CN114047281B - 帕金森病的生物标志物的组合及其应用 - Google Patents

帕金森病的生物标志物的组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了帕金森病的生物标志物的组合及其应用，具体公开了生物标志物的组合牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)在制备诊断帕金森病的检测试剂中的应用，通过生物标志物神牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)结合1‑a,24R,25‑三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱(22:6)、γ‑谷氨酰丝氨酸、人参炔L或燕麦酸中的任一种，来判断患帕金森病的风险，可进行提前预防、防范帕金森病。

Description

帕金森病的生物标志物的组合及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及帕金森病的生物标志物的组合及其应用。
背景技术
帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，其症状表现为起步缓慢、走路拖步、手抖、表情呆滞、说话吃力、腰痛、全身乏力、肌无力、流口水、颈椎痛，其发病机制主要为黑质纹状体的多巴胺能神经元逐渐丢失，从而导致的，严重影响患者健康和生活质量，给患者及其家庭、社会带来沉重的负担。目前PD临床诊断主要依赖患者的症状，依靠病史、体征、影像学的综合评估，但这些方法有主观判断性大、可靠性低、成本高的缺点。此外，早期干预能显著提高PD患者的生活质量和延长生存时间，而当患者已经表现出帕金森病的症状体征时，多巴胺能神经元已经大部分丢失，错过了早期干预时机。如何能实现早期检测出帕金森病是亟需解决的技术问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供帕金森病的生物标志物的组合及其在制备诊断帕金森病的检测试剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
生物标志物牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)在制备诊断帕金森病的检测试剂中的应用。
如上所述的生物标志物，优选地，还包括1-a,24R,25- 三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任一种。
牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)在制备诊断帕金森病的试剂中的应用，其是将牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)结合1-a,24R,25- 三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任一种来判断是否存在帕金森病的风险。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，1-a,24R,25- 三羟基维生素D2的含量记为R6，根据公式TC= -2.5500314+5.227×10-4×R4+4.762×10-4×R5-3.695×10-4×R6计算TC值，若TC≥0.773，则判定为帕金森病；若TC＜0.773，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，羊毛甾烯四醇C的含量记为R7，根据公式TC= -4.1486398+4.960×10-4×R4+6.262×10-4×R5-2.0663×10-3×R7计算TC值，若TC≥0.240，则判定为帕金森病；若TC＜0.240，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，灵芝醇C的含量记为R8，根据公式TC= -1.4240999+4.521×10-4×R4+5.520×10-4×R5-4.654×10-4×R8计算TC值，若TC≥0.217，则判定为帕金森病；若TC＜0.217，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，羊毛甾烯四醇C的含量记为R9，根据公式TC= -5.031+4.714×10-4×R4+4.588×10-4×R5-5.895×10-5×R9计算TC值，若TC≥0.386，则判定为帕金森病；若TC＜0.386，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，溶血磷脂酰胆碱 (22:6)的含量记为R10，根据公式TC= -11.76+5.851×10-4×R4+5.177×10-4×R5+4.116×10-5×R10计算TC值，若TC≥0.459，则判定为帕金森病；若TC＜0.459，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，γ-谷氨酰丝氨酸的含量记为R11，根据公式TC= -7.865+6.053×10-4×R4+4.841×10-4×R5+1.871×10-7×R11计算TC值，若TC≥0.387，则判定为帕金森病；若TC＜0.387，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，人参炔L的含量记为R12，根据公式TC= -3.1471816+5.207×10-4×R4+4.990×10-4×R5-2.514×10-4×R12计算TC值，若TC≥0.350，则判定为帕金森病；若TC＜0.350，则为正常。
如上所述的应用，优选地，牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，燕麦酸的含量记为R13，根据公式TC=-3.343+5.073×10-4×R4+4.989×10-4×R5-1.641×10-4×R13计算TC值，若TC≥0.293，则判定为帕金森病；若TC＜0.293，则为正常。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了新型生物标志物的组合包括牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1) 及判别帕金森病的模型，可用于早期发现，其在制备诊断和预测帕金森病的检测试剂盒中应用。
