CN103674938A - 缺血修饰白蛋白组合测定试剂、测定方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
缺血修饰白蛋白组合测定试剂、测定方法及试剂盒,其组合测定试剂包括试剂1:包括10~500mg/100m1氯化钴溶液、pH7.0~8.0为盐酸三乙醇胺缓冲液;试剂2:二硫苏糖醇0.01~2%的水溶液;试剂3:0.25~3.5mg/m1DTT显色剂;试剂盒包括盒体,所述盒体内部具有用以盛装检测试剂的腔体,所述盒体具有检测试剂出口,且所述出口设置有封盖,所述盒体的外壁设置有隔热层。本发明检测结果较之传统技术更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域,具体涉及一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂及利用其对缺血修饰白蛋白的测定方法,以及盛装所述试剂的试剂盒 。
背景技术
缺血修饰白蛋白(Ischemia-modified albumin,简称IMA)是指在临床缺血或再灌注医疗手段发生时,由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变,这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白称为缺血修饰白蛋白。
人血清白蛋白(Human serum albumin简称HSA)是一种循环蛋白,由585个氨基酸序列(66500Da)组成,其氨基末端(N-terminus)是人类所特有的一段序列。己有研究证实HSA的氨基末端即为过渡金属钴、铜和镍等离子的结合位点。HSA上这些金属的结合点、位点与其他动物的白蛋白相比容易被生物化学因素降解而破坏。当发生缺血时,细胞内及细胞外氧供给减少、酸性代谢产物增多、细胞膜能量依赖的钠泵破坏、钙泵失控,这些因素将导致HSA氨基末端结构改变,使HSA与金属的结合能力降低。短暂缺血后发生的再灌注会产生大量的自由基,同时游离铜离子和铁离子暴露,将进一步加重HSA这种改变,这是机体“牺牲”白蛋白以对抗缺氧、避免和尽量减少组织损伤的一种机制。
美国Bar-Or D(以下简称Bar-Or D方法)等发明了IMA的快速检测方法和试剂盒。该发明的基本原理为:正常对照组的血清样品中白蛋白以活性形式存在,加入过度已知量的钴离子溶液后,钴离子即可与白蛋白结合,溶液中未结合钴离子浓度较低;而心肌缺血病人的血清样品中含有较多缺血性修饰白蛋白,加入同样浓度钴离子溶液后,由于IMA与钴离子结合的能力弱,溶液中存在较高浓度的未结合钴离子,未结合钴离子与显色剂发生颜色反应后,采用分光光度比
色仪在450-500nm处检测样品吸光度,所得数据与一已知标准IMA曲线进行对照,即可得出IMA值,其测定值用每毫升单位(U/ml )表示。具体测试步骤如下:在被测血清中加入过度已知量的钴离子溶液形成混合液,摇匀在18-37℃温育至少4-5分钟,反应pH7-9较佳;将二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol,简称DTT)显色剂与上述混合液摇匀反应,随后加入氯化钠溶液,采用全自动生化分析仪,在450-500nm处检测样品吸光度,所得OD值与一个已知标准的IMA动力学曲线进行对照,即可得到IMA值,其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
虽然IMA的检测在诊断心肌缺血方面具有明显的优势,但是目前上述已有技术的缺血性修饰白蛋白的检测方法明显存在下列的不足,严重影响了临床的进一步推广使用:
1.已有技术IMA试剂盒及检侧方法不能在中小型生化分析仪或分光光度仪上使用
目前美国Inverness公司销售的IMA检测试剂盒只能在极少数几种日立和罗士型号的全自动生化仪上使用,而这几种型号的全自动生化仪在我国医院中没有。一般来说,只要有上机参数,生化试剂盒就应能在各个厂牌的全自动生化仪上使用,已有技术不能在一般生化仪上使用可能的原因是其IMA试剂盒检测的IMA阴阳性OD值没有很明显的差异,信号太弱需要特别放大。由于手工分光光度仪上或中小型生化分析仪不能将微小的光电信号差别进行成一千上万倍的有效
放大,不适合使用。而我国医院的急诊化验室一般不配备大型生化分析仪,但ACS都为急诊病人,这为IMA指标在临床快速诊断心肌缺血方面推广使用形成了障碍。
2.已有技术IMA动力学曲线OD值很小的变动就可使IMA值在很大的范围内变动
根据Bar-Or D方法IMA动力学曲线,横座标OD值从阴性低值到阳性高值只在小于0.3范围内变动,而纵座标IMA值在200左右单位的大范围内变动,就是说OD值轻微变动,会引起IMA值很大的变化,这样,IMA阴性高值样品很容易变成阳性,IMA阳性低值样品很可能被高估,这种变化可能是由系统误差引起的,并不一定是由样品本身内在差异所引起,从而会造成病人缺血性状况的高估或低估,会使临床判断造成错误。
3.己有技术试剂盒及检测方法特异性不高
已有技术试剂盒检测IMA的阳性预测值(Positive Predictive Value,简称PPV)较低,主要是IMA阴性样品OD值非特异性升高,当背景干扰足够大时就可使IMA阴性结果超过临界值变成IMA假阳性,使得IMA的阳性预测值较低,某种程度上降低了IMA在临床上的使用价值。
