CN117092347A - 一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用 - Google Patents

一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用，包括蛋白标志物与代谢物标志物，所述蛋白标志物包括H3C15、PSAP、NCAM2与LAMB2；所述代谢物标志物包括甘氨胆酸与6‑甲基烟酰胺；通过比较PD无认知障碍、轻度认知障碍和痴呆患者的血浆蛋白质组学和代谢组学特征，确定认知障碍的候选生物标志物，结果使用机器学习模型进行分析，并在独立队列中进行验证；通过机器学习模型综合蛋白质组学和代谢组学识别了帕金森病认知障碍的潜在生物标志物，开发了一种高性能、微创的血液检测方法来筛查和监测PD患者的认知能力下降，并为未来的治疗开发提供了多种蛋白质靶点。

Description

一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson disease，PD)患者普遍存在认知障碍(cognitiveimpairment,CI)，PD伴认知功能障碍可以分为PD伴轻度障碍(PD with mild impairment,PDMCI)和PD相关性痴呆(PD-related dementia,PDD)。有证据表明，帕金森在诊断时大部分患者就已经出现了轻度认知功能障碍症状，并在未来会快速发展为痴呆。早期识别PD患者认知功能障碍可以提高帕金森患者的预后和临床管理。PDCI的预测因子可以基于患者的临床特征(运动和非运动症状)。然而，临床特征缺乏作为可靠分层方法所需的敏感性和特异性，无法据此准确的预测患者的认知风险。此外，与神经影像相关的研究指出认知功能障碍障碍的PD患者在T1 MRI上的颞顶叶出现萎缩，并在许多后续研究中都得到了验证。另外，研究表明通过使用FDG-PET发现内侧额叶和顶叶区域的代谢减退与执行和记忆功能受损有关。后来，受阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)研究的启发，Montine等人研究显示与患有PD非痴呆患者和健康人相比，PDD患者的Aβ1-42浓度降低，总tau和p-tau增加(AD的病理变化)或正常。然而，在最近的一项研究中，Chiu等人发现血浆Aβ1-42和p-tau在AD中增加但在PD中没有增加(即使在PDCI亚组中)。此外，研究发现血浆神经丝轻链蛋白(Neurofilament light chain protein,NfL)可能是PDCI的有效生物标志物，并能预测从PD-MCI到PDD的临床转化，而NfL在AD和其他认知障碍疾病中也会升高。因此，很容易承认那些与AD相关的标志物与PDCI有着密切的关系。然而，由于这两种神经退行性疾病具有不同的病理机制，迫切需要开发新的药物来治疗PD。因此，迫切需要一种生物标志物，尤其是血源性的生物标志物来预测和早期识别PD患者认知功能障碍，为新药开发提供新思路和依据。
蛋白质组学和代谢组学是筛查疾病血浆和脑脊液标志物的有力工具。在临床工作中，检测血液或脑脊液是方便的，且与神经影像学相比，结果更为客观。蛋白质组学研究已经确定了与路易体痴呆和多发性硬化症的潜在生物标志物，以及区分AD内表型的血浆蛋白。此外，一些研究小组已经确定了PD患者与健康对照组之间的蛋白质组学和代谢组学差异。然而，尚不清楚认知障碍是否与PD患者蛋白质组学和代谢组学的变化也有关。
针对上述问题，本发明提出一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用，通过比较PD无认知障碍、轻度认知障碍和痴呆患者的血浆蛋白质组学和代谢组学特征，确定认知障碍的候选生物标志物，结果使用机器学习模型进行分析，并在独立队列中进行验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种帕金森病认知障碍的生物标志物及应用，通过机器学习模型综合蛋白质组学和代谢组学识别了帕金森病认知障碍的潜在生物标志物，开发了一种高性能、微创的血液检测方法来筛查和监测PD患者的认知能力下降，为未来的治疗开发提供了多种蛋白质靶点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种帕金森病认知障碍的生物标志物，包括蛋白标志物与代谢物标志物，所述蛋白标志物包括H3C15、PSAP、NCAM2与LAMB2；所述代谢物标志物包括甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺。
进一步的，所述H3C15表达水平与认知障碍风险呈正相关，所述PSAP、NCAM2与LAMB2的表达水平认知障碍风险呈负相关；所述甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺表达水平与认知障碍风险呈正相关；
另一方面，本发明提出上述蛋白标志物的识别方法，包括以下步骤：
S1：收集血液样本并分为开发队列与验证队列的两个独立队列；
S2：对开发队列中的血浆进行蛋白质组学和代谢组学分析
S3：使用机器学习模型识别PDCI的候选蛋白质和代谢物生物标志物；
S4：在验证队列中,使用平行反应监测质谱分析方法来验证机器学习模型所选择的蛋白质标志物。
基于开发队列，机器学习模型中确定了25个候选的蛋白质标记物，其中包括排名最高的PSAP和H3C15，用这两个蛋白构建的分类器的曲线下面积(area underthe curve，AUC)值为0.99。排名最高的代谢产物标记物为甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺，两个代谢物构建的分类器AUC值为0.99。在验证队列中，使用H3C15和PSAP构建的分类器AUC为0.765，与NCAM2和LAMB2联合构建的分类器AUC为0.956。
