CN107121540B - 酰基肉碱谱或其检测试剂在2型糖尿病发病风险预测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酰基肉碱或其检测试剂的用途。具体地，本发明通过对2103名居民的长达6年的追踪研究，采用靶向代谢组学策略，确定了酰基肉碱谱特别是长链酰基肉碱可以作为有效的预测2型糖尿病发病风险的标志物，并且能够显著提升传统风险因素对于新发2型糖尿病的预测能力，为临床诊疗进行有利的指导。

Description

酰基肉碱谱或其检测试剂在2型糖尿病发病风险预测中的 应用

技术领域

本发明涉及医学领域，更具体地涉及酰基肉碱谱或其检测试剂在2型糖尿病发病风险预测中的应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。据统计，截止2010年，全球糖尿病患者已达2.85亿，我国20岁以上成年人糖尿病患病率为9.7％，总数达到9420万。

2型糖尿病是目前我国最常见的糖尿病类型，大概超过90％的糖尿病患者都属于2型糖尿病。2型糖尿病的全球流行是造成发达国家和发展中国家的社会经济负担的重要原因。2型糖尿病起病隐匿，早期症状不明显，作为一种可以预防的疾病，早期预测是控制2型糖尿病流行的关键，特别是在那些具有大量前糖或者未诊断糖尿病患者的国家如中国。

近年来，有关糖尿病发病风险的研究逐渐增多，主要针对临床常见的检测指标如血液参数、体质指数等进行分析，取得了一些研究成果。但是，目前本领域还没有建立起简单、可靠的2型糖尿病预测体系。

为了了解2型糖尿病的生物学机制，增加临床预测能力，发现能预测早期病理生理变化的新的生物标记物就显得尤为重要。本领域迫切需要开发能够有效预测2型糖尿病发病风险的生物标志物，建立起简单、可靠的2型糖尿病预测模型。

发明内容

本发明的目的在于提供酰基肉碱谱或其检测试剂在2型糖尿病发病风险预测中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种酰基肉碱或其检测试剂的用途，用于制备检测2型糖尿病或2型糖尿病易感性的试剂或试剂盒；

其中，所述的酰基肉碱为酰基碳原子数≥14的偶数碳的酰基肉碱。

在另一优选例中，所述酰基肉碱的酰基碳原子数为14-22，较佳地为14-20。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱包括酰基肉碱、酰基肉碱衍生物、或其组合。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱衍生物包括羟基酰基肉碱、二羧酸酰基肉碱、或其组合。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱选自下组：C14OH、C14:1OH、C16:1、C16:2、C18、C18OH、C18:1、C18:2、C20、C20:4、或其组合。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱是存在于哺乳动物(如人)血液中的酰基肉碱或在哺乳动物(如人)血液可检测的酰基肉碱。

在另一优选例中，所述的检测包括辅助检测和/或早期检测。

在另一优选例中，所述的检测为血液检测、血浆检测、或血清检测。

在另一优选例中，所述的检测针对的检测样品包括血液样品、血浆样品、或血清样品。

在另一优选例中，所述的检测包括对测试对象进行2型糖尿病发病风险的预测。

在另一优选例中，所述的检测是将来自测试对象的样品的某一酰基肉碱含量A1与正常人群的相应酰基肉碱含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高；

较佳地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.35，较佳地A1/A0≥1.5，更佳地A1/A0≥2.0。

在另一优选例中，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括酰基肉碱的质谱或核磁共振检测试剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括酰基肉碱特异性抗体。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述酰基肉碱特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括点样于测试板上的所述检测试剂以及使用说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括检测配套的样品前处理试剂以及使用说明书。

在另一优选例中，所述的说明书记载了检测方法以及根据A₁值预测2型糖尿病发病风险的方法。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括酰基肉碱的标准品。

在另一优选例中，所述的标准品选自下组：

²H₉-肉碱(D₉-C₀)、²H₃-乙酰肉碱(D₃-C₂)、²H₃-丙酰肉碱(D₃-C₃)、²H₃-丁酰肉碱(D₃-C₄)、²H₉-戊酰肉碱(D₉-C₅)、²H₃-辛酰肉碱(D₃-C₈)、²H₉-十四酰肉碱(D₉-C₁₄)、²H₃-十六酰肉碱(D₃-C₁₆)、或其组合。

