CN104406949A - 用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法，涉及科研和医学草酸检测领域，该试剂包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶，该方法包括以下步骤，收集、纯化待测样品，得到纯化待测液后，分为若干份，配制标定待测液，将每份标定待测液分为两组：测定组和对比组，向测定组加入草酸测定试剂，得到荧光待测组；向对比组加入草酸背景试剂得到对比待测组后测定荧光值，得到草酸的检出限为1.5～3nmol/L。本发明能够实现高通量检测、在科学研究与临床医学检测中使用，该方法的灵敏度较高，可靠性较好。
Description
技术领域
本发明涉及科研和医学草酸检测领域，具体涉及一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法。
背景技术
Ox(oxalic acid，草酸)是一种分子式为C2O4H2、分子量为90.04的二元有机酸。人体中的草酸包括外源性草酸和内源性草酸，外源性草酸是指通过饮食摄入的草酸，内源性草酸是指人体肝脏自身代谢产生的草酸，正常人体内的外源性草酸和内源性草酸的含量基本相同。草酸在人体内为最终产物，无法被进一步代谢降解，只能经过血液循环至泌尿系统排出体外。
人体内血液和尿液中的草酸含量过高时，容易与钙离子形成不溶性的草酸钙晶体，草酸钙晶体容易在膀胱、肾脏等器官内沉积、形成结石。因此，通过检测人体血液或尿液中的草酸含量，能够判断患者是否罹患草酸钙形成的结石，进而帮助医生给出合适的治疗方案。
现有的临床检测草酸的方法包括高效液相色谱法、离子色谱法、辣根过氧化物酶显色法、酶电极法和酶联免疫法，现有的方法在使用时，存在以下缺陷：
(1)离子色谱法使用的DX120色谱系统装配有型号为IonPacAS11的分析色谱柱，离子色谱法测试时，先将待测血浆样品放入超滤离心管，在温度为4℃的条件下离心30min除去待测样品中的血清蛋白，得上清液，向上清液中加入浓度2mol/L的盐酸进行酸化，该方法测得健康人血浆中草酸的浓度为1.47±0.15umol/L、SD大鼠血浆中草酸的浓度为9.88±0.91umol/L。色谱系统设备的成本较高，检测过程容易受到操作过程和外界环境影响，得到的结果准确度较低；色谱系统每次只能检测一个样品，不能实现高通量检测，因而难以在科学研究与临床检测中的使用。
(2)美国Trinity公司研发的草酸测试试剂盒采用HRP(辣根过氧化物酶)显色法，通过大麦草酸氧化酶将待测样品中的草酸氧化为二氧化碳和过氧化氢，过氧化氢在HRP作用下与MBTH(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)和DMAB(3-(dimethylamino)benzoic acid)反应生成化合物indamine dye，由于Indamine dye在590nm处有特征吸收峰，因此，能够根据Indamine dye反应前后在590nm处吸收峰的变化值计算得到样品中草酸的含量。
大麦草酸氧化酶的最适pH为3.2，HRP的最适pH为5.0～5.2，两者的最适pH值差别较大，在实际使用时，难以使得大麦草酸氧化酶和HRP均达到较高的活性，此外，Indamine dye的灵敏度较低，误差较大，只能检测草酸含量较高的样品，难以用于血液样品的检测；尿液中含有维生素C等物质，容易干扰Indamine dye的灵敏度，因此，需要对待测的尿液进行多次纯化，步骤比较繁琐，因而难以在临床检测中应用。
(3)方跃等人用丙酮提取法从香蕉皮中提取草酸氧化酶-丙酮粗提物后，与戊二醛交联并偶合于氧电极，制成香蕉皮-丙酮粉浆草酸组织传感器，用于尿样中草酸测定，该传感器的工作曲线线性范围为10～500umol/L，检测限为2.5umol/L，效寿命可维持30天。该传感器的操作比较复杂、稳定性较差、且有效寿命较短，难以在临床检测中的使用。
(4)上海研谨生物科技有限公司用纯化的大鼠草酸抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入大鼠草酸，再与HRP标记的草酸抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)显色，TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度。由于草酸的分子量较小，与单抗作用后容易脱落，形成的抗体-抗原-酶标抗体复合物经过彻底洗涤后，有效成分的含量较低，该方法检测的灵敏度较低，可靠性较差。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。
在上述技术方案的基础上，所述试剂包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
在上述技术方案的基础上，所述试剂包括pH值为5.4的缓冲溶液、浓度为10umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为1U/ml的HRP和浓度为0.1U/ml的草酸氧化酶。
一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒，包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶，至少1瓶试剂瓶包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。
在上述技术方案的基础上，所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶；至少1瓶试剂瓶包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液，至少1瓶试剂瓶包括浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.5～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
