CN111796102B - 一种预测神经退行性疾病风险的方法和试剂盒 - Google Patents

一种预测神经退行性疾病风险的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种预测神经退行性疾病风险的方法和试剂盒，该方法基于生物样品中生物标志物的水平，预测受试者发生神经退行性疾病的风险，其中，生物标志物为生长相关蛋白43(GAP43)、神经颗粒蛋白、突触小体相关蛋白25(SNAP25)和突触结合蛋白1。本申请的方法能够检测无症状期的阿尔茨海默病(AD)，甚至能够在AD发病前5‑7年对受试者患AD的风险进行预测，并且具有几乎无创伤，低风险等优势。

Description

一种预测神经退行性疾病风险的方法和试剂盒
技术领域
本申请涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学诊断领域。具体而言，本申请公开了，用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的方法，其包括：(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；(2)测定生物样品中生物标志物的水平；和(3)基于所述生物标志物的水平预测受试者发生神经退行性疾病的风险；其中，生物标志物为GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1；以及用于所述方法的试剂盒。此外，本申请还公开了试剂盒用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)目前缺乏有效的治疗药物，需要早期干预。但早期干预的难点在于AD的早期诊断，尤其是对无症状期AD的诊断十分困难。因此，标志物的作用就显得尤为关键。然而，目前仍无可靠的外周血标志物可以识别无症状期AD。
突触功能障碍与AD的发病机制密切相关。研究显示，AD特征病理生物标记物(Aβ和P-tau蛋白)可导致突触病理改变，并且在无症状阶段(临床前阶段)即开始发生改变。AD患者脑内和脑脊液中的突触蛋白水平发生改变，如生长相关蛋白43(growth associatedprotein 43,GAP43)、神经颗粒蛋白(neurogranin)、突触结合蛋白(synaptotagmins)、Rab3A以及突触小体相关蛋白25(synaptosome associated protein 25,SNAP25)等。但脑脊液检测为传统的腰椎穿刺，创伤较大，且具有一定风险。因此，可用于检测AD的外周血标志物显得尤为重要。
基于上述问题，AD的临床治疗急需一种能够有效诊断无症状期AD的方法。
发明内容
本申请发明人通过检测脑脊液和外周血神经元源性外泌体中4种蛋白(GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1)的水平，验证了所述4种蛋白在外周血外泌体中的水平与在脑脊液中的水平具有相关性，证实了所述4种蛋白的外泌体水平可以反映脑内的突触改变。并且，基于这四种蛋白，本申请发明人建立了诊断模型，可在AD症状出现前的至少5年(例如5-7年)进行预测和诊断。
因此，在第一方面，本申请提供了一种用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的方法，其包括：
(1)从受试者获得包含生物标志物的生物样品；
(2)测定生物样品中生物标志物的水平；和
(3)基于所述生物标志物的水平，预测受试者发生神经退行性疾病的风险；
其中，所述生物标志物为GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1。
在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清，血浆或脑脊液。
在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。在此类实施方案中，优选地，在进行步骤(2)之前，对所述生物样品进行预处理，以获得外泌体；然后进行步骤(2)，即，测定外泌体中生物标志物的水平。对生物样品(例如全血，血清和血浆)进行处理以获得外泌体的方法是本领域技术人员已知的。例如，可使用商业化的试剂盒(例如ExoQuick、Exoeasy)从生物样品(例如全血，血清和血浆)中分离获得外泌体。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病(AD)或轻度认知功能障碍(MCI)。
在某些实施方案中，在步骤(3)中，通过将所述生物标志物的水平与参考值进行比较，从而预测受试者发生神经退行性疾病的风险。在此类实施方案中，所述生物标志物的水平可以是所述生物标志物的蛋白质水平或mRNA水平。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质水平。在此类实施方案中，优选地，所述参考值是所述生物标志物在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中，通过免疫学测定来测定所述生物样品中生物标志物的蛋白质水平。在某些实施方案中，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是编码所述生物标志物的mRNA的水平。在此类实施方案中，优选地，所述参考值是所述mRNA在获自正常人群的生物样品中的水平或范围。在某些实施方案中，通过定量PCR来测定所述生物样品中生物标志物的水平。
在某些实施方案中，相对于参考值，外泌体中生物标志物的水平的降低表明，受试者具有发生神经退行性疾病(例如AD或MCI)的风险。在某些实施方案中，相对于参考值，脑脊液中生物标志物的水平的升高表明，受试者具有发生神经退行性疾病(例如AD或MCI)的风险。
在某些实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述4种生物标志物的水平进行岭回归，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者发生神经退行性疾病的风险。在此类实施方案中，所述生物标志物的水平可以是所述生物标志物的蛋白质水平或mRNA水平。在某些优选实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质水平。
在某些实施方案中，所述方法还包括，确定受试者的年龄、性别和ApoEε4基因型。在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，使用弹性网络回归对所述4种生物标志物的水平进行岭回归，并且用年龄、性别和/或ApoEε4基因型进行校正，从而获得预测模型；然后，使用所述预测模型预测受试者发生神经退行性疾病的风险。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述GAP43的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在某些实施方案中，所述神经颗粒蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在某些实施方案中，所述SNAP25的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在某些实施方案中，所述突触结合蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在某些实施方案中，所述方法能够预测受试者在5年或更长时间的范围内(例如5-7年内)发生神经退行性疾病的风险。