综上所述,急性冠状动脉综合症病情险恶,IMA是早期缺血的理想参考指标,但已有技术试剂盒及检测方法上的不足又限止了其进一步推广使用,因此迫切需要开发一种检测IMA的试剂盒并通过去除背景干扰,特别是能降低IMA阴性样品的OD值从而能提高IMA的特异性;需要一种不会由于OD值微小变化就使IMA值产生较大变化的动力学曲线;需要一种能满足普遍的中小型自动生化分析仪甚至一般分光光度仪手工检测IMA的试剂盒;一种床边快速试剂以满足临床ACS诊断急切、简便和正确的需要。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂及测定方法,从而解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:
一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂,包括
试剂1
包括10~500mg/100m1氯化钴溶液、pH7.0~8.0为盐酸三乙醇胺缓冲液;
试剂2
二硫苏糖醇0.01~2%的水溶液;
试剂3
0.25~3.5mg/m1DTT显色剂。
一种缺血修饰白蛋白测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂1,在波长取值范围在340~700nm的生化分析仪或分光光度计下,将试剂1与病人生物样品混合,在18-37℃孵育5分钟,成第一混合液,然后在上述波长范围之波长下比色,读取第一混合液光密度Al;
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离,从混合液中分离去除背景干扰物质,得第二混合液;
(3)配制试剂2,在波长取值范围在340~700nm的生化分析仪或分光光度计下,将20~400μl的试剂2加入至步骤(2)所述的第二混合液中,反应5分钟,得到第三混合液,然后再在上述波长范围之波长下比色,读取第三混合液的光密度A2;
(4)依据A1、A2,按下述计算式计算测定第一结果:
1)、每毫升血清结合1μl的二价钴离子为1个单位;
2)、标准品配制:精确测定Co2浓度,然后测定标准品的吸光度变化计算每毫升标准品中白蛋白消耗Co的数,从而获得标准品的值;
(5)配制试剂3,将试剂3加入到步骤(3)所述的第三混合液中,将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应;
(6)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度;
(7)所得数据与标准曲线相对照,即可得到第二结果;
(8)得到的第一结果和第二结果取均值,得到缺血修饰白蛋白的最终测定结果。
一种用于盛装所述组合测定试剂的试剂盒,包括盒体,所述盒体内部具有用以盛装检测试剂的腔体,所述盒体具有检测试剂出口,且所述出口设置有封盖,所述盒体的外壁设置有隔热层。
作为一种改进,所述隔热层包括内层泡沫板和外层隔热板。
作为一种进一步的改进,所述外层隔热板内部为真空腔体。
由于采用了以上技术方案,本发明具有以下有益效果:
1.社会效益:缺血修饰白蛋白的测定是临床生化中一个重要指标。缺血修饰白蛋白组合测定试剂预期用途为对急性心肌缺血的辅助诊断,排除急性冠脉综合症(ACS)以及ACS危险性分层。
2.经济效益:随着医疗诊断技术水平的提高和临床需要,产品需求大量增加。一个较高的经济效益是完全可以预期的。
3.提高了检测的特异性。对于IMA阴性样品,样品中的白蛋白结合了较多的钴离子,未结合的钴离子较少,与显色剂反应后,OD值本应较低。但已有技术试剂盒测得的偏高的阴性OD值与IMA阳性OD值差值较小,甚至高于阳性样品,导致己有技术检测方法的试剂盒特异性差,这是因为以各种形式白蛋白为主的背景干扰物质与显色剂也产生显色反应并与未结合的钴离子的OD值叠加所致。本发明试剂盒及其检测方法中通过去除白蛋白背景干扰物质,使OD值主要与未结合的钴离子相关,从而显示出真实的IMA阴性OD值,这是本发明试剂盒特异性提高的关键。而对于IMA阳性样品,由于IMA不能结合钴离子,未结合的钴离子较多,与显色剂反应后,多数未结合的钴离子贡献了比背景干扰物质大得多的OD值,通过去除白蛋白,对OD值降低的影响不大。这样IMA阴阳性的OD值差趾就可明显分开,提高了检测试剂盒及其检测方法的特异性,满足临床判断的需要。
4.有较平坦的动力学反应曲线。发明的动力学反应曲线比较平坦,为取得同样IMA值变化,本发明和已有技术所要求OD值变化范围是不同的。如OD值变化0.1,本发明IMA值变化约为15单位,而已有技术1MA单位变化较大约为75单位。而OD值0.1变化可能是由背景或系统误差引起的,并不一定是由样品本身内在差异所引起。因此本发明不会将由系统误差造成IMA值变化导致被测样品IMA病情高估或低估,并其结果能在一般的分光光度仪上就能测出,给临床医生一个更真实的IMA参考结果。