在另一优选例中，所述²H₉-肉碱(D₉-C₀)的浓度为152.0nmol/mL

在另一优选例中，所述²H₃-乙酰肉碱(D₃-C₂)的浓度为38.0nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₃-丙酰肉碱(D₃-C₃)的浓度为7.6nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₃-丁酰肉碱(D₃-C₄)的浓度为7.6nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₉-戊酰肉碱(D₉-C₅)的浓度为7.6nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₃-辛酰肉碱(D₃-C₈)的浓度为7.6nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₉-十四酰肉碱(D₉-C₁₄)的浓度为7.6nmol/mL。

在另一优选例中，所述²H₃-十六酰肉碱(D₃-C₁₆)的浓度为15.2nmol/mL。

在另一优选例中，所述的检测包括气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测或核磁共振法(MRI)检测。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还可以包括酰基碳原子数＜14的酰基肉碱或其检测试剂。

在另一优选例中，所述的酰基碳原子数＜14的酰基肉碱选自下组B：C0、C3DC、C4、C5、C5OH、C8:1、C10、C10DC、C12DC、C12、C12OH、C12:1、3-脱羟基肉碱、3-脱氢肉碱、或其组合。

在另一优选例中，当测试的酰基肉碱为选自下组的酰基肉碱：游离肉碱、短链酰基肉碱、长链酰基肉碱、C8:1、C10、C14OH、和C14:1OH时，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高。

在另一优选例中，当测试的酰基肉碱为选自下组的酰基肉碱：肉碱前体、C10DC、C12DC、C12、C12OH、C12:1时，若A1显著低于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高，

较佳地，所述“显著低于”指A0/A1≥1.35，较佳地A0/A1≥1.5，更佳地A0/A1≥2.0。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测2型糖尿病发病风险的试剂盒，其特征在于，包括：

(a)用于检测样品中酰基肉碱含量的试剂，其中所述样品包括血液样品、血浆样品、或血清样品，所述的酰基肉碱包括酰基碳原子数≥14的偶数碳的酰基肉碱；

(b)酰基肉碱标准品；

(c)使用说明书。

在另一优选例中，所述的说明书中注明了本发明第三方面所述的方法。

在另一优选例中，所述的酰基肉碱标准品选自下组：

²H₉-肉碱(D₉-C₀)、²H₃-乙酰肉碱(D₃-C₂)、²H₃-丙酰肉碱(D₃-C₃)、²H₃-丁酰肉碱(D₃-C₄)、²H₉-戊酰肉碱(D₉-C₅)、²H₃-辛酰肉碱(D₃-C₈)、²H₉-十四酰肉碱(D₉-C₁₄)、²H₃-十六酰肉碱(D₃-C₁₆)、或其组合。

在本发明的第三方面，提供了一种检测2型糖尿病发病风险的方法，包括步骤：

(a)提供受试者的测试样品；

(b)测定所述样品中酰基肉碱的含量为A1；

(c)将步骤(b)与正常人群样品的酰基肉碱含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高；

其中，所述的酰基肉碱为酰基碳原子数≥14的偶数碳的酰基肉碱。

在另一优选例中，所述的方法可通过气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、核磁共振(MRI)检测。

在另一优选例中，所述的检测的样品包括血液样品、血浆样品、血清样品。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了血浆酰基肉碱间的相关关系。

图2显示了新发2型糖尿病的ROC预测曲线。图中，蓝色线：传统模型包括年龄、性别、地域、城乡、吸烟、饮酒、体力活动、家族史、BMI、空腹血糖、HbA1c和收缩压，AUC＝0.73(95％CI 0.70-0.76)；红色线：传统模型+特定酰基肉碱，AUC＝0.89(95％CI 0.87-0.90)。

图3显示了预测模型的参数相关性。其中图3A显示了北京与上海预测模型的参数相关性，图3B显示了上海与全人群预测模型的参数相关性，图3C显示了北京与全人群预测模型的参数相关性，图3D显示了全人群的lambda.min与lambda.1se预测模型的参数相关性。