在上述技术方案的基础上，包括放置有pH值为5.0～6.0的缓冲溶液的试剂瓶，房子有浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料的试剂瓶，放置有浓度为0.5～2U/ml的HRP的试剂瓶，放置有浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶的试剂瓶。
一种用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，包括以下步骤：
A、向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umolAmplex red、100～2000U HRP和10～1000U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂；
向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umol Amplexred、和100～2000U HRP，得到草酸背景试剂；
向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂；
B、收集、纯化待测样品，得到纯化待测液；将纯化待测液均分为若干份，向若干份纯化待测液中依次加入不同体积的标准草酸试剂，直至纯化待测液中草酸的浓度为0～100umol/L，得到若干份草酸浓度不同标定待测液；
C、将每份标定待测液平均分配为两组，将一组均作为测定组，另一组均作为对比组，向测定组加入草酸测定试剂并混合均匀，得到荧光待测组；向对比组加入草酸背景试剂，混合均匀，得到对比待测组后；在温度为15℃～40℃的条件下，将荧光待测组和对比待测组孵育20～60min；
D、测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，根据荧光值计算纯化待测液中草酸的浓度；所述草酸浓度的检出限为1.5～3nmol/L。
在上述技术方案的基础上，步骤C包括以下步骤：依次将若干份标定待测液点入酶标板的孔中，每份标定待测液至少点入4个孔，将每份标定待测液对应的孔平均分为两组：测定组和对比组，向测定组中所有的孔内均加入50～90ul的草酸测定试剂，混合均匀，得到荧光待测组；向对比组中所有的孔内均加入与草酸测定液体积相同的草酸背景试剂，得到对比待测组，将荧光待测组和对比待测组均放置于温度为15℃～40℃的条件下孵育20～60min。
在上述技术方案的基础上，步骤D包括以下步骤：在激发光为538nm、发射光为590nm的条件下，测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，计算得到荧光待测组中每份标定待测液的平均荧光值，作为草酸测定样品平均荧光值；计算得到对比待测组中每份标定待测液的平均荧光值作为草酸对比样品平均荧光值；
根据公式“样品草酸荧光值＝草酸测定样品平均荧光值-草酸对比样品平均荧光值”，计算每份标定待测液对应的草酸荧光值，以荧光值为纵轴，草酸浓度为横轴，根据所有标定待测液的草酸荧光值和对应的草酸浓度作图，得到待测液的草酸标准曲线；标准曲线中，Y为纵轴的取值，X轴为横轴的取值，当Y＝0时，|X|为纯化待测液中草酸的浓度。
在上述技术方案的基础上，所述得到待测液的草酸标准曲线之后，计算标准曲线中Y＝0时，|X|的值之前，还包括以下步骤：计算待测液的草酸标准曲线的拟合优度R2值，根据R2计算R，若R＞0.98，则为正常，计算标准曲线中Y＝0时，|X|的值；若R＜0.98，为异常，重复执行步骤B～步骤C。
在上述技术方案的基础上，所述草酸含量的检出限为2.5nmol/L。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明中的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法，其检出限为1.5～3nmol/L，血草酸浓度回收率为96.51～102.38％，尿草酸浓度回收率为96.95～103％，与现有技术中Indaminedye的灵敏度较低，误差较大，只能检测草酸含量较高的样品，难以用于血液样品的检测相比，本发明方法灵敏度较高，误差较小，能够同时应用于尿液和血液样品的检测。
(2)本发明中用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，将纯化后的样品直接加入试剂盒中，通过荧光仪检测反应后的试剂的荧光，进而确定尿液和血液中草酸的浓度，与现有技术中通过离子色谱或者香蕉皮丙酮粉浆草酸组织传感器检测，步骤比较繁琐，检测时间较长，成本较高，难以高通量检测相比，本发明方法的步骤比较简单，检测时间较短，不仅成本较低，而且能够实现高通量检测，能用于临床检测。
(3)本发明的草酸氧化酶在pH值为4.0～7.5的条件下均能保持较高的活性，与辣根过氧化物酶兼容性好。草酸氧化酶在氧气的作用下将待测样品中的草酸氧化为二氧化碳及过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化物酶的作用下与Amplex Red反应，生成最终产物Resorufin(试卤灵，9-羟基-3-异吩恶嗪酮或7-羟基-3H-吩恶嗪-3-酮)，该荧光物质与草酸含量正相关，从而可以计算得到样品中草酸的含量。与现有技术中大麦草酸氧化酶与HRP兼容性不好，与现有技术中由于草酸的分子量较小，与单抗作用后容易脱落，形成的抗体-抗原-酶标抗体复合物经过彻底洗涤后，有效成分的含量较低，检测的灵敏度较低，可靠性较差相比，本发明的方法不仅灵敏度较高，而且可靠性较好。
附图说明
图1为本发明中实施例1的草酸浓度与荧光强度的曲线图；