5.适宜在分光光度比色仪和中小型全自动生化分析仪上使用。已有技术由于阴阳性OD值差异小,要求配备特殊的价格昂贵的具有很强光电信号的生化仪器才能使用。我国医院的大型全自动生化分析仪往往放在住院部,而急诊检测科配备的绝大部分是分光光度比色仪和中小型全自动生化分析仪。一般来讲胸痛患者都是急诊病人,需要急诊化验,采用本发明试剂盒,利用现有常规设备,在半小时左右就能测得IMA值米判断心肌缺血的情况。
6. 本发明提供的试剂盒结构简单,在盒体的外壁设置有隔热层,隔热层包括内层泡沫板和外层隔热板,从而能够实现对检测试剂的有效隔热,保证检测试剂的稳定性。
综上所述,本发明检测结果较之传统技术更加准确。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。
实施例1
一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂,包括
试剂1
包括250mg/100m1氯化钴溶液、pH7.5为盐酸三乙醇胺缓冲液;
试剂2
二硫苏糖醇1.5%的水溶液;
试剂3
1.5mg/m1DTT显色剂。
一种缺血修饰白蛋白测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂1,在波长取值范围在500nm的生化分析仪或分光光度计下,将试剂1与病人生物样品混合,在20℃孵育5分钟,成第一混合液,然后在上述波长范围之波长下比色,读取第一混合液光密度Al;
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离,从混合液中分离去除背景干扰物质,得第二混合液;
(3)配制试剂2,在波长取值范围在500nm的生化分析仪或分光光度计下,将20~400μl的试剂2加入至步骤(2)所述的第二混合液中,反应5分钟,得到第三混合液,然后再在上述波长范围之波长下比色,读取第三混合液的光密度A2;
(4)依据A1、A2,按下述计算式计算测定第一结果:
1)、每毫升血清结合1μl的二价钴离子为1个单位;
2)、标准品配制:精确测定Co2+浓度,然后测定标准品的吸光度变化计算每毫升标准品中白蛋白消耗Co2+的数,从而获得标准品的值;
(5)配制试剂3,将试剂3加入到步骤(3)所述的第三混合液中,将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应;
(6)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度;
(7)所得数据与标准曲线相对照,即可得到第二结果;
(8)得到的第一结果和第二结果取均值,得到缺血修饰白蛋白的最终测定结果。
实施例2
一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂,包括
试剂1
包括10mg/100m1氯化钴溶液、pH7.0为盐酸三乙醇胺缓冲液;
试剂2
二硫苏糖醇0.01%的水溶液;
试剂3
0.25mg/m1DTT显色剂。
一种缺血修饰白蛋白测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂1,在波长取值范围在340nm的生化分析仪或分光光度计下,将试剂1与病人生物样品混合,在18℃孵育5分钟,成第一混合液,然后在上述波长范围之波长下比色,读取第一混合液光密度Al;
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离,从混合液中分离去除背景干扰物质,得第二混合液;
(3)配制试剂2,在波长取值范围在340nm的生化分析仪或分光光度计下,将20μl的试剂2加入至步骤(2)所述的第二混合液中,反应5分钟,得到第三混合液,然后再在上述波长范围之波长下比色,读取第三混合液的光密度A2;
(4)依据A1、A2,按下述计算式计算测定第一结果:
1)、每毫升血清结合1μl的二价钴离子为1个单位;
2)、标准品配制:精确测定Co2+浓度,然后测定标准品的吸光度变化计算每毫升标准品中白蛋白消耗Co2+的数,从而获得标准品的值;
(5)配制试剂3,将试剂3加入到步骤(3)所述的第三混合液中,将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应;
(6)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度;
(7)所得数据与标准曲线相对照,即可得到第二结果;
(8)得到的第一结果和第二结果取均值,得到缺血修饰白蛋白的最终测定结果。
实施例3
一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂,包括
试剂1
包括500mg/100m1氯化钴溶液、pH8.0为盐酸三乙醇胺缓冲液;
试剂2
二硫苏糖醇2%的水溶液;
试剂3
3.5mg/m1DTT显色剂。
一种缺血修饰白蛋白测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂1,在波长取值范围在700nm的生化分析仪或分光光度计下,将试剂1与病人生物样品混合,在37℃孵育5分钟,成第一混合液,然后在上述波长范围之波长下比色,读取第一混合液光密度Al;
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离,从混合液中分离去除背景干扰物质,得第二混合液;