图4显示了北京、上海交叉验证的新发2型糖尿病ROC预测曲线。其中图4A显示了北京参数预测上海新发2型糖尿病的ROC曲线，图4B显示了上海参数预测北京新发2型糖尿病的ROC曲线。图中，模型1：传统模型包括年龄、性别、城乡、吸烟、饮酒、体力活动、家族史、BMI、空腹血糖、HbA1c和收缩压；模型2、3：模型1+特定酰基肉碱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现，酰基肉碱谱特别是长链酰基肉碱可以作为有效的预测2型糖尿病发病风险的标志物。本发明通过对2103名居民的长达6年的追踪研究，采用靶向代谢组学策略，确定了酰基肉碱谱特别是长链酰基肉碱与2型糖尿病发病风险显著相关，可以作为有效的预测2型糖尿病的标志物，并且能够显著提升传统风险因素对于新发2型糖尿病的预测能力，为临床诊疗进行有利的指导。在此基础上，完成了本发明。

酰基肉碱

肉碱(carnitine)是一种类氨基酸，属于季铵阳离子复合物，可以通过生物合成方法从赖氨酸及蛋氨酸两种氨基酸合成产生，在体内与脂肪代谢成能量有关。研究表明，肉碱在转运长链脂肪酸进入线粒体内膜进行β氧化的过程中起到重要作用。

酰基肉碱为肉碱代谢的中间产物，早期被应用于筛选在脂肪酸氧化方面的基因缺陷。目前在肥胖和糖尿病动物中的研究发现酰基肉碱可能反映轻度的脂肪酸氧化障碍和“线粒体应激”。

酰基肉碱根据与其结合的脂酰基的碳链长度可以分为短(碳链≤6)、中(碳链7-14)、长链(碳链≥16)3类。长链脂酰CoA在肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)催化下转变为长链酰基肉碱，转运进入线粒体内膜，并在肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)催化下重新转变为脂酰CoA，进入β氧化。中链酰基肉碱的来源包括长链脂肪酸β氧化的产物，或者中链脂肪酸脂酰化的产物。而短链酰基肉碱尤其是C3和C5则是支链氨基酸的代谢产物。

糖尿病

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。

2型糖尿病是目前我国最常见的糖尿病类型，大概超过90％的糖尿病患者都属于2型糖尿病。2型糖尿病在我国的流行不仅严重地损害了国民健康，同时也将会极大的影响社会经济的发展。研究表明，糖尿病的“烟囱效应”可导致70％的人死于心肌梗塞和中风，10％～20％死于肾衰，50％和10％的患者分别患有神经性病变和视觉受损。我国目前用于心血管和糖尿病治疗的相关费用已占约4％GDP，并将进一步增长。

如本文所用，所述的2型糖尿病患者包括临床确诊的2型糖尿病患者、口服降糖药的患者或空腹血糖≥7.0mmol/L的患者。

检测试剂及检测方法

本发明涉及定量和定性检测人体内酰基肉碱水平。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人体内酰基肉碱水平，可以用于预测2型糖尿病的发病风险。

在本发明中，可采用多种方法对检测试剂-样品之间的反应进行定性或定量检测，优选的方法如气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)检测、液相色谱-串联质谱(LC-MS)、核磁共振法(MRI)检测。

在本发明中，所述酰基肉碱的检测剂包括质谱或核磁检测专用的试剂盒。

一种检测样品中酰基肉碱含量的方法是利用上述提到的质谱分析或核磁共振方法进行酰基肉碱的定性和定量分析。

试剂盒

本发明还提供了一种预测2型糖尿病发病风险的试剂盒。可用于本发明的试剂盒通常包括检测试剂、各种浓度的酰基肉碱标准品和/或预后判断说明书。

其中，所述的说明书中记载了检测方法以及根据不同样品测定值A₁判断AML患者预后的方法。

一种优选说明书中记载的判断预后方法如下：

(a)提供受试者的测试样品；

(b)测定所述样品中的酰基肉碱含量为A1；

(c)将步骤(b)与正常人群样品的酰基肉碱含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高；

较佳地，所述“显著高于”指A1/A0≥1.35，较佳地A1/A0≥1.5，更佳地A1/A0≥2.0。

通常，所述的正常人群的数量为至少100人；较佳地至少300人；更佳地至少500人，最佳地至少1000人。正常人群取自200-2000人的人群。

一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人血液样品、血浆样品。其中，所述的血液或血浆样品可来自于外周血。