图2为本发明中实施例2的草酸浓度与荧光强度的曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例中的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L(本发明实施例中，最佳为10umol/L)的Amplex red(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)荧光染料、浓度为0.1～2U/ml(本发明实施例中，最佳为1U/ml)的HRP和浓度为0.01～1.0U/ml(本发明实施例中，最佳为0.1U/ml)的草酸氧化酶，本实施例中，选择活性pH为4.0～7.5的草酸氧化酶，缓冲溶液选用EDTA(乙二胺四乙酸)、柠檬酸钠或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)。
本发明实施例中的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，一般包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
本发明实施例中的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒，包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。至少1瓶试剂瓶包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。
本发明实施例中的试剂盒，包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。至少1瓶试剂瓶包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液，至少1瓶试剂瓶包括浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.5～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
一种用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，包括以下步骤：
S1：配制草酸测定试剂，向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umol Amplex red、100～2000U HRP和10～500U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umol Amplex red、和100～2000U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
S2：收集待测样品，判断样品是否为血液，若是，转入S201；若否，转入S202。
S201：采取血液加入含肝素钠的抗凝试管，将肝素抗凝试管置于冰盒中存放10min以内，放入温度为4℃、转速为5000g的离心机中离心5min，弃血细胞得到血浆，取0.5ml血浆，向血浆中加入浓度为2mol/L的盐酸至血浆的pH值为2.0～4.0，得到酸化血浆。
将酸化血浆放入型号为10KD的超滤离心管中，在温度为4℃、转速为5000g的离心机中离心30min，取滤液，得到纯化待测液，将纯化待测液放置于温度为-80℃的条件下存放，存放时间在1周以内。
S202：向尿液中加入浓度为2mol/L的盐酸酸化至尿液的pH值低于2.0，得到酸化尿液，将酸化尿液置于温度为-80℃的条件下存放，存放时间在1周以内；测试前将酸化尿液解冻，按体积份，向1份酸化尿液中加入99份浓度为0.1mol/L、pH值为5.4的柠檬酸缓冲液，得到稀释样品，将1ml稀释样品加入活性炭萃取小柱或者96孔活性炭过滤板后，静止5min或5000g离心1min过滤，得到纯化待测液，将纯化待测液置于温度为4℃的条件下保存。
S3：将纯化待测液均分为若干份，向若干份纯化待测液中依次加入不同体积的标准草酸试剂至草酸的浓度为0～100umol/L，得到若干份标定待测液，若干份标定待测液中草酸的浓度均不相同。
S4：依次将若干份标定待测液点入酶标板的孔中，每份标定待测液至少点入4个孔，将每份标定待测液对应的孔平均分为两组：测定组和对比组，向测定组中所有的孔内均加入50～90ul的草酸测定试剂，混合均匀，得到荧光待测组；向对比组中所有的孔内均加入与草酸测定液体积相同的草酸背景试剂，得到对比待测组，将荧光待测组和对比待测组均放置于温度为25℃的条件下孵育20～60min。
S5：使用荧光酶标仪，在激发光为538nm、发射光为590nm的条件下，测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，计算得到荧光待测组中每份标定待测液的平均荧光值，作为草酸测定样品平均荧光值；计算得到对比待测组中每份标定待测液的平均荧光值作为草酸对比样品平均荧光值。
S6：根据公式“样品草酸荧光值＝草酸测定样品平均荧光值-草酸对比样品平均荧光值”，计算每份标定待测液对应的草酸荧光值，以荧光值为纵轴，草酸浓度为横轴，根据所有标定待测液的草酸荧光值和对应的草酸浓度作图，得到待测液的草酸标准曲线。
S7：计算待测液的草酸标准曲线的拟合优度R2值，根据R2计算R，若R大于0.98，则为正常；若R小于0.98，为异常，重复执行S2～S6。
S8：该测定的草酸标准曲线上，Y为纵轴的取值，X轴为横轴的取值。计算标准曲线中，Y＝0时，|X|的值，|X|为纯化待测液中草酸的浓度。
发明实施例的检测尿液和血液中草酸含量的方法，得到的检出限为1.5～3nmol/L(本发明实施例中的检出限为2.5nmol/L)，血液中草酸浓度回收率为96.51～102.38％，尿液中草酸浓度回收率为96.95～103％。
下面，通过9个实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明
实施例1
步骤101：配制草酸测定试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10umol Amplex red、1000U HRP和100U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10umol Amplex red、和1000U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤102：取数量大于20的正常待测大鼠血清等比例混合，得到标准血清池。按照S201的处理方法，得到纯化待测液。
