为87.3％，特异度为90.5％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.014时，被判为少弱精患者(假阳性率为9.5％)。
下面比较了PDHA2蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图14)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.034而在病理样本中为0.008(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
(8)TUBA3C蛋白检测特异肽段数46条，蛋白可信度高，经比较发现这一蛋白在少弱精样本中显著下调4.2倍，p值为4.5E-13<<0.05。
图15中ROC分析显示TUBA3C蛋白的AUC为0.943>0.7，说明具有较好的诊断效果，在相对检验丰度为0.070时，灵敏度为90.5％，特异度为85.7％。当进行个体检测时，相对检验丰度小于0.070时，被判为少弱精患者(假阳性率为14.3％)。
下面比较了TUBA3C蛋白在健康和少弱精样本的检测相对丰度(图16)，可以看出这一蛋白在健康人样本中相对检测丰度为0.188而在病理样本中为0.045(图中实线)，并且其中位数(虚线)相差较远，说明在少弱精样本中这一蛋白有较大程度地丢失。
应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种筛选检测少弱精症相关蛋白标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提取精子细胞全蛋白；
(2)将精子细胞全蛋白利用基于超滤辅助样品制备方法进行酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品混合肽段；
(3)对步骤(2)的样品混合肽段采用高效液相色谱进行分离得各分离样品；
(4)将步骤(3)获得的分离的样品采用纳流液相色谱-串联质谱分析；
(5)对质谱数据进行UNIPROT数据库检索，以检测特异肽段数进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度进行筛选，从而得到差异蛋白，从而得到少弱精症相关蛋白标志物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白的具体方法包括：
将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声，置于低温孵育裂解，离心，取上层蛋白质清液，测定清液中蛋白浓度；
优选的，加入RIPA裂解液超声1～2min；
低温孵育裂解具体为：置于冰上孵育20～30min裂解；
离心具体方法为：在12,000～15,000g离心10～30min；优选为14,000g离心20min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，利用基于超滤辅助样品制备方法对蛋白进行酶解具体为：
在超滤管中加入上述上层蛋白质清液，震荡，离心，加入尿素，继续震荡离心；加入NH4HCO3震荡离心；更换超滤管套管，加入BSA，并加入NH4HCO3溶液，再加入胰蛋白酶，过夜消化。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对酶解后的肽段进行脱盐采用ziptip法进行。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，高效液相色谱分离具体方法为：
样品混合肽段用A相溶解后过柱分离，流动相梯度设置为：0-3min，100％A相，3-25min，流速始终保持为0.7mL/min；紫外检测器UV设置为214nm，根据样品分离的色谱图，在10min时离心管收集液相分离馏分，每管收集1min，并按照收集的时间顺序对组分编号；将组分真空干燥；用乙腈水混合液溶解并交叉合并，将最终得到的组分真空干燥，低温贮存备用；
优选的，过柱采用色谱柱为C18 XBridge BEH-130柱；
优选的，流动相中，
A相：2％CH3CN，98％H2O，NH3H2O调pH 10.0；
B相：98％CH3CN，2％H2O。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用纳流液相色谱-串联质谱分析具体方法为：
每个样品分别用A相溶解，样品分离之前分别用A相平衡自制的预柱和分析柱；平衡后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离；
150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B 100min，32-80％流动相B，20min，80％流动相B，30min.流速始终保持在300nL/min。
质谱检测条件：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s；
纳流液相色谱分离：A相：10％CH3CN，90％H2O，1％甲酸；B相：1％甲酸溶解在90％CH3CN，10％H2O。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体方法为：将质谱数据利用Mascot和Maxquant进行Uniprot Human数据库搜索；
其中，Maxquant搜库参数为，蛋白酶：胰蛋白酶；最多允许遗漏酶切位点：2个；固定修饰：半胱氨酸的烷基化；一级谱搜索误差：20ppm；最小肽段长度：7个氨基酸；肽段、蛋白和蛋白修饰FDR设置为1％。
Maxquant得到的蛋白数据过滤掉污染蛋白和反库蛋白信息进行如下分析：Maxquant搜库得到的蛋白数据以检测特异肽段数(unique peptides>3)进行初筛，然后以BSA蛋白信号强度为标准，计算每个样本中蛋白的相对检测丰度；将正常个体与少弱精个体的蛋白按照其相对检测丰度的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异蛋白即少弱精症相关蛋白标志物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括：作出差异蛋白ROC曲线，并计算其曲线下面积，判断其诊断价值。
9.权利要求1-8任一项所述筛选检测方法获得的少弱精症相关蛋白标志物；
优选的，所述少弱精症相关蛋白标志物包括ACPP、ACRBP、AKAP3、AKAP4、AZGP1、SPACA1、PDHA2和TUBA3C。
10.权利要求1-8任一项所述筛选检测方法和/或权利要求9所述少弱精症相关蛋白标志物在如下1)-3)中任意一项中的应用：
1)诊断少弱精子症；
2)诊断待测者是否为少弱精子症患者；
3)防控少弱精子症。
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