本发明中部分相关的酰基肉碱包括下表所示的种类：

本发明所用酰基肉碱标准品包括下表所示的种类：

<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-carnitin	(D<sub>9</sub>-C<sub>0</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-肉碱
			<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-acetylcarnitin	(D<sub>3</sub>-C<sub>2</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-乙酰肉碱
<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-propionylcarnitine	(D<sub>3</sub>-C<sub>3</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-丙酰肉碱
			<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-butyrylcarnitine	(D<sub>3</sub>-C<sub>4</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-丁酰肉碱
<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-valerylcarnitine	(D<sub>9</sub>-C<sub>5</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-戊酰肉碱
			<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-octanoylcarnitine	(D<sub>3</sub>-C<sub>8</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-辛酰肉碱
<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-myristoylcarnitine	(D<sub>9</sub>-C<sub>14</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>9</sub>-十四酰肉碱
			<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-palmitoylcarnitine	(D<sub>3</sub>-C<sub>16</sub>)	<sup>2</sup>H<sub>3</sub>-十六酰肉碱

本发明的主要优点包括：

(a)酰基肉碱能够显著提升传统风险因素对于新发2型糖尿病的预测能力。

(b)酰基肉碱在2型糖尿病风险评估中可以作为新的早期生物标记物。

(c)地域交叉验证表明，含酰基肉碱的检测模型具有通用性，可以用于不同地域的2型糖尿病预测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

1.调查对象

实施例中的调查对象为北京和上海的50-70岁社区居民，对上述对象展开追踪研究，目的是研究环境、遗传因素及其交互作用在代谢性疾病发生发展中的作用。在2005年，通过多级抽样方法招募了3289名调查对象。人口学资料、生活方式和健康信息采用标准化问卷收集。体重、身高和血压采用标准化体检采集，并空腹采集外周静脉血。在2011年，全体调查对象受邀参加6年追踪调查。调查问卷和体检过程在基线调查的基础上略作修改。空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)和胰岛素的检测均采用常规检测方法。

在3289名基线调查对象中有760名失访(23.1％)，其中554名无法联系上，206名拒绝参加。因此，总共有2529名调查对象参加了追踪调查。在排除了331名基线糖尿病患者和95名无酰基肉碱数据的调查对象后，本发明共纳入2103名调查对象。

2.伦理审查

本项研究已通过中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所伦理委员会审查，所有调查对象均签署了知情同意书。

3.酰基肉碱谱检测

实施例中的血浆酰基肉碱谱采用液相色谱-串联质谱联用仪检测。稳定同位素内标(NSK-B Set)购于Cambridge Isotope Laboratories，Inc。高效液相色谱级的乙腈和甲醇购于Merck kGaA。肉碱盐酸盐(C0)，乙酰肉碱盐酸盐(C2)和乙酰氯购于Sigma-Aldrich。1-丁醇购于CNW Technologies GmbH。梯度稀释内标溶液后获得校正曲线[²H₉-carnitin(D₉-C₀)，²H₃-acetylcarnitin(D₃-C₂)，²H₃-propionylcarnitine(D₃-C₃)，²H₃-butyrylcarnitine(D₃-C₄)，²H₉-valerylcarnitine(D₉-C₅)，²H₃-octanoylcarnitine(D₃-C₈)，²H₉-myristoylcarnitine(D₉-C₁₄)和²H₃-palmitoylcarnitine(D₃-C₁₆)](表1)。样品前处理方法参考了Vreken等人的方法。血浆样品和内标溶液混合物离心后(15min，16000rcf，4℃)，上清液氮吹(45℃)。干燥后重新溶解于新鲜配制的1-丁醇/乙酰氯溶液(9:1，v/v)进行丁酯衍生化反应(65℃，15min)，再次氮吹(45℃)。干燥物重新溶解于乙腈/水溶液(4:1，v/v)并且离心(15min，16000rcf，4℃)，上清液用于仪器上样检测。色谱分离采用配置了Waters HSS T3色谱柱(3.0×100mm，3.5μm)的Agilent 1260HPLC系统。质谱检测采用Agilent 6410B QQQ质谱仪，ESI+模式。Agilent MassHunter软件(version B.03.01)用于仪器控制和数据采集。