另一方面，本发明提出一种帕金森病认知障碍分型的分类器，其利用蛋白标志物或代谢物标志物对帕金森病认知障碍进行分型，所述帕金森病认知障碍分型包括帕金森病伴认知正常PDNC、帕金森病伴轻度认知功能障碍PDMCI及帕金森病伴痴呆PDD。
进一步的，所述分类器包括H3C15和PSAP。
进一步的，所述分类器包括H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2。
进一步的，所述分类器包括甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺。
另一方面，本发明提出上述生物标志物于识别帕金森病认知障碍的应用。
另一方面，本发明提出上述分类器于帕金森病认知障碍分型的应用。
本发明的有益效果：
1.提高帕金森病患者认知功能障碍的预测能力：本方案通过比较PD患者的临床特征、血浆蛋白质组学和代谢组学特征，鉴定了与PD伴认知功能障碍相关的候选生物标志物。这些生物标志物包括蛋白标志物(如H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2)和代谢物标志物(如甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺)。通过使用机器学习模型分析这些标志物，可以提高对PD患者认知功能障碍风险的准确预测能力。这对于早期识别PD患者的认知功能障碍，提高预后和临床管理具有重要意义。
2.提供新的药物开发思路和依据：本方案的生物标志物研究为PD的治疗提供了新的药物开发思路和依据。通过研究PD患者的蛋白质组学和代谢组学变化，可以发现与认知功能障碍相关的蛋白靶点。这些蛋白靶点可以成为新药物的研发目标，用于改善PD患者的认知功能，并提供更有效的治疗策略。
3.开发高性能、微创的血液检测方法：本方案通过蛋白质组学和代谢组学分析，提供了一种高性能、微创的血液检测方法来筛查和监测PD患者的认知能力下降。与传统的神经影像学方法相比，血液检测方法更为方便、快速和客观。这种方法可以广泛应用于临床实践中，为PD患者的认知功能障碍提供更早的诊断和监测手段。
4.提供帕金森病认知障碍的分型指导：本方案通过识别蛋白质标志物和代谢物标志物，可以开发帕金森病认知障碍的分类器，进一步将患者分为不同的亚组，如PD伴认知正常(PDNC)、PD伴轻度认知功能障碍(PDMCI)和PD伴痴呆(PDD)。这有助于更准确地了解患者的认知功能障碍程度，并为个体化的治疗和管理提供指导。例如，对于PDD患者，可能需要采取更积极的治疗策略，以延缓认知功能的进一步恶化。
总之，本技术方案通过综合蛋白质组学和代谢组学的方法，识别了与PD认知功能障碍相关的生物标志物，并提供了预测、治疗和管理PD认知功能障碍的新思路和依据。这对于改善PD患者的临床管理、预后和生活质量具有重要的应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为开发队列中，健康对照组(healthy controls,C)与帕金森认知正常组(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)、帕金森轻度认知障碍组(Parkinsondisease withmild impairment,PDMCI)和帕金森痴呆组((Parkinson disease withdementia,PDD)患者的血浆蛋白质组学谱的比较；
图2为开发队列中，健康对照组(healthy controls,C)、帕金森认知正常组(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)、帕金森轻度认知障碍组(Parkinsondisease withmild impairment,PDMCI)和帕金森痴呆组((Parkinson disease withdementia,PDD)之间差异表达蛋白的MFUZZ聚类；
图3为开发队列中，健康对照组(healthy controls,C)、帕金森认知正常组(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)、帕金森轻度认知障碍组(Parkinsondisease withmild impairment,PDMCI)和帕金森痴呆组((Parkinson disease withdementia,PDD)之间差异表达蛋白的MFUZZ聚类；
图4为开发队列中采用加权基因相关网络分析，以确定蛋白质模块以及这些模块中蛋白质表达与帕金森病临床特征之间的相关性；
图5为开发队列中帕金森认知正常组(Parkinson disease with normalcognitive,PDNC)、帕金森轻度认知障碍组(Parkinson disease with mild impairment,PDMCI)和帕金森痴呆组((Parkinson disease with dementia,PDD)患者的蛋白质组学和代谢组学改变的相关性；
图6为帕金森认知正常患者(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)和帕金森轻度认知障碍组或帕金森痴呆组(Parkinson disease with mild impairmentor dementia,PDMCI_PDD)样本的Umap图；
图7为在开发队列中基于机器学习识别帕金森病患者认知障碍生物标志物(区分帕金森认知正常患者(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)和帕金森轻度认知障碍组或帕金森痴呆组(Parkinson disease with mild impairment ordementia,PDMCI_PDD)；