本发明提供的用于诊断帕金森病的生物标志物组合为包括牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)与1-a,24R,25- 三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任意一种结合，根据检测牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，结合1-a,24R,25- 三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任一种在血液中的含量，根据计算公式TC值来预测患帕金森病的风险，有助于诊断是否存在帕金森病的倾向，可用于提前预防。
附图说明
图1为正离子模式下VIP＞1的样本；
图2为负离子模式下VIP＞1的样本；
图3为正离子模式下(O)PLS-DA的得分图；
图4为负离子模式下(O)PLS-DA的得分图；
图5 为正离子模式下S-plot图；
图6 为负离子模式下S-plot图；
图7为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R6）；
图8 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R7）；
图9 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R8）；
图10为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R9）；
图11为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R10）；
图12 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R11）；
图13 为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R12）；
图14为基于逻辑回归模型的ROC曲线（变量为R4+R5+R13）。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除另有规定，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格，其中，异丙醇、甲酸、乙腈、亮氨酸脑啡肽、甲酸氨、甲酸钠，厂家均为Fisher。下面实施例中所用的仪器：冷冻离心机：型号D3024R，Scilogex公司，美国；漩涡振荡器：MX-S，Scilogex公司，美国；超高效液相色谱：UPLC， ACQUITY UPLC I-Class系统； Waters，Mancheste，UK。分析鉴定软件采用Progenesis QI，厂家为Waters。
实施例1
1、样品处理
建模样品：选择符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，诊断无帕金森综合征作为对照人群共52人；
选择符合国际广泛应用的英国帕金森协会脑库临床诊断标准，确诊为帕金森综合征作为患者人群共50人。建模的对照人群和患者人群的男女比例是均为1：1，年龄范围都在45岁以上。
收集的上述人群的血清样本在冰上解冻，200μL的血清用600μL的预冷异丙醇萃取，用漩涡振荡器涡流1min，室温孵育10min，然后将萃取混合物在-20◦C下储存过夜，在冷冻离心机（型号D3024R，Scilogex公司，美国）4000r离心20min后，将上清液转移到新的离心管，用体积比为2：1：1的异丙醇/乙腈/水的混合物稀释至1：10。样品在LC-MS分析前保存在-80℃冰箱中。此外，还将每个萃取混合物的10μL组合在一起制备混合血清样品。
2、脂质组学的超高效液相色谱-质谱联用方法进行检测
样品用ACQUITY UPLC连接到带有ESI的Xevo-G2XS高分辨飞行时间 (QTOF)质谱仪进行分析。采用CQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×10 0 mm，1.7μm，Waters)，流动相中A相的10 mM甲酸铵-0.1%甲酸的乙腈溶液（其配置方法为称取甲酸铵0.63 g，甲酸10 g，用乙腈-水溶液（乙腈：水为60：40，v/v）溶解并定容至1000mL）和B相10 mM甲酸铵-0.1%甲酸-异丙醇-乙腈溶液(配置方法为称取甲酸铵0.63 g，甲酸10 g，用异丙醇-乙腈溶液（异丙醇：乙腈为90：10，v/v）溶解并定容至1000mL。)。在大规模研究之前，进行了包括10分钟、15分钟和20分钟洗脱期的中试实验，以评估流动相组成和流速对脂质保留时间的潜在影响。在PIM中，丰富的脂质前体离子和碎片以相同的顺序分离，具有相似的峰形和离子强度。此外，具有10分钟洗脱期的混合QC样品，也表现出与测试样品相似的前体和碎片的基峰强度。流动相流速为0.4mL/min。该柱最初用40%B洗脱，然后在2分钟内线性梯度到43%B，然后在0.1min内将B的百分比增加到50%。在接下来的3.9分钟内，梯度进一步增加到54%B，然后B的量0.1分钟内增加到70%。在梯度的最后部分，B的量在1.9分钟内增加到99%。最后，溶液B在0.1分钟内返回到40%，并且在下一次进样之前将色谱柱平衡1.9分钟。每次进样量为5μL，用Xevo-G2XS型QTOF质谱仪检测正负两种模式下的脂质，采集范围为 m/z50~1200年，采集时间为0.2s/次。离子源温度为120℃，去溶温度为600℃，气体流量为1000L/h，以氮气为流动气体。毛细管电压为2.0kV(+)/锥体电压为1.5kV(-)，锥体电压为30V。以亮氨酸脑啡肽进行标准质量测定，用甲酸钠溶液进行校正。样品被随机排序。每10个样本注入一个QC样本并进行分析，以调查数据的重复性。
3、结果分析
1）利用多元统计学寻找血清差异物质
使用Progenesis QI将质谱数据转化为可供统计的数据形式，正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合了正交信号矫正（OSC）和 PLS-DA（偏最小而成判别分析） 方法，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。如图1 、图2VIP值为PLS-DA第一主成分的变量重要性投影，通常以VIP>1为代谢组学常用评判标准，作为差异代谢物筛选的标准之一；图3、图4为帕金森病组和对照组两个分组中的第一主成分和第二主成分通过降维的方式所得的得分图，横坐标表示组间差异，纵坐标表示组内差异，且两组结果分离较好。图5、图6为S-plot图，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，同时满足p<0.05，VIP>1的条件下，正离子模式有144个差异物，负离子模式有70个差异物。