表1同位素内标的线性和校正曲线。

血浆酰基肉碱浓度根据相应内标的校正曲线计算获得。如果没有相对应的同位素内标，则采用色谱相邻或者结构相近的同位素内标的校正曲线进行计算(表2)。

表2同位素内标检测酰基肉碱谱的动态MRM参数。

4.2型糖尿病定义

新发2型糖尿病定义为至少包含下述一项：1)自报医生诊断患有糖尿病；2)自报服用降血糖药物；3)在追踪调查中空腹血糖≥7.0mmol/L。

5.统计分析

通过协方差分析比较新发2型糖尿病患者和对照的基线血浆酰基肉碱和代谢特征。血浆酰基肉碱和胰岛素通过自然对数变换以趋近正态分布。自然对数变换后的酰基肉碱Z值用于计算短(碳链≤6)、中(碳链7-14)、长链(碳链≥16)3类的浓度。等级相关分析用于计算酰基肉碱之间，以及酰基肉碱与空腹血糖，HbA1c和胰岛素的相关性，P值控制了性别、年龄、地域和城乡。Logistic回归模型用于分析2型糖尿病的相对危险度，并控制了基线的年龄、性别、地域、城乡、吸烟、饮酒、体力活动、家族史、BMI、空腹血糖、HbA1c和收缩压。

弹性网络回归模型(elastic net regression model)(采用R软件glmnet包)用于构建2型糖尿病预测模型(H Zou,T Hastie.Regularization and variable selectionvia the elastic net.J RStatist SocSerB 2005；67(2):301-320.)。由于采用软件预设的lambda.1se(更保守)和lambda.min(更优化)两个参数构建的预测模型的结果类似，在本发明中发明人仅报告了lambda.min的结果。为了获得不偏倚的预测结果，发明人采用了10倍交叉验证。曲线下面积(AUC)用于评估2型糖尿病的预测能力。此外，发明人还采用了区域交叉验证来评估预测过程的稳健性。统计分析采用SAS V9.3和R V3.0软件。双侧P<0.05被认为具有统计学显著性。多重校正采用Bonferroni校正方法。

实施例1

基线特征研究

在6年追踪过程中，共有507名(24.1％)新发2型糖尿病患者。在新发糖尿病患者和对照中进行了基线特征和血浆酰基肉碱浓度的比较(表3)。与对照相比，新发糖尿病患者中北京居民和有糖尿病家族史的更多。他们具有更高的基线BMI，收缩压，空腹血糖，HbA1c和胰岛素(P<0.05)。在基线血浆酰基肉碱方面，新发糖尿病患者具有更高的C0，C3DC，C4，C5，C5OH，C8:1，C10，C14OH，C14:1OH，C16:1，C16:2，C18，C18OH，C18:1，C18:2，C20和C20:4酰基肉碱，同时具有更低的3-dehydroxycarnitine，3-dehydrocarnitine，C7DC，C10DC，C12，C12OH和C12:1酰基肉碱。

表3新发2型糖尿病病例-对照的基线特征和血浆酰基肉碱谱比较。

数据为均值±SD。P值控制了性别、年龄、地域和城乡。*数据没有控制它本身。

数据为几何均数(95％CI)。

校正后显著。

实施例2

酰基肉碱和代谢特征

基线酰基肉碱之间的相关性见图1。尽管多数酰基肉碱之间都有相关性，相关性最高的酰基肉碱(r>0.7)为中长链种类。有趣的是，当分析基线酰基肉碱与代谢特征间的相关性时，发现其与追踪调查的空腹血糖相关性强于与基线空腹血糖的相关性(表4)。同样，基线酰基肉碱与空腹血糖6年变化的相关性也强于与基线空腹血糖的相关性。相反，基线酰基肉碱与HbA1c和胰岛素的相关性在基线调查和追踪调查类似。

表4基线酰基肉碱与空腹血糖、HbA1c和胰岛素的相关性。

控制了性别，年龄，地域和城乡。*P<0.001；

实施例3

2型糖尿病预测模型

在6年追踪过程中，2型糖尿病发病风险与C0，C3DC，中链(C8:1，C10，C14OH，C14:1OH)和长链(C16:1，C16:2，C18，C18OH，C18:1，C18:2，C20，C20:4)酰基肉碱正相关，与肉碱前体(3-dehydroxycarnitine，3-dehydrocarnitine)，中链二羧酸(C10DC，C12DC)和C12(C12，C12OH，C12:1)酰基肉碱负相关(表5)。当酰基肉碱根据链长分类后，仅长链酰基肉碱与2型糖尿病发病风险显著相关(P<0.001)。