图8为验证队列中蛋白质生物标志物的质谱验证(帕金森认知正常患者(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)和帕金森轻度认知障碍组或帕金森痴呆组(Parkinson disease with mild impairment or dementia,PDMCI_PDD)比较)；
图9为开发队列中NCAM2和LAMB2血浆水平的比较(帕金森认知正常患者(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)和帕金森轻度认知障碍组或帕金森痴呆组(Parkinson disease with mild impairment or dementia,PDMCI_PDD)比较)；
图10为(A)开发队列和(B)验证队列中GCLC的血浆水平(帕金森认知正常患者(Parkinson disease with normal cognitive,PDNC)和帕金森轻度认知障碍组或帕金森痴呆组(Parkinson disease with mild impairment or dementia,PDMCI_PDD)比较)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例所述的一种帕金森病认知障碍的生物标志物，包括蛋白标志物与代谢物标志物，所述蛋白标志物包括H3C15、PSAP、NCAM2与LAMB2；所述代谢物标志物包括甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺。
在本实施例中，所述H3C15表达水平与认知障碍风险呈正相关，所述PSAP、NCAM2与LAMB2的表达水平认知障碍风险呈负相关。
在本实施例中，所述甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺表达水平与认知障碍风险呈正相关；
另一方面，本发明提出上述蛋白标志物的识别方法，包括以下步骤：
S1：收集血液样本并分为开发队列与验证队列的两个独立队列；
S2：对开发队列中的血浆进行蛋白质组学和代谢组学分析
S3：使用机器学习模型识别PDCI的候选蛋白质和代谢物生物标志物；
S4：在验证队列中,使用平行反应监测质谱分析方法来验证机器学习模型所选择的蛋白质标志物。
基于开发队列，机器学习模型中确定了25个候选的蛋白质标记物，其中包括排名最高的PSAP和H3C15，用这两个蛋白构建的分类器的曲线下面积(area underthe curve，AUC)值为0.99。排名最高的代谢产物标记物为甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺，两个代谢物构建的分类器AUC值为0.99。在验证队列中，使用H3C15和PSAP构建的分类器AUC为0.765，与NCAM2和LAMB2联合构建的分类器AUC为0.956。
另一方面，本发明提出一种帕金森病认知障碍分型的分类器，其利用蛋白标志物或代谢物标志物对帕金森病认知障碍进行分型，所述帕金森病认知障碍分型包括帕金森病伴认知正常PDNC、帕金森病伴轻度认知功能障碍PDMCI及帕金森病伴痴呆PDD。
在本实施例中，所述分类器包括H3C15和PSAP。
在本实施例中，所述分类器包括H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2。
在本实施例中，所述分类器包括甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺。
另一方面，本发明提出上述生物标志物于识别帕金森病认知障碍的应用。
另一方面，本发明提出上述分类器于帕金森病认知障碍分型的应用。
实施例2
2.材料和方法
2.1研究对象
在获得当地机构伦理审查委员会的批准下，本研究对来自两个独立队列的血浆样本进行了分析。所有的参与者都提供了知情同意书，所有临床实验均根据赫尔辛基宣言原则进行。在昆明医科大学第一附属医院招募对照组(Controls,C)、PD伴认知正常组(PDwith normal cognitive,PDNC)、PD伴轻度认知功能障碍组(PD with mild cognitiveimpairments,PDMCI)，以及PD痴呆组(PD with dementia,PDD)成的“开发队列”和“验证队列”。开发队列(n＝100)于2022年1月至2022年6月招募，验证队列(n＝116)于2022年7月至2022年12月招募。
根据蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)测试，选择认知正常的健康对照者，且无心理或神经疾病史，目前无慢性疾病。PD/PDNC、PDMCI和PDD患者的诊断标准参照美国运动障碍学会(Movement Disorder society)的标准。排除标准包括:(1)PD综合征或继发性帕金森，包括进行性核上性麻痹、多系统萎缩、皮质-基底节变性、血管性帕金森病或与神经镇静剂相关的帕金森病；(2)其他神经或心理疾病史；(3)其他原因导致的认知功能障碍，(4)PD颅内手术史。使用Hoehn-Yahr量表和统一帕金森病评定量表第三部分(Unifed Parkinson’s Disease Rating Scale Part III,UPDRSIII)评估PD患者的运动症状严重程度。根据推荐剂量计算左旋多巴当量日剂量。采用快速眼动睡眠行为障碍筛查问卷(Rapid Eye Movement Sleep Behavior Disorder screening questionnaire,RBDSQ)、汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)、汉密尔顿焦虑量表(Hamilton Anxiety Scale,HAMA)评估非运动症状。
2.2血浆蛋白组学和代谢物特征分析
2.2.1血浆收集