在第二方面，提供了一种用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险的试剂盒，所述试剂盒包含用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂，所述生物标志物为GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含用于确定受试者的GAP43水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的神经颗粒蛋白水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的SNAP25水平的第三试剂或试剂组合，和用于确定受试者的突触结合蛋白1水平的第四试剂或试剂组合。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质或mRNA水平。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质水平。在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合)通过免疫学测定来测定所述生物样品中生物标志物的水平。进一步，在某些实施方案中，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。
在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含抗GAP43抗体。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含抗神经颗粒蛋白抗体。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含SNAP25抗体。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含抗突触结合蛋白1抗体。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物上。在某些实施方案中，所述固体支持物选自试纸条，微量滴定板或纤维素膜。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具为抗生物标志物抗体。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是编码所述生物标志物的mRNA的水平。在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合)通过定量PCR来测定所述生物样品中生物标志物的水平。
在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量编码GAP43的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量编码神经颗粒蛋白的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量编码SNAP25的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量编码突触结合蛋白1的mRNA水平的引物和/或探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoEε4基因型的第五试剂。在某些实施方案中，所述第五试剂为检测ApoEε4基因型的引物或探针。
在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病选自AD或MCI。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于预测受试者在5年或更长时间的范围内(例如5-7年内)发生神经退行性疾病的风险。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法预测受试者发生神经退行性疾病的风险。
在第三方面，提供了一种用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预测受试者发生神经退行性疾病的风险；其中，所述生物标志物为GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含用于确定受试者的GAP43水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的神经颗粒蛋白水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的SNAP25水平的第三试剂或试剂组合，和用于确定受试者的突触结合蛋白1水平的第四试剂或试剂组合。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质或mRNA水平。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质水平。在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合)通过免疫学测定来测定所述生物样品中生物标志物的水平。进一步，在某些实施方案中，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。
在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含抗GAP43抗体。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含抗神经颗粒蛋白抗体。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含SNAP25抗体。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含抗突触结合蛋白1抗体。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。在某些实施方案中所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物上。在某些实施方案中，所述固体支持物选自试纸条，微量滴定板或纤维素膜。在某些实施方案中，所述用于捕获生物标志物的工具为抗生物标志物抗体。
在某些实施方案中，所述生物标志物的水平是编码所述生物标志物的mRNA的水平。在某些实施方案中，所述试剂(例如第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合)通过定量PCR来测定所述生物样品中生物标志物的水平。