2）约登指数分析
为了进一步缩小范围，将VIP阈值提高到2，同时体现正常和患者之间的倍数差异在0.5倍以下，或者增加1.5倍以上，P值小于0.01，最终得到以下13个化合物，化合物具体见表1。
然后对他们进行约登指数计算，用来反映单个指标对整体的诊断和预测效果，其中获得的单个代谢物预测帕金森病的曲线下面积（AUC）、特异性和敏感度结果如表1。
表1帕金森病相关代谢物的约登指数分析
编号 化合物名称 AUC值 敏感性 特异性
R1 Ganoderic acid X（灵芝酸X ） 0.936 0.808 0.896
R2 Ceramid (d18:1/24:0)（神经酰胺 (d18:1/24:0)） 0.682 0.612 0.885
R3 PyranocyaninA（吡喃花青素A） 0.912 0.923 0.776
R4 Taurine（牛磺酸） 0.618 0.507 0.981
R5 Cer (d18:0/24:1)（神经酰胺(d18:0/24:1)） 0.876 0.939 0.731
R6 1-a，24R，25- Trihydroxyvitamin D2（1-a,24R,25- 三羟基维生素D2） 0.776 0.731 0.755
R7 Fasciculol C （羊毛甾烯四醇C） 0.760 0.712 0.816
R8 Ganoderiol C （灵芝醇C） 0.868 0.788 0.836
R9 Oleamide（油酰胺） 0.785 0.538 0.910
R10 LysoPC(22:6)（ 溶血磷脂酰胆碱 (22:6)） 0.598 0.418 0.885
R11 gamma-Glutamylserine（γ-谷氨酰丝氨酸） 0.765 0.808 0.627
R12 Ginsenoyne L (人参炔L) 0.834 0.654 0.866
R13 Avenoleic acid (燕麦酸) 0.799 0.904 0.582
4、内部人群七折交叉验证结果
为提高种变量化合物的生物诊断效果，需要根据上述生物标志物找出适合的模型进行行下一步的分析。
将内部人群随机分为7份，选择1份为验证集，其他为训练集，如此反复七次，考察最佳的变量组合。将其次的结果，包括AUC，敏感度，特异性都取平均值，并进行统计学显著性计算，结果如下表2。
表2
组合 逻辑回归AUC 敏感性 特异性
R4+R5+R6 0.954 1 1
R4+R5+R7 0.962 1 1
R4+R5+R8 0.962 1 1
R4+R5+R9 0.935 1 1
R4+R5+R10 0.935 1 1
R4+R5+R11 0.927 1 1
R4+R5+R12 0.957 1 1
R4+R5+R13 0.947 1 1
上述组合之间，AUC值并没有显著性p<0.05差异。
基于上述建立逻辑回归模型A、B、C、D、E、F、J、H如下：
"模型A" 变量为上述R4+R5+R6，按公式为TC= -2.5500314+5.227×10-4×R4+4.762×10-4×R5-3.695×10-4×R6，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R6为1-a,24R,25- 三羟基维生素D2的含量，根据计算获得的TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.773，则判定为帕金森病；若TC＜0.773，则为正常。
"模型B"变量为R4+R5+R7，按公式为TC= -4.1486398+4.960×10-4×R4+6.262×10-4×R5-2.0663×10-3×R7计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R7为羊毛甾烯四醇C的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.240，则判定为帕金森病；若TC＜0.240，则为正常。
"模型C"变量为R4+R5+R8，按公式为TC= -1.4240999+4.521×10-4×R4+5.520×10-4×R5-4.654×10-4×R8计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R8为灵芝醇C的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.217，则判定为帕金森病；若TC＜0.217，则为正常。
"模型D"变量为R4+R5+R9，按公式TC= -5.031+4.714×10-4×R4+4.588×10-4×R5-5.895×10-5×R9来计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量R9为油酰胺的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.386，则判定为帕金森病；若TC＜0.386，则为正常。
"模型E" 变量为上述R4+R5+R10，按公式为TC= -11.76+5.851×10-4×R4+5.177×10-4×R5+4.116×10-5×R10，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R10为溶血磷脂酰胆碱 (22:6)的含量，根据计算获得的TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.459，则判定为帕金森病；若TC＜0.459，则为正常。
"模型F"变量为R4+R5+R11，按公式为TC= -7.865+6.053×10-4×R4+4.841×10-4×R5+1.871×10-7×R11计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R11为γ-谷氨酰丝氨酸的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.387，则判定为帕金森病；若TC＜0.387，则为正常。