步骤103：取350ul纯化待测液，分为7份，每份50ul，向第一份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为0umol/L，得到第一待测样A1；向第二份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为10umol/L，得到第二待测样A2；第三份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为20umol/L，得到第三待测样A3；第四份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为30umol/L，得到第四待测样A4；第五份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为40umol/L，得到第五待测样A5；第六份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为50umol/L，得到第六待测样A6；第七份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为60umol/L，得到第七待测样A7。
步骤104：在全黑色不透明的96孔荧光酶标板中，选择相邻的28个孔所在的区域，作为待测区域，将28个孔均分为7组：B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7，每组均包括4个孔，将A1点入B1的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A2点入B2的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A3点入B3的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A4点入B4的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A5点入B5的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A6点入B6的4个孔中，每个孔中均点入10ul；将A7点入B7的4个孔中，每个孔中均点入10ul。
步骤105：从每组已加入待测样的4个孔中的任意2个孔中，均加入90ul草酸测定试剂，混合均匀，将所有加入草酸测定试剂的孔作为荧光待测组；向每组已加入待测样的另外两个孔中，均加入90ul草酸背景试剂，混合均匀，将所有加入草酸背景试剂的孔作为对比待测组。将荧光待测组和对比待测组放置于温度为25℃的条件下孵育30min。
步骤106：使用荧光酶标仪，在激发光为538nm、发射光为590nm的条件下，测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，计算得到荧光待测组中每份标定待测液的平均荧光值，作为草酸测定样品平均荧光值；计算得到对比待测组中每份标定待测液的平均荧光值作为草酸对比样品平均荧光值。
步骤107：根据公式“样品草酸荧光值＝草酸测定样品平均荧光值-草酸对比样品平均荧光值”，计算每份标定待测液对应的草酸荧光值，以荧光值为纵轴，草酸浓度为横轴，根据A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7的草酸荧光值和对应的草酸浓度作图，待测液的草酸标准曲线。
步骤108：计算待测液的草酸标准曲线的R值，若该曲线的R值大于0.98，则为正常；若R值小于0.98，为异常，重复执行步骤102～步骤107。
参见图1所示，本实施例中，待测血液的草酸标准曲线为Y＝0.244x+2.162，R2＝0.999，血液样品中草酸的浓度为8.860umol/L。
实施例2
尿草酸浓度的测定
步骤201：配制草酸测定试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10umol Amplex red、1000U HRP和100U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10umol Amplex red、和1000U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为5.4的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤202：取数量大于20的正常待测大鼠尿液等比例混合，得到标准尿液池。按照S202的处理方法，得到纯化待测液。
步骤203：取400ul纯化待测液，分为8份，每份50ul，向第一份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为0umol/L，得到第一待测样C1；向第二份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为10umol/L，得到第二待测样C2；第三份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为20umol/L，得到第三待测样C3；第四份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为30umol/L，得到第四待测样C4；第五份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为40umol/L，得到第五待测样C5；第六份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为50umol/L，得到第六待测样C6；第七份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为60umol/L，得到第七待测样C7；第八份纯化待测液中加入标准草酸试剂并混合均匀至草酸浓度为70umol/L，得到第八待测样C8。