对于每个研究对象，遵循标准的12小时临床生化禁食方案，在入组时使用含有乙二胺四乙酸的管收集静脉血样本(3-5ml)，并立即在室温下2500g离心15分钟，得到血浆。将上层血浆分离并保存在聚丙烯管中，血浆样品在液氮中快速冷冻，并在-80℃保存以供进一步分析。
2.2.2血浆蛋白质组学LC-MS/MS分析
蛋白质组学的LC-MS/MS检测由一家提供定量蛋白质组学服务的商业公司进行。(中国浙江，PTM Bio)。将胰蛋白酶肽溶解在流动相A(0.1％甲酸，2％乙腈/水中)中，并在反相分析柱上用溶剂B(0.1％甲酸/乙腈)分离肽。B的梯度如下：0-70分钟，6％至24％B；70-84分钟，24％-35％B；84-87分钟，35％-80％B；87-90分钟，80％B。LC-MS/MS分析在NanoElutUHPLC系统(BrukerDaltonics)上结合Times-TOF Pro(BrukerDaltonics)质谱仪进行。MS数据通过MaxQuant搜索引擎(v.1.6.15.0)获取和处理。根据与反向诱饵数据库连接的人类SwissProt数据库搜索串联质谱。前体离子的质量容差在第一次搜索中设置为20ppm，主检索设置为5ppm，碎片离子质量容差设置为0.02Da。FDR调整为<1％。蛋白质组学数据将存储在NCBI数据库中并公开发布。
2.2.3血浆代谢组学提取及LC-MS/MS分析
所有步骤都要在冰上进行。血浆样品(50μl)冰上解冻30min，每个样品加入预冷提取溶剂(20％乙腈的甲醇液)300μl。将样品旋转3分钟，然后在4℃下12000rpm/min离心10分钟。将200ul上清液移入新的1.5ml管中并在-20℃下放置30分钟。然后将样品再次在4℃、12000rpm/min下离心3分钟。最后收集180ul上清液进行LC-MS/MS分析。
代谢组学LC-MS/MS由一家商业公司(中国武汉，Metware Ltd.)在带ExionLC ADUPLC系统(AB Sciex Instruments)的QTRAP串联质谱仪上进行。将样品用溶剂A(0.1％甲酸水溶液)加载到反相HSS T3 UPLC柱(Waters，1.8μm，2.1mm*100ml)上，并用溶剂B(0.1％甲酸乙腈溶液)分离。B的梯度为：0-11min，5％-90％B；11-12分钟，90％B；12-12.1分钟，95％B；12.1-14分钟，95％B。使用以下参数生成离子：离子源电压，5500V；离子源温度，500℃。MS数据由SCIEX分析软件V1.6.3采集和处理。代谢物质谱通过定制的代谢物数据库metware数据库进行检索。
2.3差异蛋白筛选和通路功能富集分析
在所有蛋白质组数据中输入正态分布的缺失值后，对所有可定量蛋白质进行C、PDNC、PDMIC和PDD组之间的差异蛋白质组分析。学生t检验用于评估配对样品之间蛋白质表达差异的统计显著性。P值<0.05且倍数变化>1.5或<0.67的蛋白质被认为是显著上调或下调的蛋白质。应用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenes andGenomes，KEGG)数据库，使用双尾Fisher精确检验来检验显著富集的蛋白质通路，以评估差异表达蛋白质相对于所有鉴定蛋白质的富集程度。校正P值<0.05的通路被认为是显著的。基因本体(Gene Ontology，GO)注释蛋白质组源自UniProt-GOA数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。蛋白质ID在映射到GO ID之前先转换为UniProt ID。对于未被UniProt-GOA数据库注释的蛋白，采用基于蛋白序列比对法的InterProScan软件对蛋白的GO功能进行注释。为了预测亚细胞定位，我们应用了WoLF PSORT，这是用于预测真核序列的PSORT/PSORT II的更新版本。
2.4蛋白表达模式聚类分析及蛋白相互作用网络分析
采用Mfuzz v.2.46.0R包根据C、PDNC、PDMCI、PDD组中蛋白质表达模式对蛋白进行聚类分析。然后对聚类分析得到的多个蛋白簇采用KEGG分析该蛋白簇显著富集的通路，同样采用R v.3.6.326进行Fisher精确检验来判断通路的富集程度。String版本11用于蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。
2.5加权基因共表达网络分析
加权共表达网络分析(WeightedGeneCo-expressionNetworkAnaly sis；WGCNA)是用来描述不同样本之间基因关联模式的系统生物学方法。基于对应的蛋白表达谱，1)采用相关系数作为共表达的测度，使用加权的表达相关性，构建基因共表达网络；2)基于加权相关性，使用层次聚类的方法进行聚类分析，获得不同的基因模块，用聚类树的分枝和不同颜色表示；3)将模块的蛋白与外部的表型性状信息进行关联，发现与表型性状关联的具有生物学意义的聚类模块；4)对于感兴趣的模块进行分析，识别其中潜在的关键驱动因子。
简而言之，我们首先通过Person相关性计算出基因-基因相似性网络的相关系数。然后将相似网络划分为基因表达水平相似的模块。接下来，计算表型特征与不同模块之间的相关性，以确定模块内的驱动基因。该分析是使用R包WGCNA进行的。
2.6机器学习
数据处理和机器学习是在R(版本3.6.2)和Python(版本3.7.3)中进行的。使用KNN算法估算缺失值，并使用R中的尺度函数对蛋白质强度进行z分数归一化。使用随机森林模型通过平均降低精度选择特征。来自PDNC、PDCI(PDMCI+PDD)的样本用于建立两层分类器。为了评估分类器模型的性能，对训练集应用了10倍交叉验证，得出敏感性(真阳性率)和特异性(真阴性率)。
2.7平行反应监测(Performing parallel reaction monitoring，PRM)质谱分析