在某些实施方案中，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量编码GAP43的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量编码神经颗粒蛋白的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量编码SNAP25的mRNA水平的引物和/或探针。在某些实施方案中，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量编码突触结合蛋白1的mRNA水平的引物和/或探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoEε4基因型的第五试剂。在某些实施方案中，所述第五试剂为检测ApoEε4基因型的引物或探针。
在某些实施方案中，所述生物样品为获自受试者的全血，血清，血浆或脑脊液。在某些实施方案中，所述生物样品选自全血，血清和血浆。在某些实施方案中，所述生物样品包含外泌体。
在某些实施方案中，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂组合用于对所述生物样品(例如全血，血清或血浆)进行预处理，以获得外泌体。在某些实施方案中，所述预处理试剂或试剂包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。
在某些实施方案中，所述神经退行性疾病选自AD或MCI。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。
在某些实施方案中，所述试剂盒用于预测受试者在5年或更长时间的范围内(例如5-7年内)发生神经退行性疾病的风险。
在某些实施方案中，所述试剂盒通过上文所述的方法预测受试者发生神经退行性疾病的风险。
术语解释
如本文中所使用的，术语“神经退行性疾病”是一类进行性发展的疾病，以特异性神经元的大量丢失为主要特征。主要包括帕金森病(PD)，阿尔茨海默病(AD)，轻度认知功能障碍(MCI)和肌肉萎缩侧缩硬化症(ALS)等。
如本文中所使用的，术语“阿尔茨海默病(AD)”是老年人常见的神经退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床特征。对于AD的诊断可采用磁共振成像(MRI)、正电子发射断层显像(PET)和生物标志物诊断等方法。
如本文中所使用的，术语“轻度认知功能障碍(MCI)”是指认知下降速度比正常衰老所导致的认知下降大的一种疾病，其可能与患AD的风险较高有关。
如本文中所使用的，术语“外泌体(exosome)”是指直径大约为30-150nm的微小膜泡，由多种细胞分泌，含有特定的蛋白质(例如，外泌体膜上富含参与外泌体运输的跨膜蛋白家族CD63,CD81和CD9)、脂质、细胞因子或遗传物质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。
如本文中所使用的，术语“生物标志物(Biomarker)”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。
如本文中所使用的，术语“生长相关蛋白43”或“GAP43(Growth associatedprotein-43)”又称作neuromodulin，是一个轴突膜蛋白，是一种神经特异性的蛋白质，参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生。在神经元发育和再生过程中，GAP43以高水平表达，能调解轴突延伸作用，改变细胞形态。此外，GAP43作为细胞内信号，可大大增强与G蛋白偶联的受体转运作用。其具体序列可获自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/NP 001123536.1。
如本文中所使用的，术语“神经颗粒蛋白(Neurogranin)”是一种脑特异性蛋白，主要分布于人类或动物的大脑皮层、海马和嗅球等脑区的神经突触后。研究表明，神经颗粒蛋白参与了在学习记忆功能中起核心作用的几种蛋白信号传导途径，长时程增强(Long-termpotentiation,LTP)和长时程抑制(Long-term depression,LTD)等突触可塑性机制。其具体序列可获自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP 001119653.1。
如本文中所使用的，术语“突触小体相关蛋白25(synaptosome associatedprotein 25,SNAP25)”最初是从神经细胞表面分离得到的与神经递质胞吐密切有关的蛋白质，后来发现也存在于其他细胞表面中。SNAP25能够与突触小泡缔合性膜蛋白(VAMP)和突触融合蛋白(Syntaxin)一起形成SNARE复合物，诱导突触释放神经递质。其具体序列可获自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP 001309831.1。
如本文中所使用的，术语“突触结合蛋白1(synaptotagmin-1)”是脑内小突触囊泡和大致密核心囊泡特有的膜内在蛋白质，是在膜融合机制中起重要作用的一个蛋白，可以作为Ca2+感受器调节刺激偶联的快速化学突触传递。其具体序列可获自https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP 001129277.1。
如本文中所使用的，术语“参考值”是指生物标志物的预定值，其是根据对照样品(例如获自正常人群的生物样品)的生物标志物的水平得出的。参考值可以用作阈值，以区分可能存在疾病风险的受试者和不存在该疾病风险的受试者。参考值可以是相对值，有上限和下限的数值范围，平均值，中间值等。本领域技术人员根据现有技术中公开的方法可以选择合适的对照样品、测定并获得参考值。上述方法可以参见，例如，Burtis C.A.et al.,2008,Chapter 14,section“statistical treatment of reference values，其以全部引用方式并入本文。
如本文中所使用的，术语“ApoEε4基因型”是指ApoE基因的一种变异形式，APOE基因有多种可能的变异形式，例如，ε2ε2、ε3ε3、ε4ε4、ε2ε3、ε2ε4和ε3ε4。一些研究表明，携带APOE基因ε4变异体的人群在晚年更容易发展为阿尔茨海默病。
如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特别是哺乳动物，例如人。
发明的有益效果
本申请的方法能够检测无症状期的AD，甚至能够在AD发病前5-7年对受试者患AD的风险进行预测。并且，本申请的方法仅取静脉血即可完成检测，相较传统的腰椎穿刺脑脊液检测，本申请方法具有以下有益技术效果：(1)具有几乎无创伤，低风险等优势；(2)具有成本低的优势，可在社区或简易的医疗机构完成，受检测人员无需住院；(3)可在大范围人群中筛查AD，使得大范围的老年人口筛查成为可能；(4)无需在医院或专业医疗机构完成；(5)成本低廉。
附图说明
图1显示了本研究的数据集，其中，图1A为本研究四个数据集的分组情况，图1B为无症状期AD组与对照组的分划标准。
图2显示了外泌体的检测结果，其中，图2A为外泌体透射电镜的检测结果，图2B为外泌体中Alix的蛋白质印迹法的检测结果，图2C为外泌体中L1CAM的检测结果。
图3显示了外泌体中CD81(图3A)、CD63(图3B)和CD9(图3C)的水平。