步骤204：在全黑色不透明的96孔荧光酶标板中，选择8组带有4个平行孔的区域，作为待测区域，在该区域中，将C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8分别点入位于不同组的4个平行孔中，每个孔中点入的量均为10ul。
步骤205：从每组已加入待测样的4个孔中的任意2个孔中，均加入90ul草酸测定试剂，混合均匀，将所有加入草酸测定试剂的孔作为荧光待测组；向每组已加入待测样的另外两个孔中，均加入90ul草酸背景试剂，混合均匀，将所有加入草酸背景试剂的孔作为对比待测组。将荧光待测组和对比待测组放置于温度为25℃的条件下孵育30min。
步骤206：使用荧光酶标仪，在激发光为538nm、发射光为590nm的条件下，测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，计算得到荧光待测组中每份标定待测液的平均荧光值，作为草酸测定样品平均荧光值；计算得到对比待测组中每份标定待测液的平均荧光值作为草酸对比样品平均荧光值。
步骤207：根据公式“样品草酸荧光值＝草酸测定样品平均荧光值-草酸对比样品平均荧光值”，计算每份标定待测液对应的草酸荧光值，以荧光值为纵轴，草酸浓度为横轴，根据C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8的草酸荧光值和对应的草酸浓度作图，待测液的草酸标准曲线。
步骤208：计算待测液的草酸标准曲线的R值，若该曲线的R值大于0.98，则为正常；若R值小于0.98，为异常，重复执行步骤102～步骤107。
参见图2所示，本实施例中，尿液草酸标准曲线为Y＝0.6694X+2.942，R2＝0.997，尿液样品中草酸的浓度为440umol/L，本实施例中尿液样品中的草酸浓度为440umol/L。
实施例3
步骤301：配制草酸测定试剂，向每升pH值为4.0的缓冲溶液中加入1umol Amplex red、100U HRP和10U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为4.0的缓冲溶液中加入1umolAmplex red、和100U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为4.0的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤302：本步骤与实施例1中的步骤102相同。
步骤303：本步骤与实施例1中的步骤103相同。
步骤304：本步骤与实施例1中的步骤104相同。
步骤305：本步骤与实施例1中的步骤105相同。
步骤306：本步骤与实施例1中的步骤106相同。
步骤307：本步骤与实施例1中的步骤107相同。
步骤308：本步骤与实施例1中的步骤108相同。
本实施例中，血液草酸标准曲线为Y＝0.218x+2.02，R2＝0.999，血液样品中草酸的浓度为9.266umol/L。
实施例4
步骤401：配制草酸测定试剂，向每升pH值为7.5的缓冲溶液中加入50umol Amplex red、2000U HRP和1000U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为7.5的缓冲溶液中加入50umol Amplex red、和2000U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为7.5的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤402：本步骤与实施例1中的步骤102相同。
步骤403：本步骤与实施例1中的步骤103相同。
步骤404：本步骤与实施例1中的步骤104相同。
步骤405：本步骤与实施例1中的步骤105相同。
步骤406：本步骤与实施例1中的步骤106相同。
步骤407：本步骤与实施例1中的步骤107相同。
步骤408：本步骤与实施例1中的步骤108相同。
本实施例中，血液草酸标准曲线为Y＝0.229x+2.217，R2＝0.994，血液样品中草酸的浓度为9.68umol/L。
实施例5
步骤501：配制草酸测定试剂，向每升pH值为5.0的缓冲溶液中加入5umol Amplex red、500U HRP和100U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为5.0的缓冲溶液中加入5umolAmplex red和500U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为5.0的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤502：本步骤与实施例1中的步骤102相同。
步骤503：本步骤与实施例1中的步骤103相同。
步骤504：本步骤与实施例1中的步骤104相同。
步骤505：本步骤与实施例1中的步骤105相同。
步骤506：本步骤与实施例1中的步骤106相同。
步骤507：本步骤与实施例1中的步骤107相同。
步骤508：本步骤与实施例1中的步骤108相同。
本实施例中，血液草酸标准曲线为Y＝0.216x+2.012，R2＝0.997，血液样品中草酸的浓度为9.315umol/L。
实施例6
步骤601：配制草酸测定试剂，向每升pH值为6.0的缓冲溶液中加入20umol Amplex red、2000U HRP和500U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂。
配制草酸背景试剂，向每升pH值为6.0的缓冲溶液中加入20umol Amplex red、和2000U HRP，得到草酸背景试剂(草酸背景试剂除没有加入草酸氧化酶外，其他的成分和浓度均与草酸测定试剂相同)。
配制标准草酸试剂，向每升pH值为6.0的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂。