胰蛋白酶消化后，将胰蛋白酶肽溶解于0.1％甲酸(溶剂A)中，直接上样至自制反相分析柱。梯度包括在38分钟内将溶剂B(0.1％甲酸的98％乙腈溶液)从6％增加到23％，在14分钟内从23％增加到35％，在4分钟内增加到80％，然后在80％下保持4分钟。EASY-nLC1000UPLC系统上的溶剂流速为700nL/min。对肽进行NSI源处理，然后在Q ExactiveTM Plus(Thermo)中进行串联质谱(mass spectrometry,MS/MS)。电喷雾电压设置为2.0kV，全扫描模式下M/Z扫描范围为350至1000。在轨道阱中以35k的分辨率检测到完整的肽。然后使用NCE设置为27选择目标肽进行MS/MS，并在Orbitrap中以17500的分辨率检测片段。一种与数据无关的程序，在一次MS扫描和20次MS/MS扫描之间交替。自动增益控制(AGC)对于全MS设置为3E6，对于MS/MS设置为1E5。MS/MS的隔离窗口设置为2.0m/z。所得MS数据在Skyline(v.3.6)软件中进行处理。在Skyline中，肽设置为胰蛋白酶[KR/P]，最大漏切设置为2，肽长度设置为8-25，可变修饰设置为Cys上的脲甲基和Met上的氧化。过渡设置：前驱体电荷设置为2、3，离子电荷设置为1、2，离子类型设置为b、y、p。产物离子设置为从离子3到最后一个离子，离子匹配容差设置为0.02Da。
2.8统计分析
使用SPSS25.0版(IBM，Armonk，NY，USA)分析数据。如各自的表格或图例中提到的那样评估组间差异。进行皮尔逊相关分析是为了识别开发队列中与认知障碍相关的蛋白质或代谢物。通过受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析确定潜在生物标志物预测验证队列中认知障碍的能力，并计算为曲线下面积(area underthecurve，AUC)。P<0.05被认为具有统计学意义。
实施例3
3.结果
3.1PD群体的蛋白质组学特征
先前的蛋白质组学分析已经确定了帕金森病与健康对照中差异表达的蛋白质。然而，没有有效的蛋白质谱来对伴有认知障碍的PD患者进行分层。为了绘制具有不同PD表现个体之间的蛋白质组和血清代谢组变化，分析了来自两个独立队列的216份血液样本。第一个队列是开发队列，总共包括了40名女性和60名男性，尽管PDD组比对照组稍大，但各组之间没有观察到显著的年龄差异。为了确认开发队列的发现，额外分析了116个血浆样本作为独立验证队列(52名女性和64名男性)。开发队列和验证队列的一般人口统计信息和临床评估的统计结果见表1。
表1开发队列和验证队列的一般人口学信息和临床评估量表的统计结果
正态分布数据使用Mean±SD表示；非正态分布数据使用M(Q1，Q3)表示；计数资料用n(百分比)表示；*p<0.05
3.2与健康对照相比，帕金森患者的血浆蛋白质组发生了改变
虽然帕金森病主要累及中枢神经系统，但它也可能影响外周组织，改变尿液、脑脊液和其他生物体液的蛋白质组。为了鉴定对照组和PD患者血浆中差异表达的蛋白质，对血浆样本进行了4D无标记蛋白质组学的测定。在耗尽极高强度的蛋白质(例如，白蛋白)后，血浆中表达了1892种独特的蛋白质，其中有1709种蛋白质是可量化的。比较了PD相关组(PDNC组、PDMCI组合PDD组)和对照组之间的相对蛋白质表达水平，将差异表达的蛋白质聚类成热图(图1A)。三个PD组的蛋白质组学特征与对照组不同，认知障碍(PDMCI,PDD)与更明显的模式相关。更有趣的是，PDMCI和PDD组的蛋白表达模式也与PDNC组不同(图1A)。进一步确定了每两组间具有差异表达的蛋白质，并确定了与神经退行性疾病相关的多种蛋白质，包括S100A9、HEBP1和RPL22等(图1B)。与C组比较，PDNC患者血浆中的促炎因子S100A9蛋白上调，研究发现S100A9蛋白可以通过影响α-突触核蛋白聚集而在PD中发挥作用。血红素结合蛋白1已被认为是一种早期AD神经毒性的增敏剂，而在PDMCI受试者中发现血红素结合蛋白1是增加的。PDD组受试者血浆中的RPL22蛋白含量较高，据报道其在PD的额叶皮质中具有更高的转录水平。在所有PD相关受试者中，溶酶体相关蛋白PSAP被下调,PSAP基因变异被报道与帕金森病有关，因为它们在调节α-突触核蛋白降解和颗粒体前体转运方面都发挥着重要的作用。
总的来说，与健康对照组相比，PD患者中有282种蛋白的表达水平显著改变，其中42种蛋白在所有PD亚组中都很常见，可能与疾病进展有关。在PDMCI和PDD组有50种差异蛋白质重叠，但在PDNC组中没有，表明它们更多地参与了帕金森病认知障碍发病过程(图1C)。通过对PD相关组中失调的蛋白质应用KEGG通路富集分析，确定了参与神经发育和维持正常神经功能的多种分子通路。这些通路的改变最终导致帕金森病病理学的进展。其中，磷酸肌醇代谢途径在PDDvs.C和PDMCIvs.C组中均得到富集(图1D)。磷酸肌醇的代谢物在磷酸肌醇的生物合成中发挥作用，磷酸肌醇是调节神经炎症的必需成分。研究发现这种调节过程会影响痴呆症的进展，所以也应该在神经退行性疾病的背景下分析此类分子通路与认知障碍的相关性。
3.3PD相关认知障碍不同严重程度的蛋白质表达模式
为了进一步探索PD相关认知障碍不同严重程度的蛋白质表达模式，应用MFUZZ聚类方法来识别参与认知障碍进展的蛋白质簇。MFUZZ用于识别表达谱中潜在的时间序列模式，并将具有相似模式的基因聚类。MFUZZ分析对八种不同的基因表达模式进行了分类，其中三种与认知障碍严重程度相关，包括簇1、簇3和簇5(图2A)。这三个簇中分别有95、86、97个独特的蛋白质。簇1和簇5中的蛋白质表达水平与认知障碍呈正相关；与对照组和PDNC受试者相比，PDMCI和PDD受试者中的表达水平增加证明了这一点，表明这些蛋白簇与这些组的认知能力下降存在潜在联系。而簇3与认知障碍呈负相关，该簇中的蛋白表达水平随着认知能力下降而下降(图2A)。此外，还观察了特定群体的集群。例如，簇2中的蛋白质仅在PDNC受试者的血浆中表现出高表达，而在PDMCI或PDD受试者中保持低水平。同样，簇4和簇6中的蛋白质分别特定于PDD和PDMCI组中表现出高表达(图3A)。