表5单个酰基肉碱与2型糖尿病发病风险的关系。

控制了年龄、性别、地域、城乡、吸烟、饮酒、体力活动、家族史、BMI、空腹血糖、HbA1c和收缩压。*Bonferroni校正后显著。

预测模型由弹性网络回归方法构建。在预测模型中，风险因素每增加一个标准差，传统风险模型的2型糖尿病相对危险度为2.48(95％CI 2.20，2.78)，而全模型(包含了传统风险因素和特定酰基肉碱)的2型糖尿病相对危险度为9.41(95％CI 7.62，11.62)，其中6.94(95％CI 5.73，8.41)归因于酰基肉碱(表6)。全模型的参数罗列在表7中。在ROC分析中(图2)，曲线下面积(AUC)从传统模型的0.73(95％CI 0.70-0.76)增加到全模型的0.89(95％CI 0.87-0.90)。

表6新发2型糖尿病的预测模型。

表7新发2型糖尿病预测模型的参数均值。

实施例4

地域交叉验证

在本实施例中，通过地域交叉验证方法，对本发明方法进行验证。

在本实施例中，采用样品和数据是分别来于上海(n＝1110)和北京(n＝993)的样品(样品为6年前预采集的血液样品)，其中包括的正常人和6年间经检测确认2型糖尿病患者的数量分别为909：201(上海)和687：306(北京)。

地域交叉验证用于检验预测模型是否能应用于其他地域。在根据地域分层后，运用弹性网络模型构建的北京和上海预测全模型进行交叉验证(图4)。其中用上海全模型预测北京2型糖尿病发病风险的AUC为0.82(95％CI0.79-0.84)，用北京全模型预测上海2型糖尿病发病风险的AUC为0.87(95％CI0.85-0.90)。比较预测模型的参数时发现上海、北京或全人群的参数较为一致，运用lambda.min或lambda.1se参数的预测模型也较为一致(图3)。

下表总结了部分酰基肉碱含量变化与2型糖尿病患病风险间的关系

注：显著上升是指将来自测试对象的样品的某一酰基肉碱含量A1与正常人群的相应酰基肉碱含量A0相比较，不仅A1大于阈值且A1/A0≥1.35，较佳地A1/A0≥1.5，更佳地A1/A0≥2.0。

讨论

本发明通过采用液相色谱-串联质谱联用仪检测酰基肉碱谱，发现特定酰基肉碱(尤其是长链种类)与2型糖尿病发病风险显著相关，并且能够显著提升传统风险因素(如BMI和空腹血糖等)对于新发2型糖尿病的预测能力。

基于精确性较高的靶向代谢组学手段，本发明首次发现酰基肉碱能够预测2型糖尿病的发病风险。本发明发现，在预测模型中加入特定酰基肉碱，能够显著提升传统风险因素(如BMI和空腹血糖等)对于2型糖尿病的预测能力(AUCs:0.89vs.0.73，图2)。因此，作为体内检测线粒体FAO障碍的简单替代方法，特定酰基肉碱有可能作为预测2型糖尿病发病的早期生物标记物。

本发明发现，大多数长链酰基肉碱均与新发2型糖尿病风险升高有关。长链脂肪酸主要在线粒体内进行氧化。长链脂酰CoA在肉碱棕榈酰转移酶I(CPT1)催化下转变为长链酰基肉碱，转运进入线粒体内膜，并在肉碱棕榈酰转移酶II(CPT2)催化下重新转变为脂酰CoA，进入β氧化。作为β氧化的早期指标，长链酰基肉碱的累积可能反映了较为严重的FAO障碍和线粒体过载。此外，长链酰基肉碱还能调节心脏组织的钙外流和肾脏细胞hERG通道。因此，除了作为线粒体功能障碍的指标，长链酰基肉碱可能还有其他生理功能。

与长链酰基肉碱不同，中链酰基肉碱与糖尿病的关系并不一致。可能的解释为中链酰基肉碱的来源包括长链脂肪酸β氧化的产物，或者中链脂肪酸脂酰化的产物。事实上，以前的某些研究中观察到了中链脂肪酸具有促炎性作用，但在另一些研究中则观察到了中链脂肪酸的抗菌和抗炎作用。因此，中链酰基肉碱在代谢紊乱疾病中所起的作用仍有待阐明。另一方面，左旋肉碱前体3-dehydroxycarnitine和3-dehydrocarnitine，在本发明中与2型糖尿病发病风险降低有关。