"模型G"变量为R4+R5+R12，按公式为TC= -3.1471816+5.207×10-4×R4+4.990×10-4×R5-2.514×10-4×R12计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R12为人参炔L的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.350，则判定为帕金森病；若TC＜0.350，则为正常。
"模型H"变量为R4+R5+R13，按公式TC= -3.343+5.073×10-4×R4+4.989×10-4×R5-1.641×10-4×R13来计算TC值，公式中R4为牛磺酸的含量，R5为神经酰胺(d18:0/24:1)的含量，R13为燕麦酸的含量，根据TC值预测帕金森病的风险：若TC≥0.293，则判定为帕金森病；若TC＜0.293，则为正常。
实施例2
用于模型验证样本群体76人，对逻辑回归模型进行验证，其中，对照人群28人，患者人群48人，选择标准同实施例1。
按实施例1中的检测方法测得牛磺酸（R4）、神经酰胺(d18:0/24:1)（R5）1-a,24R,25- 三羟基维生素D2（R6）、羊毛甾烯四醇C（R7）、（R5）、灵芝醇C（R8）、羊毛甾烯四醇C(R9)、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)（R10）、γ-谷氨酰丝氨酸（R11）、人参炔L（R12）、燕麦酸（R13）的含量，用于证实施例1中模型结果的准确性，并绘制相应的ROC曲线图，结果如下：
"模型A" 变量为R4+R5+R6，ROC曲线图结果如图7所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型B" 变量为R4+R5+R7，ROC曲线图结果如图8所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
"模型C" 变量为R4+R5+R8，ROC曲线图结果如图9所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
"模型D" 变量为R4+R5+R9，ROC曲线图结果如图10所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
"模型E" 变量为R4+R5+R10，ROC曲线图结果如图11所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy （准确度）=1。
"模型F" 变量为R4+R5+R11，ROC曲线图结果如图12所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
"模型G" 变量为R4+R5+R12，ROC曲线图结果如图13所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
"模型H" 变量为R4+R5+R13，ROC曲线图结果如图14所示，Sensitivity （敏感性）=1，Specificity （特异性）=1，Accuracy（准确度） =1。
数据显示：将牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)组合，并结合1-a,24R,25-三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任何一种，根据计算TC值来判定帕金森病，表现出非常高的诊断能力，未来都能进行临床试剂盒的应用。
由此可见，采用上述方法处理患者血清样本并进行检测，所测得数据代入上述模型中，利用逻辑回归模型来判断患帕金森病的风险。

Claims (1)

1.生物标志物的组合牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)在制备诊断帕金森病的检测试剂中的应用；其特征在于，将牛磺酸和神经酰胺(d18:0/24:1)结合1-a,24R,25- 三羟基维生素D2、羊毛甾烯四醇C、灵芝醇C、油酰胺、溶血磷脂酰胆碱 (22:6)、γ-谷氨酰丝氨酸、人参炔L 或燕麦酸中的任一种来判断是否存在帕金森病的风险；
将牛磺酸的含量记为R4，神经酰胺(d18:0/24:1)的含量记为R5，1-a,24R,25- 三羟基维生素D2的含量记为R6，根据公式TC= -2.5500314+5.227×10-4×R4+4.762×10-4×R5-3.695×10-4×R6计算TC值，若TC≥0.773，则判定为帕金森病；若TC＜0.773，则为正常；
将羊毛甾烯四醇C的含量记为R7，根据公式TC= -4.1486398+4.960×10-4×R4+6.262×10-4×R5-2.0663×10-3×R7计算TC值，若TC≥0.240，则判定为帕金森病；若TC＜0.240，则为正常；
将灵芝醇C的含量记为R8，根据公式TC= -1.4240999+4.521×10-4×R4+5.520×10-4×R5-4.654×10-4×R8计算TC值，若TC≥0.217，则判定为帕金森病；若TC＜0.217，则为正常；
将羊毛甾烯四醇C的含量记为R9，根据公式TC= -5.031+4.714×10-4×R4+4.588×10-4×R5-5.895×10-5×R9计算TC值，若TC≥0.386，则判定为帕金森病；若TC＜0.386，则为正常；
将溶血磷脂酰胆碱 (22:6)的含量记为R10，根据公式TC= -11.76+5.851×10-4×R4+5.177×10-4×R5+4.116×10-5×R10计算TC值，若TC≥0.459，则判定为帕金森病；若TC＜0.459，则为正常；
将γ-谷氨酰丝氨酸的含量记为R11，根据公式TC= -7.865+6.053×10-4×R4+4.841×10-4×R5+1.871×10-7×R11计算TC值，若TC≥0.387，则判定为帕金森病；若TC＜0.387，则为正常；
将人参炔L的含量记为R12，根据公式TC= -3.1471816+5.207×10-4×R4+4.990×10-4×R5-2.514×10-4×R12计算TC值，若TC≥0.350，则判定为帕金森病；若TC＜0.350，则为正常；
或将燕麦酸的含量记为R13，根据公式TC=-3.343+5.073×10-4×R4+4.989×10-4×R5-1.641×10-4×R13计算TC值，若TC≥0.293，则判定为帕金森病；若TC＜0.293，则为正常。
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