异常的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interactions，PPI)会扰乱正常的细胞功能，这种异常的聚集还会导致相关疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病。为了更好地了解每个簇内蛋白质的特征，进行了PPI网络分析(图2B，图3B)。在簇1中，确定了一个包含免疫球蛋白家族蛋白的主要网络，包括IGHG1、IGLL5和IGKC。而簇3显示了一个交互较少的次要网络。簇5包含三个子网络，第一个子网络由角蛋白组成(例如，KRT13、KRT14、KRT19)，第二个子网络涉及核糖体蛋白(例如，RPL26、RPL11、RPS19)，尽管第三个子网络交互较少但呈现的蛋白以与阿尔茨海默病相关为特征，例如TLN122和ITGB323(图2B)。接着丰富了每个簇中蛋白质的KEGG通路。结果发现KEGG通路富集在各簇中显示出不同的模式，簇1中的通路与感染和免疫相关，簇3中没有明显的通路富集，而在簇5中发现了多巴胺能突触、雌激素信号和Rap1信号通路，这些通路先前报道均与帕金森病相关。另外，在神经退行性疾病中起重要作用的坏死性凋亡通路也显示在簇1中显示(图2C)。GOCC分析显示蛋白定位于簇1神经元细胞的远端轴突(图3C)。GOBP和GOMF分析表明簇3参与受体活性调节和刺激反应调节(图3C，E)。簇5的GOBP分析揭示了与衰老过程相关的蛋白质(图3C)，而GO细胞成分分析突出了它们在染色质、锚定连接和中间丝中的存在(图3D)。PD特异性簇2显示丙酮酸代谢显着富集，证实了先前关于丙酮酸代谢和代谢物在PD进展中的重要作用的发现。对于PDD特异性簇4，蛋白质主要富集在氧化磷酸化和核糖体相关过程中；然而，PDMCI特定簇6中没有富集明显的通路(图2C)。
3.4共表达网络分析识别与PD临床表现参数相关的蛋白模块
为了在系统层面了解每组样本中的蛋白质共表达模式，并确定与PDCI进展相关的疾病蛋白质模块，采用了加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expressionnetwork analysis,WGCNA)。在调整了一些常见的混杂因素(如年龄、性别、教育背景)后，使用WGCNA分析确定了七个强共表达的蛋白组模块。这些模块是根据WGCNA公约进行颜色编码的(图4A)。这些蛋白模块在PD相关通路中显著富集，包括神经活性配体-受体相互作用、PPAR信号通路、肌醇磷酸代谢、雌激素信号通路和Rap1信号通路(图4B)。后三种途径在之前的分析中也被确定(图1D和图2C)。评估了每个蛋白质模块与PD表型特征之间的相关性，确定了五个与PD状态显着相关的模块(棕色、黄色、蓝色、绿色和红色)(图4C)。
HAMD和HAMA与棕色和黄色模块与呈正相关，而与绿色模块呈负相关。蓝色模块与PD特征表现出最强的相关性，且与MoCA分数呈负相关，表明与认知障碍(较低的MoCA分数)呈正相关(图4C)。强相关性表明蓝色模块中的蛋白质具有作为帕金森病认知障碍预测标志物的潜力。因此，检查了三个PD相关组中MoCA分数与蓝色模块中单个蛋白质之间的关系。值得注意的是，发现MYOM3、H3C15和PSAP与MoCA分数表现出最强的相关性(图4D)。
3.5PD相关组间的综合蛋白质组学和代谢组学分析
越来越多的证据支持代谢缺陷，如线粒体功能障碍和氧化损伤有助于帕金森病的病理发展。在WGNCA分析确定的蛋白质模块中确定了代谢相关通路，这些通路涉及胆固醇、肌醇磷酸和碳水化合物代谢(图4B)。这鼓励去探索血浆样本中的代谢组改变。由于的目标是探索与PD发病后认知障碍相关的因素，因此将蛋白质组学和代谢组学分析限制在PDNC、PDMIC和PDD组。在蛋白质组学分析中，首先对差异表达的蛋白质进行聚类，发现PDMCI和PDD组中的模式与PDNC组有显着差异，而PDD和PDMCI之间的表达模式更相似(图5A，左)。检测到77种差异表达的蛋白质，其中43种蛋白质上调(簇1)，34种蛋白质下调(簇2)。KEGG分析显示增加的蛋白质富含聚糖相关代谢，减少的蛋白质富含神经活性受体相互作用(图5B，上)。
代谢分析的热图显示，与PDNC和PDMCI组相比，PDD中的代谢组组成不同，簇1中的代谢物在PDD受试者中高于PDNC和PDMCI受试者；簇2中的大多数代谢物在PDD和PDMCI中较低，但在PDNC中较高(图5A，右)。KEGG分析显示差异表达的代谢物富含神经通路，例如谷氨酸能突触和长期抑制，以及其他生物分子代谢通路(图5B，下)。接下来，确定了包含差异表达蛋白质和代谢物的32条通路，包括神经退行性疾病相关通路(亨廷顿病、帕金森氏病、多巴胺能突触)和生物分子代谢通路(氨基酸、不饱和脂肪酸、肌醇代谢物)(图5C)。该分析表明血浆中蛋白质组和代谢组变化之间的密切关联及其与PD的相关性。共表达网络分析揭示了H3C15蛋白(H3组蛋白的成员家族)主要负调节参与氨基酸代谢的代谢物。三种代谢物(MEDN1090、MEND1495和MEDP1242)与包括KIF5A和GANI2在内的一部分蛋白质强烈共表达，两者都与帕金森病通路相关(图5D)。
3.6基于机器学习模型识别认知障碍的高可信度生物标志物
在的生物信息学分析中，在PD相关受试者中发现了多种失调的蛋白质和代谢物。然而，确定哪种蛋白质(代谢物)或哪组蛋白质(代谢物)可以作为高可信度的预测性生物标志物仍不清楚。因为Umap图显示了PDNC和PDMIC_PDD样本之间分子模式的相似性(图6)，强调了使用机器学习方法进行特征选择的必要性。因此，应用机器学习模型来识别基于蛋白质组学和代谢谱的高置信度生物标志物，以区分有和没有认知障碍的PD患者。因此，利用机器学习模型，通过根据研究中获得的蛋白质组学和代谢特征识别高可信度生物标志物，来区分有和没有认知障碍的PD患者。