图4显示了发现队列，外泌体中GAP43(图4A)、神经颗粒蛋白(图4B)、SNAP25(图4C)和突触结合蛋白1(图4D)的水平，以及脑脊液中GAP43(图4E)、神经颗粒蛋白(图4F)、SNAP25(图4G)和突触结合蛋白1(图4H)的水平。
图5显示了发现队列和验证队列GAP43(图5A)、神经颗粒蛋白(图5B)、SNAP25(图5C)和突触结合蛋白1(图5D)的非标准化水平，无症状期AD研究队列GAP43(图5E)、神经颗粒蛋白(图5F)、SNAP25(图5G)和突触结合蛋白1(图5H)的非标准化水平，以及AD家系研究队列的GAP43(图5I)、神经颗粒蛋白(图5J)、SNAP25(图5K)和突触结合蛋白1(图5L)的非标准化水平。
图6显示了发现队列和验证队列受试者外泌体和脑脊液中生物标志物水平之间的相关性，三角为发现队列，圆圈为验证队列，其中，图6A为AD组受试者的外泌体和脑脊液中GAP43的水平的相关性，图6B为MCI组的GAP43，图6C为对照组的GAP43；图6D为AD组的神经颗粒蛋白，图6E为MCI组的神经颗粒蛋白，图6F为对照组的神经颗粒蛋白；图6G为AD组的SNAP25，图6H为MCI组的SNAP25，图6I为对照组的SNAP25；图6J为AD组的突触结合蛋白1，图6K为MCI组的突触结合蛋白1，图6L为对照组的突触结合蛋白1。
图7显示了发现队列和验证队列受试者外泌体中GAP43(图7A)、神经颗粒蛋白(图7B)、SNAP25(图7C)和突触结合素1(图7D)以及脑脊液中GAP43(图7E)、神经颗粒蛋白(图7F)、SNAP25(图7G)和突触结合素1(图7H)的ROC分析结果，其中，黑色实线为AD vs Con，灰色实线为AD vs aMCI，黑色虚线为aMCI vs Con。黑线对应原来的红线，灰线对应原来的绿线，黑虚线对应原来的蓝线
图8显示了AD患者外泌体中GAP43(图8A)、神经颗粒蛋白(图8B)、SNAP25(图8C)和突触结合素1(图8D)的水平与认知功能的相关性，以及AD患者脑脊液中GAP43(图8E)、神经颗粒蛋白(图8F)、SNAP25(图8G)和突触结合素1(图8H)的水平与认知功能的相关性，三角为发现队列，圆圈为验证队列。
图9显示了无症状期AD研究队列预测价值的结果，其中，图9A为无症状期AD患者的GAP43水平，图9B为无症状期AD患者的神经颗粒蛋白水平，图9C为无症状期AD患者的SNAP25水平，图9D为无症状期AD患者的突触结合蛋白1水平；图9E为无症状期AD患者GAP43的AUC值，图9F为无症状期AD患者神经颗粒蛋白的AUC值，图9G为无症状期AD患者的SNAP25的AUC值，图9H为无症状期AD患者的突触结合蛋白1的AUC值；图9I为总数据集的AUC值，图9J为训练数据集的AUC值，图9K为测试数据集的AUC值，图9L为ApoEε4基因型的AUC值。
图10显示了AD家系研究队列预测价值的结果，其中，图10A为AD家系研究队列患者的GAP43水平，图10B为AD家系研究队列患者的神经颗粒蛋白水平，图9C为AD家系研究队列患者的SNAP25水平，图9D为AD家系研究队列患者的突触结合蛋白1水平；图10E为AD家系研究队列患者GAP43的AUC值，图10F为AD家系研究队列患者神经颗粒蛋白的AUC值，图10G为AD家系研究队列患者的SNAP25的AUC值，图10H为AD家系研究队列患者的突触结合蛋白1的AUC值；图10I为AD家系研究队列数据集的AUC值。
本申请涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure GDA0003077352350000121
Figure GDA0003077352350000131
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中所使用的检测GPA43的ELISA试剂盒购自MyBiosource(USA)，货号为MBS2502209；检测Neurgranin的ELISA试剂盒购自American Research Products(USA)，货号为CEA404Hu；检测SNAP25的ELISA试剂盒购自Proteintech(USA)，货号为KE00031；检测CD9的ELISA试剂盒购自LifeSpan BioSciences(USA)，货号为LS-F24209-1；检测CD63的ELISA试剂盒购自RayBiotech(USA)，货号为ELH-CD63-1；检测CD81的ELISA试剂盒购自LifeSpan BioSciences(USA)，货号为LS-F7468-1。
实施例1：数据集与统计方法
1.1研究的数据集
本研究共纳入4个数据集(图1A)：发现队列、验证队列、无症状期AD研究队列和AD家系研究队列。
在发现队列，从北京地区招募受试者(n＝82例，其中包括AD患者28例、MCI患者25例、健康对照组29例)。
在验证队列，从山东、贵州、河南、河北、吉林、广西和内蒙古自治区等其他地区招募受试者(n＝216例，其中包括AD患者73例、MCI患者71例、健康对照组72例)。
在无症状期AD研究队列中，在2012-2014年招募受试者320例，其中包括正常对照和无症状期AD各160例。这些受试者在基线期均为认知正常者，进行血液采集，随后通过随访观察其脑脊液标志物和认知功能改变(2019年；5-7年的观察期)，将基线期和随访期均为认知正常者归为正常对照组，基线期认知正常而随访期诊断为AD者归为无症状期AD组(图1B)。
在AD家系研究队列中，从中国家族性阿尔茨海默病网络(Chinese FamilialAlzheimer's Disease Network,CFAN)招募认知正常受试者121例，其中AD致病基因突变携带者59例(在预期发病年龄5-7年内)，AD致病基因突变非携带者62例。
AD的诊断标准依据2011年美国国家衰老研究院-阿尔茨海默协会(NationalInstitute on Aging-Alzheimer’s Association,NIA-AA)诊断标准；MCI的诊断依据Peterson诊断标准。此外，根据脑脊液P-tau/Aβ42(临界值取0.14)和T-tau/Aβ42(临界值取0.67)的比值确定AD和正常对照，以增加临床诊断的可靠性。所有受试者或其法定监护人均已取得充分知情并签署书面同意书。本研究获得首都医科大学宣武医院机构审查委员会的批准。
1.2统计方法
使用SPSS 22.0和Stata 13.0进行统计学分析。发现队列和验证队列的数据进行独立分析。计数资料的组间比较采用卡方检验，计量资料的组间比较采用t检验或方差分析(ANOVA)。采用线性回归模型进行相关性分析。在发现队列和验证队列，在生成校正后的受试者工作特征(ROC)曲线后，采用年龄、性别和ApoEε4基因型作为协变量的二元logistic回归模型计算预测值。对于无症状期AD研究队列和AD家系研究队列，计算容忍度、方差膨胀系数、特征根和条件指数等参数以检验线性回归模型中的多重共线性。为了建立突触蛋白预测模型时避免多重共线性，在Stata 13.0中使用弹性网络回归进行了岭回归，并在岭回归中校正了年龄、性别和ApoEε4基因型(具体方法参见：胡良平.岭回归分析[J].四川精神卫生,2018,03:193-196.；万丽颖.岭回归分析及其应用[J].许昌学院学报,2016,35(2):19-23.)。使用SPSS22.0将数据集随机分为训练数据集(总计0.67)和测试数据集(总计0.33)。所有分析采用双尾检验，显著性差异水平设置为P<0.05。