(3)配制试剂2,在波长取值范围在700nm的生化分析仪或分光光度计下,将400μl的试剂2加入至步骤(2)所述的第二混合液中,反应5分钟,得到第三混合液,然后再在上述波长范围之波长下比色,读取第三混合液的光密度A2;
(4)依据A1、A2,按下述计算式计算测定第一结果:
1)、每毫升血清结合1μl的二价钴离子为1个单位;
2)、标准品配制:精确测定Co2+浓度,然后测定标准品的吸光度变化计算每毫升标准品中白蛋白消耗Co2+的数,从而获得标准品的值;
(5)配制试剂3,将试剂3加入到步骤(3)所述的第三混合液中,将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应;
(6)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度;
(7)所得数据与标准曲线相对照,即可得到第二结果;
(8)得到的第一结果和第二结果取均值,得到缺血修饰白蛋白的最终测定结果。
另外,本发明提供的试剂采用如下结构的试剂盒盛装。
一种用于盛装所述组合测定试剂的试剂盒,包括盒体,所述盒体内部具有用以盛装检测试剂的腔体,所述盒体具有检测试剂出口,且所述出口设置有封盖,所述盒体的外壁设置有隔热层。
本实施例中,所述隔热层包括内层泡沫板和外层隔热板。
本实施例中,所述外层隔热板内部为真空腔体。
Claims (5)
1.一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂,其特征在于:包括
试剂1
包括10~500mg/100m1氯化钴溶液、pH7.0~8.0为盐酸三乙醇胺缓冲液;
试剂2
二硫苏糖醇0.01~2%的水溶液;
试剂3
0.25~3.5mg/m1DTT显色剂。
2.如权利要求1所述组合测定试剂对缺血修饰白蛋白测定方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)配制试剂1,在波长取值范围在340~700nm的生化分析仪或分光光度计下,将试剂1与病人生物样品混合,在18-37℃孵育5分钟,成第一混合液,然后在上述波长范围之波长下比色,读取第一混合液光密度Al;
(2)使用离心超滤、免疫磁珠、亲和层析柱、免疫层析膜或免疫渗滤膜分离,从混合液中分离去除背景干扰物质,得第二混合液;
(3)配制试剂2,在波长取值范围在340~700nm的生化分析仪或分光光度计下,将20~400μl的试剂2加入至步骤(2)所述的第二混合液中,反应5分钟,得到第三混合液,然后再在上述波长范围之波长下比色,读取第三混合液的光密度A2;
(4)依据A1、A2,按下述计算式计算测定第一结果:
1)、每毫升血清结合1μl的二价钴离子为1个单位;
2)、标准品配制:精确测定Co2浓度,然后测定标准品的吸光度变化计算每毫升标准品中白蛋白消耗Co的数,从而获得标准品的值;
(5)配制试剂3,将试剂3加入到步骤(3)所述的第三混合液中,将DTT显色剂与分离出的未结合钴离子进行显色反应;
(6)采用分光光度比色或反射光分析测定有色化合物颜色的强度;
(7)所得数据与标准曲线相对照,即可得到第二结果;
(8)得到的第一结果和第二结果取均值,得到缺血修饰白蛋白的最终测定结果。
3.一种盛装如权利要求1所述组合测定试剂的试剂盒,其特征在于:包括盒体,所述盒体内部具有用以盛装检测试剂的腔体,所述盒体具有检测试剂出口,且所述出口设置有封盖,所述盒体的外壁设置有隔热层。
4.一种盛装如权利要求3所述组合测定试剂的试剂盒,其特征在于:所述隔热层包括内层泡沫板和外层隔热板。
5.一种盛装如权利要求4所述组合测定试剂的试剂盒,其特征在于:所述外层隔热板内部为真空腔体。
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CN105606418A (zh) * | 2015-12-30 | 2016-05-25 | 李新华 | 一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒及其检测方法 |
CN106093017A (zh) * | 2016-04-28 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法 |
CN108152225A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-06-12 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒 |
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CN108152225A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-06-12 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒 |
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