为了确定生物标志物的优先级，采用随机森林方法通过平均降低精度来选择特征。输入蛋白质组学和代谢组学数据集分别训练的模型(蛋白质组学图7A；代谢组学图7B)。确定了25个在机器学习模型中具有最佳结果的蛋白质特征，包括排名靠前的PSAP和H3C15(图7A)。为了评估模型的性能，计算了受试者工作特征曲线下面积(area under receiveroperating characteristic curve,AUROC)下的平均面积。结果显示使用H3C15或PSAP特征构建的分类器的AUROC分别为0.985和0.973，两者组合后AUROC提高到了0.990(图7A)。同样，该模型给出了内源性代谢物特征的排名列表，甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺是两个最重要的代谢特征(图7B)。这两种代谢物构建的分类器的AUROC分别可以达到0.922和0.917，组合后提高到0.990(图7B)。为了测试的机器学习模型给出的特征作为高可信度生物标志物的潜力，对开发队列受试者应用了分类误差矩阵分析。通过蛋白质分类器正确分类了开发队列中50名PDMCI和PDD受试者中的49名和24名PDNC受试者中的22名(图7A)。代谢物分类器可以对50个PDMCI和PDD受试者中的49个和24个PD受试者中的22个进行分类(图7B)。蛋白质生物标志物和代谢物生物标志物的丰度如图7C所示。
3.7在独立队列中使用PRM质谱法验证机器学习模型选择的蛋白质标记物
为了验证上面机器学习模型所选蛋白质生物标志物的性能，使用PRM在包含62名认知障碍PD受试者和35名没有认知障碍的PD受试者的独立验证队列中对选定的蛋白质(H3C15和PSAP)进行了靶向分析。还在验证队列中量化了其他三种蛋白质：NCAM2、LAMB2和GCLC(虽然他们在先前的机器学习模型中排名未靠前，但是之前的研究发现它们与认知功能障碍有关)。PRM结果与在开发队列中发现的一致：与PDNC组相比，PDMCI和PDD组中的H3C15表达水平更高，PSAP、NCAM2和LAMB2水平较低(图8AB，图9)。而GCLC的结果在开发队列和验证队列中是相反的(图10)。最后，使用经过训练的机器学习模型也构建了一个蛋白质分类器，并将其应用于独立验证队列中。结果显示使用H3C15和PSAP构建的分类器的AUROC为0.765，它可以正确分类62名认知障碍PD受试者中的52名(图8C)。然而，当在独立队列上应用由H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2构建的分类器时，AUROC可以达到0.956，并且可以正确分类62名认知障碍受试者中的61名(图8D)。
本发明通过结合蛋白质组学和代谢组学来鉴定PD患者认知功能障碍的生物标志物。发现，在表现为轻度认知障碍和痴呆的PD患者中，许多蛋白质及其相关代谢途径都发生了改变，这可能用于筛查有认知能力下降风险的PD患者，并相应地优化其管理和治疗。另外，使用机器学习模型可以识别PD相关认知障碍的蛋白质和代谢标志物。研究结果为PD患者认知障碍和痴呆的代谢和信号通路提供了新的见解。
与PD患者认知功能障碍相关的前两个蛋白生物标志物是H3C15和PSAP。两种标志物均能区分PD患者是否存在认知障碍，当两种标志物联合使用时，区分能力进一步增强。这些结果表明H3C15或PSAP有助于预测PD的认知功能障碍。H3C15属于组蛋白家族，是负责真核生物染色体纤维核小体结构的基本核蛋白。在PD果蝇模型中，表明α-突触核蛋白可直接与组蛋白结合，抑制乙酰转移酶活性，促进神经毒性。PSAP编码saposin，它是一种多功能蛋白，涉及神经保护、神经营养和溶酶体功能调节。研究表明，PSAP功能障碍会导致溶酶体功能障碍，最终导致α-突触核蛋白和P-Tau聚集。此外，最近的研究表明，PSAP的缺失会导致神经元氧化应激水平升高和脂质过氧化，导致神经元铁死亡，参与PD和认知障碍。
通过机器学习确定认知障碍的候选代谢物生物标志物是甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺。甘氨胆酸是一种由甘氨酸和胆酸衍生的共轭胆汁酸，与PD中微生物群落失调、炎症和α-突触核蛋白错误折叠有关。另外，本发明的研究是第一个将6-甲基烟酰胺与帕金森病患者的认知障碍联系起来的研究，已知它能抑制线粒体中的氧化磷酸化，并在脑出血急性期升高。
为了验证开发队列中的结果，本发明招募了另一个独立队列即验证队列。通过使用PRM质谱法，与H3C15和PSAP一起，还测量了不同PD亚组中NCAM2、LAMB2和GCLC的丰度，这些基因先前与PD患者的认知功能障碍有关。在开发和验证队列中，PDCI组的H3C15表达水平高于PDNC组，而PSAP组的H3C15表达水平低于PDNC组。此外，在验证队列中，H3C15和PSAP构建的分类器的AUC为0.765，这证实了这些生物标志物可以区分有和没有认知障碍的PD患者。与PDNC相比，NCAM2和LAMB2水平在两个队列中的PDCI组中均下降，且由H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2构建的分类器在验证队列中显示出较高的AUC(0.956)。NCAM2属于细胞粘附分子的免疫球蛋白超家族，调节重要的神经元特异性过程，如神经元分化、突触发生和记忆形成；NCAM2和LAMB2的缺失与认知能力下降密切相关。总之，由上述四种蛋白构建的模型可以预测帕金森病的认知障碍。
如图1所示，(A-B)火山图和热图显示了与对照组相比，PD患者中下调(蓝色)或上调(红色)的蛋白质。(C)维恩图显示了C组与PDNC组、PDMCI组和PDD组间两两比较中差异显著的蛋白，以及组间重叠的差异蛋白。(D)京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes,KEGG)通路中差异表达蛋白的富集。点的大小反映了每个通路中蛋白质的数量，颜色反映了富集的P值。