实施例2：外周血神经元源性外泌体的收集和检测
2.1外泌体的收集
采集所有受试者的清晨空腹(禁食12小时)静脉血20ml，采集管使用含乙二胺四乙酸(EDTA)的聚丙烯管。为获取神经元源性外泌体，全血样本在首都医科大学宣武医院的中央实验室进行处理。在北京以外其他地区采集的血样，需立即将样品在室温下以4200×g离心10分钟以获得血浆，然后储存在4℃下，使用干冰保存在12小时内运送到宣武医院中央实验室。在发现队列(数据集1)和验证队列(数据集2)，血样送达中央实验室后便立即进行处理，根据已发表方案的方法分离出特定的神经元源性外泌体(参见Jia L,Qiu Q,Zhang H,et al.Concordance between the assessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau inperipheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinal fluid.AlzheimersDement 2019；15(8):1071-80.PMID:31422798)。对于无症状期AD研究队列(数据集3)和AD家系研究队列(数据集4)，将血浆样本保存在-80℃下，直至分离外泌体。外泌体的分离首先使用ExoQuick外泌体沉淀溶液(EXOQ；System Biosciences，CA)从血清中收集总的外泌体，然后使用小鼠抗人神经细胞粘附分子(NCAM)抗体通过免疫共沉淀法分离神经元源性外泌体，并通过EZ-Link sulfo-NHS-生物素系统(Thermo Fisher Scientific)进行生物素标记。
2.2外泌体的验证
根据已发表的方案，采用透射电镜(TEM)和蛋白质印迹法明确外泌体分离结果，并通过检测L1细胞粘附分子(L1CAM)的水平以明确神经元源性外泌体的富集(参见Jia L,QiuQ,Zhang H,et al.Concordance between the assessment of Abeta42,T-tau,and P-T181-tau in peripheral blood neuronal-derived exosomes and cerebrospinalfluid.Alzheimers Dement 2019；15(8):1071-80.PMID:31422798)。
AD患者的神经元源性外泌体的透射电镜如图2A所示。蛋白质印迹法分析表明，Alix(其作为外泌体或者细胞外囊泡的标志物)仅在外泌体中表达，在上清液或阴性对照中不表达(图2B)。免疫沉淀外泌体中的L1CAM含量比非免疫沉淀外泌体的L1CAM含量增加了约10倍(图2C)。以上结果证实了本研究成功收集了神经元源性外泌体。
2.3脑脊液(CSF)的采集
参照国际指南收集脑脊液。简言之，在进行腰穿时，受试者左侧卧位，取L3-L5椎间盘间隙作为穿刺部位，采集15ml的CSF样品，并在室温下以2,000×g离心10分钟，然后将CSF样品分装至聚丙烯管中，在-80℃保存。所有受试者腰穿后监测至少12h。
2.4突触蛋白水平检测
首先进行初步试验，以确定ELISA分析的检测范围。结果发现，突触结合蛋白1的浓度高于检测范围，因此在后续实验中相应地对待测样本进行稀释。每组中CD81水平的平均值设置为1.00，并采用相对比值以标准化。所有检测结果均在ELISA试剂盒的检测范围内。所有检测均采用盲法进行。
我们检测了所有受试者中CD9、CD63和CD81的水平，结果如图3所示，四个数据集在AD、MCI和对照组之间均未发现CD9、CD63和CD81的差异(所有P>0.05)。CD81水平用于对后续的外泌体突触蛋白检测进行标准化。然后，我们在发现队列和验证队列检测外周血神经元源性外泌体和脑脊液(CSF)中的突触蛋白(图4)。在发现队列，AD组的外泌体中GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的浓度(分别为1996±515、250±67、493±144和302±80pg/ml)显著低于对照组(分别为2738±724、2010±530、634±166和597±151pg/ml，P<0.001)；且，它们在MCI组中的浓度(分别为2372±450、1567±445、575±144和448±117pg/ml)显著高于AD组(P<0.05或0.001)，但显著低于对照组(P<0.05)(图4A-D)。在验证队列发现同样的结果，即AD组的外泌体中GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的浓度(分别为1926±509、254±69、489±114和312±81pg/ml)显着低于对照组(分别为2722±664、2099±540、628±166和586±153pg/ml，P<0.001)；而它们在MCI组中的浓度(分别为2325±606、1511±390、569±152和442±115pg/ml)显著高于AD组(P<0.001)，但显著低于对照组(P<0.001)(图4A-D)。此外，GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的非标准化水平(图5)与CD81标准化水平结果相似。这些数据表明，外周血神经元源性外泌体中的突触蛋白有助于AD或MCI与正常对照的鉴别诊断。另外，在发现队列和验证队列，AD组的外泌体中GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的浓度显著高于对照组；且它们在MCI组中的浓度也显著高于对照组(图4E-H)(P<0.05和P<0.01或0.001)。
实施例3：外泌体突触蛋白与脑脊液突触蛋白的相关性
为了验证神经元源性外泌体中的GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1能否作为AD诊断的候选标志物，我们对外泌体突触蛋白和CSF突触蛋白之间进行了相关性分析。在发现队列，我们发现GAS43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的血液外泌体水平与CSF水平呈显著负相关(图6)：AD组的GAP43，R2＝0.65，P<0.0001，图6A；MCI组的GAP43，R2＝0.70，P<0.0001，图6B；对照组的GAP43，R2＝0.67，P<0.0001，图6C；AD组的神经颗粒蛋白，R2＝0.58，P<0.0001，图6D；MCI组的神经颗粒蛋白，R2＝0.54，P<0.0001，图6E；对照组的神经颗粒蛋白，R2＝0.57，P<0.0001，图6F；AD组的SNAP25，R2＝0.63，P<0.0001，图6G；MCI组的SNAP25 R2＝0.64，P<0.0001，图6H；对照组的SNAP25，R2＝0.64，P<0.0001，图6I；AD组的突触结合蛋白1，R2＝0.61，P<0.0001，图6J；MCI组的突触结合蛋白1，R2＝0.62，P<0.0001，图6K；对照的突触结合蛋白1，R2＝0.61，P<0.0001，图6L。然后，我们在验证数据集中确认了相关性分析，并发现外泌体和CSF生物标志物之间存在相同的关联性(图6)。我们发现外泌体和脑脊液中的GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1的水平存在高度相关性。这表明，外泌体突触蛋白反映了脑内的突触病理变化，从而有助于AD的临床诊断。