另一项有趣发现是奇数碳与偶数碳的二羧酸酰基肉碱与2型糖尿病的风险关联不同。丙二酰肉碱(C3DC)是反映丙二酰CoA水平的指标。丙二酰CoA可以通过抑制线粒体CPT1和脂肪酸氧化来调控哺乳动物的能量代谢。值得注意的是，胰岛素抵抗的肥胖和2型糖尿病患者具有较高的肌肉丙二酰CoA水平。然而，目前仍不清楚丙二酰CoA的积累(表现为C3DC水平升高)，是否体现了机体对于过量β氧化和线粒体应激的负反馈调节，从而通过抑制CPT1活性来实现底物从脂肪酸向葡萄糖转变，进而缓解脂肪诱导的胰岛素抵抗。尽管如此，本发明中的C3DC与糖尿病发病风险的正相关关系仍提示了丙二酰CoA在糖尿病发病过程中的作用。与奇数碳不同，偶数碳二羧酸来源于脂肪酸的ω氧化，并进一步进入β氧化。干预研究发现，癸二酸和十二烷二酸能够改善2型糖尿病患者的血糖控制和能量利用。与这些研究一致，本发明观察到的C10DC和C12DC酰基肉碱与2型糖尿病发病负相关关系，进一步支持了癸二酸和十二烷二酸对于2型糖尿病的改善作用。

本发明采用的弹性网络回归模型在高维数据的预测准确性方面具有优势。此外，本发明结果在北京和上海这两个生活方式和环境因素均不同的大城市进行了交叉验证。

总之，本发明发现酰基肉碱能够显著提升传统风险因素对于新发2型糖尿病的预测能力，提示酰基肉碱在2型糖尿病风险评估中可以作为新的早期生物标记物。这表明，基于本发明特定酰基肉碱的含量，可以辅助性地预先评估对象患2型糖尿病的风险。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种酰基肉碱或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备检测2型糖尿病或2型糖尿病易感性的试剂或试剂盒；

其中，所述的酰基肉碱为酰基碳原子数≥14的偶数碳的酰基肉碱，

并且所述的酰基肉碱选自下组：C14:1OH、C16:1、C16:2、C18OH、或其组合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂或试剂盒中还包括选自下组的酰基肉碱：C14OH、C18、C18:1、C18:2、C20:4、C20，或其组合。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测包括辅助检测和/或早期检测。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测为血液检测、血浆检测、或血清检测。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是将来自测试对象的样品的某一酰基肉碱含量A1与正常人群的相应酰基肉碱含量A0相比较，若A1显著高于A0，则说明测试组2型糖尿病的发病风险较高，其中，所述“显著高于”指A1/A0≥1.35。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，A1/A0≥1.5。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，A1/A0≥2.0。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括酰基肉碱的质谱或核磁共振检测试剂。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括酰基肉碱的标准品。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的标准品选自下组：

²H₉-肉碱(D₉-C₀)、²H₃-乙酰肉碱(D₃-C₂)、²H₃-丙酰肉碱(D₃-C₃)、²H₃-丁酰肉碱(D₃-C₄)、²H₉-戊酰肉碱(D₉-C₅)、²H₃-辛酰肉碱(D₃-C₈)、²H₉-十四酰肉碱(D₉-C₁₄)、²H₃-十六酰肉碱(D₃-C₁₆)、或其组合。

11.一种用于检测2型糖尿病发病风险的试剂盒，其特征在于，包括：

(a)用于检测样品中酰基肉碱含量的试剂，其中所述样品包括血液样品、血浆样品、或血清样品，所述的酰基肉碱包括酰基碳原子数≥14的偶数碳的酰基肉碱，并且所述的酰基肉碱选自下组：C14:1OH、C16:1、C16:2、C18OH、或其组合；

(b)酰基肉碱标准品；

(c)使用说明书。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述(a)中，所述试剂中还包括对选自下组的酰基肉碱的检测试剂：C14OH、C18、C18:1、C18:2、C20:4、C20，或其组合。

13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的酰基肉碱标准品选自下组：

²H₉-肉碱(D₉-C₀)、²H₃-乙酰肉碱(D₃-C₂)、²H₃-丙酰肉碱(D₃-C₃)、²H₃-丁酰肉碱(D₃-C₄)、²H₉-戊酰肉碱(D₉-C₅)、²H₃-辛酰肉碱(D₃-C₈)、²H₉-十四酰肉碱(D₉-C₁₄)、²H₃-十六酰肉碱(D₃-C₁₆)、或其组合。

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