如图2所示，(A)模糊C-means聚类在C、PDNC、PDMCI和PDD样本中识别出3个具有代表性的蛋白质簇。(B)簇1、3和5内的蛋白质-蛋白质相互作用网络。节点的大小反映了它的程度，而节点的颜色反映了它的隶属度。(C)京都基因和基因组百科全书(KyotoEncyclopedia ofGenes and Genomes,KEGG)通路中每个簇内蛋白质的富集。
如图3所示，(A)模糊C-means聚类在C、PDNC、PDMCI和PDD样本中的其他5个蛋白质簇。(B)簇2、4、6、7和8的蛋白质-蛋白质相互作用网络。节点的大小反映了它的程度，而节点的颜色反映了它的隶属度。(C-E)京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,KEGG)通路中每个簇内蛋白质的富集。
如图4所示，(A)树状图显示七个共表达模块，每个颜色表示了一个模块。(B)条形图显示了在每个蛋白质模块中最显著富集的五个京都基因和基因组百科全书通路。x轴表示Fisher’s在-log10变换后的p值。(C)每个模块中蛋白表达(最左)与PD患者临床特征(底部)之间的相关性热图。红色表示正相关；蓝色是-1。汉密尔顿焦虑量表(Hamilton AnxietyScale,HAMA)；汉密尔顿抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)；Hoehn-Yahr分级(H-Y)；左旋多巴当量日剂量(levodopa-equivalent daily dose,LEDD)；蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)；快速眼动睡眠行为障碍筛查问卷(RapidEye Movement Sleep Behavior Disorder Screening Questionnaire,RBD-Q)；统一帕金森病评定量表的第三部分(Part III of the Unified Parkinson’s Disease RatingScale,UPDRSIII)。(D)散点图显示了“蓝色”模块中蛋白质表达与MoCA分数之间的Pearson相关性。
如图5所示，(A)热图显示PDNC、PDMCI和PDD各组血浆中蛋白质(左)和代谢物(右)的差异表达。分层聚类将蛋白质和代谢物分为簇1和簇2。(B)京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路中簇1、2差异表达蛋白(上图)和代谢物(下图)的富集。x轴表示Fisher’s在-log10变换后的p值。(C)同时在KEGG通路中富集的差异表达蛋白(蓝色)和代谢物(金色)。(D)差异表达蛋白和代谢物之间的Spearman相关性网络。仅显示系数绝对值>0.4的相关性。
如图6所示，结果表明PDNC和PDMIC_PDD样品的分子模式相似，强调了使用机器学习方法进行特征选择的必要性。
如图7所示，(A)蛋白和(B)代谢物生物标志物的鉴定。左边表示采用随机森林方法通过平均降低精度来确定生物标志物的优先级；中间表示单个和组合生物标志物的受试者工作特征曲线；右边表示分类误差矩阵。在曲线图中显示了工作曲线下的面积。(C)PDNC组和PDMCI_PDD组蛋白质和代谢物生物标志物的血浆水平。
如图8所示，(A-B)PDNC组和PDMCI_PDD组蛋白质蛋白生物标志物的血浆水平：(A)H3C15和PSAP，(B)NCAM2和LAMB2。(C-D)左侧为(C)H3C15与PSAP组合或(D)所有四种蛋白生物标志物的受试者工作特征曲线，右侧为分类误差矩阵。在曲线图中显示了工作曲线下的面积。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (10)

1.一种帕金森病认知障碍的生物标志物，其特征在于，包括蛋白标志物与代谢物标志物，所述蛋白标志物包括H3C15、PSAP、NCAM2与LAMB2；所述代谢物标志物包括甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于：所述H3C15表达水平与认知障碍风险呈正相关，所述PSAP、NCAM2与LAMB2的表达水平认知障碍风险呈负相关。
3.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于：所述甘氨胆酸与6-甲基烟酰胺表达水平与认知障碍风险呈正相关。
4.如权利要求1-3任一项所述的生物标志物的识别方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：收集血液样本并分为开发队列与验证队列的两个独立队列；
S2：对开发队列中的血浆进行蛋白质组学和代谢组学分析；
S3：使用机器学习模型识别PDCI的候选蛋白质和代谢物生物标志物；
S4：在验证队列中,使用平行反应监测质谱分析方法来验证机器学习模型所选择的蛋白质标志物。
5.基于权利要求1所述生物标志物的帕金森病认知障碍分型的分类器，其特征在于：所述分类器利用蛋白标志物或代谢物标志物对帕金森病认知障碍进行分型，所述帕金森病认知障碍分型包括帕金森病伴认知正常PDNC、帕金森病伴轻度认知功能障碍PDMCI及帕金森病伴痴呆PDD。
6.如权利要求5所述的分类器，其特征在于：所述分类器包括H3C15和PSAP。
7.如权利要求5所述的分类器，其特征在于：所述分类器包括H3C15、PSAP、NCAM2和LAMB2。
8.如权利要求5所述的分类器，其特征在于：所述分类器包括甘氨胆酸和6-甲基烟酰胺。
9.如权利要求1-3任一项所述的生物标志物于识别帕金森病认知障碍的应用。
10.如权利要求5-8任一项所述的分类器于帕金森病认知障碍分型的应用。
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