实施例4：外泌体与脑脊液突触蛋白的诊断效能
为了分析外泌体和脑脊液中突触蛋白对于鉴别AD或MCI患者与正常对照的诊断效能，我们进行了ROC分析。结果显示，外泌体和CSF的GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1水平的ROC曲线下面积(AUC)明显较高，远远超过了随机效应(AUC为50％)。在验证队列，GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1在AD和对照的鉴别中具有显著的AUC(外泌体的GAP43为0.83，P<0.0001，图7A；CSF的GAP43为0.90，P<0.0001，图7E；外泌体的神经颗粒蛋白为1.00，P<0.0001，图7B；CSF神经颗粒蛋白为0.94，P<0.0001，图7F；外泌体的SNAP25，0.75，P<0.0001，图7C；CSF的SNAP25为0.74，P<0.0001，图7G；外泌体的突触结合蛋白1为0.95，P<0.0001，图7D；CSF的突触结合蛋白1为0.80，P<0.0001，图7H)；在MCI与正常对照的鉴别中同样具有显著的AUC(外泌体的GAP43，0.66，P<0.001，图7A；CSF的GAP43为0.91，P<0.001，图7E；外泌体的神经颗粒蛋白，0.82，P<0.0001，图7B；CSF的神经颗粒蛋白为0.95，P＜0.0001，图7F；外泌体的SNAP25为0.59，P＝0.05，图7C；CSF的SNAP25为0.73，P＜0.0001，图7G；外泌体的突触结合蛋白1，为0.82，P<0.0001，图7D；CSF的突触结合蛋白1为0.77，P<0.0001，图7H)。然而，在MCI与AD鉴别中，尽管外泌体突触蛋白的AUC很显著，但CSF突触蛋白的AUC却不明显(外泌体的GAP43为0.68，P＝0.0001，图7A；CSF的GAP43为0.53，P＝0.55，图7E；外泌体的神经颗粒蛋白，1.00，P<0.0001，图7B；CSF的神经颗粒蛋白为0.50，P＝0.99，图7F；外泌体的SNAP25为0.66，P＝0.0011，图7C；CSF的SNAP25为0.51，P＝0.83，图7G；外泌体的突触结合蛋白1为0.76，P<0.0001，图7D；CSF的突触结合蛋白1为0.55，P＝0.29，图7H)。此外，发现队列的ROC分析显示了相似的结果。这些数据表明外泌体的GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1水平有助于AD和MCI的临床诊断。
实施例5：外泌体突触蛋白与MMSE评分的相关性
为了进一步分析外泌体突触蛋白水平与AD认知功能下降之间的关系，我们对发现队列和验证队列的AD患者的外泌体GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1水平与简易精神状态量表(简称MMSE，其是目前使用最广泛的痴呆认知筛查工具，筛查的认知领域主要包括记忆，定向，注意力，视空间及言语功能)的得分进行了线性相关分析。结果显示，MMSE评分与外泌体的GAP43(发现：R2＝0.59，P<0.0001；验证：R2＝0.59，P<0.0001，图8A)、神经颗粒蛋白(发现：R2＝0.60，P<0.0001；验证：R2＝0.62，P<0.0001，图8B)、SNAP25(发现：R2＝0.58，P<0.0001；验证：R2＝0.59，P<0.0001，图8C)以及突触结合蛋白1(发现：R2＝0.60，P<0.0001；验证：R2＝0.58，P<0.0001，图8D)之间均有显著相关性。我们还评估了CSF突触蛋白的性能，结果显示，MMSE评分与CSF的GAP43(发现：R2＝0.46，P<0.0001；验证：R2＝0.40，P<0.0001，图8E)、神经颗粒蛋白(发现：R2＝0.37，P<0.0006；验证：R2＝0.31，P<0.0001，图8F)、SNAP25(发现：R2＝0.45，P<0.0001；验证：R2＝0.49，P<0.0001，图8G)以及突触结合蛋白1(发现：R2＝0.50，P<0.0001；验证：R2＝0.43，P<0.0001，图8H)之间也存在相关性(图8E-H)。我们的数据表明，外泌体GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1有助于预测AD患者的认知功能下降。
实施例6：外泌体突触蛋白在无症状期AD的预测作用
我们的数据显示，无症状期AD患者的GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1水平(分别为2573±653、1938±510、568±135和546±135pg/ml)较对照组(分别为2726±704、2049±491、600±145和597±149pg/ml，P＝0.045-0.050)显著降低(图9A-D)。ROC分析显示，单个生物标志物的AUC范围从0.56到0.60(图9E-H)，表明单个生物标志物无法有效诊断无症状期AD，这可能是由于无症状期AD患者中外泌体突触蛋白的改变较轻微所致。因此，GAP43、神经颗粒蛋白，SNAP25和突触结合蛋白1不能用于独立预测AD的发生。但是，将四种外泌体突触蛋白组合在一起，在Stata 13.0中使用弹性网络回归进行了岭回归，并校正了年龄、性别和ApoEε4基因型，最终生成了模型，发现其可以有效地预测无症状期AD(图9I-K)，总数据集的AUC为0.88(图9I)。为了避免过度拟合，我们将整个数据集分为训练数据集和测试数据集。该预测模型是在训练数据集中生成的，然后应用到测试数据集进行验证。结果发现，训练数据集的AUC为0.89(图9J)，测试数据集的AUC为0.89(图9K)。这些结果表明，预测模型拟合良好，可以在其他数据集中使用。此外，独立分析了ApoEε4基因型的ROC，其AUC显示为0.61(图9L)。这些结果表明，外泌体GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋的组合，可以产生高性能的预测模型。
进一步，我们在AD家系研究队列的受试者中测试了该预测模型。为此，我们首先测量了AD家系研究队列中外泌体生物标志物的单一水平(图10A-D)，结果表明，AD致病突变携带者的外泌体GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1水平(分别为2515±692、1890±540、555±143和534±143pg/ml)显著低于非携带者(分别为2714±673、2029±473、600±140和597±150pg/ml，P＝0.046-0.13)。但是，ROC分析显示，单个生物标记物的AUC较差，范围从0.56到0.60(图10E-H)。这些数据与无症状期AD数据集中的数据相似。我们将无症状期AD研究队列数据集生成的模型应用于AD受试者，发现AUC为0.87(图10I)，这表明，上述预测模型在AD突变携带者中同样具有较高的性能。因此，可以认为，外泌体GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1组合生成的预测模型，有助于在发病前5-7年对AD进行预测。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 首都医科大学宣武医院
<120> 一种预测神经退行性疾病风险的方法和试剂盒
<130> IDC200256
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> GAP43
<400> 1
Met Thr Lys Ser Cys Ser Glu Leu Cys His Pro Ala Leu His Phe Leu
1 5 10 15
Pro Cys Leu Gly Gly Leu Arg Lys Asn Leu Gln Arg Ala Val Arg Pro
20 25 30
Ser Pro Tyr Ser Leu Gly Phe Leu Thr Phe Trp Ile Ser Arg Val Glu
35 40 45
Lys Asn Asp Asp Asp Gln Lys Ile Glu Gln Asp Gly Ile Lys Pro Glu
50 55 60
Asp Lys Ala His Lys Ala Ala Thr Lys Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly
65 70 75 80
His Ile Thr Arg Lys Lys Leu Lys Gly Glu Lys Lys Asp Asp Val Gln
85 90 95
Ala Ala Glu Ala Glu Ala Asn Lys Lys Asp Glu Ala Pro Val Ala Asp
100 105 110
Gly Val Glu Lys Lys Gly Glu Gly Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Thr Gly Ser Lys Pro Asp Glu Pro Gly Lys Ala Gly Glu Thr Pro
130 135 140
Ser Glu Glu Lys Lys Gly Glu Gly Asp Ala Ala Thr Glu Gln Ala Ala
145 150 155 160
Pro Gln Ala Pro Ala Ser Ser Glu Glu Lys Ala Gly Ser Ala Glu Thr
165 170 175
Glu Ser Ala Thr Lys Ala Ser Thr Asp Asn Ser Pro Ser Ser Lys Ala
180 185 190
Glu Asp Ala Pro Ala Lys Glu Glu Pro Lys Gln Ala Asp Val Pro Ala
195 200 205
Ala Val Thr Ala Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Ala Glu Asp Ala Ala
210 215 220
Ala Lys Ala Thr Ala Gln Pro Pro Thr Glu Thr Gly Glu Ser Ser Gln
225 230 235 240
Ala Glu Glu Asn Ile Glu Ala Val Asp Glu Thr Lys Pro Lys Glu Ser
245 250 255
Ala Arg Gln Asp Glu Gly Lys Glu Glu Glu Pro Glu Ala Asp Gln Glu
260 265 270
His Ala
<210> 2
<211> 78
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 神经颗粒蛋白
<400> 2
Met Asp Cys Cys Thr Glu Asn Ala Cys Ser Lys Pro Asp Asp Asp Ile
1 5 10 15
Leu Asp Ile Pro Leu Asp Asp Pro Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Lys
20 25 30
Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His Met Ala Arg Lys Lys Ile Lys Ser
35 40 45
Gly Glu Arg Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ala
50 55 60
Gly Val Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Asp
65 70 75
<210> 3
<211> 206
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> SNAP25
<400> 3
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Asp Arg Val Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asn His Ile Asn Gln Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Lys Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Cys Cys Gly Leu Phe Ile Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
180 185 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200 205
<210> 4
<211> 422
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 突触结合蛋白1
<400> 4
Met Val Ser Glu Ser His His Glu Ala Leu Ala Ala Pro Pro Val Thr
1 5 10 15
Thr Val Ala Thr Val Leu Pro Ser Asn Ala Thr Glu Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met
35 40 45
Asn Glu Leu His Lys Ile Pro Leu Pro Pro Trp Ala Leu Ile Ala Ile
50 55 60
Ala Ile Val Ala Val Leu Leu Val Leu Thr Cys Cys Phe Cys Ile Cys
65 70 75 80
Lys Lys Cys Leu Phe Lys Lys Lys Asn Lys Lys Lys Gly Lys Glu Lys
85 90 95
Gly Gly Lys Asn Ala Ile Asn Met Lys Asp Val Lys Asp Leu Gly Lys
100 105 110
Thr Met Lys Asp Gln Ala Leu Lys Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu
115 120 125
Thr Asp Gly Glu Glu Lys Glu Glu Pro Lys Glu Glu Glu Lys Leu Gly
130 135 140
Lys Leu Gln Tyr Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gln Asn Asn Gln Leu Leu
145 150 155 160
Val Gly Ile Ile Gln Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly
165 170 175
Thr Ser Asp Pro Tyr Val Lys Val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys
180 185 190
Lys Phe Glu Thr Lys Val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Val Phe Asn
195 200 205
Glu Gln Phe Thr Phe Lys Val Pro Tyr Ser Glu Leu Gly Gly Lys Thr
210 215 220
Leu Val Met Ala Val Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp Ile
225 230 235 240
Ile Gly Glu Phe Lys Val Pro Met Asn Thr Val Asp Phe Gly His Val
245 250 255
Thr Glu Glu Trp Arg Asp Leu Gln Ser Ala Glu Lys Glu Glu Gln Glu
260 265 270
Lys Leu Gly Asp Ile Cys Phe Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly
275 280 285
Lys Leu Thr Val Val Ile Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp
290 295 300
Val Gly Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Ile His Leu Met Gln Asn
305 310 315 320
Gly Lys Arg Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Ile Lys Lys Asn Thr Leu
325 330 335
Asn Pro Tyr Tyr Asn Glu Ser Phe Ser Phe Glu Val Pro Phe Glu Gln
340 345 350
Ile Gln Lys Val Gln Val Val Val Thr Val Leu Asp Tyr Asp Lys Ile
355 360 365
Gly Lys Asn Asp Ala Ile Gly Lys Val Phe Val Gly Tyr Asn Ser Thr
370 375 380
Gly Ala Glu Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg
385 390 395 400
Pro Ile Ala Gln Trp His Thr Leu Gln Val Glu Glu Glu Val Asp Ala
405 410 415
Met Leu Ala Val Lys Lys
420

Claims (30)

1.用于确定生物样品中生物标志物水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于预测受试者在7年内发生阿尔茨海默病(AD)的风险；其中，所述生物标志物为GAP43、神经颗粒蛋白、SNAP25和突触结合蛋白1；
其中，所述生物样品为全血，血清或血浆中的外泌体。
2.权利要求1的用途，所述试剂盒包含用于确定受试者的GAP43水平的第一试剂或试剂组合，用于确定受试者的神经颗粒蛋白水平的第二试剂或试剂组合，用于确定受试者的SNAP25水平的第三试剂或试剂组合，和用于确定受试者的突触结合蛋白1水平的第四试剂或试剂组合。
3.权利要求2的用途，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质或mRNA水平。
4.权利要求3所述的用途，其中，所述生物标志物的水平是所述生物标志物的蛋白质水平。
5.权利要求4所述的用途，所述试剂通过免疫学测定来测定所述生物样品中生物标志物的水平。
6.权利要求5所述的用途，所述试剂包括第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合。
7.权利要求6所述的用途，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。
8.权利要求6所述的用途，所述第一试剂或试剂组合包含抗GAP43抗体。
9.权利要求6所述的用途，所述第二试剂或试剂组合包含抗神经颗粒蛋白抗体。
10.权利要求6所述的用途，所述第三试剂或试剂组合包含SNAP25抗体。
11.权利要求6所述的用途，所述第四试剂或试剂组合包含抗突触结合蛋白1抗体。
12.权利要求4所述的用途，所述试剂盒还包括用于捕获生物标志物的工具。
13.权利要求12所述的用途，所述用于捕获生物标志物的工具位于固体支持物上。
14.权利要求13所述的用途，所述固体支持物选自试纸条，微量滴定板或纤维素膜。
15.权利要求13所述的用途，所述用于捕获生物标志物的工具为抗生物标志物抗体。
16.权利要求3所述的用途，其中，所述生物标志物的水平是编码所述生物标志物的mRNA的水平。
17.权利要求16所述的用途，所述试剂通过定量PCR来测定所述生物样品中生物标志物的水平。
18.权利要求17所述的用途，所述试剂包括第一、第二、第三和/或第四试剂或试剂组合。
19.权利要求17所述的用途，所述第一试剂或试剂组合包含能够定量编码GAP43的mRNA水平的引物和/或探针。
20.权利要求17所述的用途，所述第二试剂或试剂组合包含能够定量编码神经颗粒蛋白的mRNA水平的引物和/或探针。
21.权利要求17所述的用途，所述第三试剂或试剂组合包含能够定量编码SNAP25的mRNA水平的引物和/或探针。
22.权利要求17所述的用途，所述第四试剂或试剂组合包含能够定量编码突触结合蛋白1的mRNA水平的引物和/或探针。
23.权利要求1-22任一项所述的用途，其中，所述试剂盒还包含用于确定受试者的ApoEε4基因型的第五试剂。
24.权利要求23所述的用途，所述第五试剂为检测ApoEε4基因型的引物或探针。
25.权利要求1所述的用途，所述试剂盒还包含，对生物样品进行预处理的预处理试剂或试剂组合。
26.权利要求25所述的用途，所述预处理试剂或试剂组合用于对来自受试者的生物样品进行预处理，以获得外泌体。
27.权利要求25所述的用途，所述预处理试剂或试剂组合包含外泌体沉淀溶液，以及任选的缓冲液。
28.权利要求1所述的用途，所述受试者为哺乳动物。
29.权利要求28所述的用途，其中，所述哺乳动物为人。
30.权利要求1所述的用途，所述试剂盒用于预测受试者在5年内发生AD的风险。
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