步骤602：本步骤与实施例1中的步骤102相同。
步骤603：本步骤与实施例1中的步骤103相同。
步骤604：本步骤与实施例1中的步骤104相同。
步骤605：本步骤与实施例1中的步骤105相同。
步骤606：本步骤与实施例1中的步骤106相同。
步骤607：本步骤与实施例1中的步骤107相同。
步骤608：本步骤与实施例1中的步骤108相同。
本实施例中，血液草酸标准曲线为Y＝0.227x+2.214，R2＝0.995，血液样品中草酸的浓度为9.75umol/L。
实施例7
为了评估实验方法的准确性，本发明设计实验进行评估草酸的回收率，以判定本发明测定结果的可靠性。
选择10只大鼠
步骤701：本步骤与实施例1中的步骤102相同。
步骤702：向每份纯化血清中均加入20umol/L草酸，得到10份对应的待测血清，测定所有待测血清的荧光吸收值，计算每份血清的草酸浓度。
表1大鼠血草酸浓度回收率测定
参见表1所示，本发明实施例中测定血液中草酸浓度的回收率为96.51～102.38％。
实施例8
选择10只大鼠
步骤801：本步骤与实施例2中的步骤202相同。
步骤802：向每份纯化尿液中均加入20umol/L草酸，得到10份对应的待测尿液，测定所有待测尿液的荧光吸收值，计算每份尿液的草酸浓度。
参见表2所示，本发明实施例中测定血液中草酸浓度的回收率为97.6～103％。
表2大鼠尿草酸浓度回收率测定
实施例9
高草酸尿大鼠模型与正常大鼠的血草酸及尿草酸对比，乙二醇在动物体内的代谢产物为草酸。
为了验证方法的可行性，本实施例将20只SD大鼠随机均分为两组，作为实验组(编号为1～10)和对照组(编号为11～20)，向实验组大鼠喂食常规鼠粮和浓度为1.0％的乙二醇饮水；向对照组大鼠喂食常规鼠粮及饮水。
一周后，采集所有实验组和对照组大鼠的血液和尿液，采用实施例1的方法测定实验组和对照组大鼠的血液中的草酸含量。采用实施例2的方法测定实验组和对照组大鼠的尿液液中的草酸含量。
参见表3所示，实验组中的大鼠血草酸浓度为22.81～47.82umol/L，实验组中的大鼠血草酸浓度为1.46～2.97mmol/L；对照组大鼠血草酸浓度为7.06～10.31umol/L，对照组中的大鼠尿草酸浓度为0.27～0.57mmol/L。
参见表3所示，喂食乙二醇大鼠组的血草酸及尿草酸浓度均显著高于对照组，说明本检测方法可以明确的测定出高草酸尿模型动物与正常动物的血草酸及尿草酸含量。
表3体内草酸浓度不同的大鼠测试对比
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
Claims (10)
1.一种用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的辣根过氧化物酶HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。
2.如权利要求1所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
3.如权利要求2所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂，其特征在于：所述试剂包括pH值为5.4的缓冲溶液、浓度为10umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为1U/ml的HRP和浓度为0.1U/ml的草酸氧化酶。
4.一种基于权利要求1所述的试剂制成的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括若干试剂瓶，每个试剂瓶中放置有一种或多种试剂，试剂包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液、浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.1～2U/ml的HRP和浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶；
至少1瓶试剂瓶包括pH值为4.0～7.5的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为1～50umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.01～1.0U/ml的草酸氧化酶。
5.如权利要求4所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的试剂盒，其特征在于：所述试剂包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液、浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料、浓度为0.5～2U/ml的HRP和浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶，至少1瓶试剂瓶包括pH值为5.0～6.0的缓冲溶液；至少1瓶试剂瓶包括浓度为5～20umol/L的Amplex red荧光染料；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.5～2U/ml的HRP；至少1瓶试剂瓶包括浓度为0.1～0.5U/ml的草酸氧化酶。
6.一种用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，包括以下步骤：
A、向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umolAmplex red、100～2000U HRP和10～1000U草酸氧化酶，得到草酸测定试剂；
向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入1～50umol Amplexred、和100～2000U HRP，得到草酸背景试剂；
向每升pH值为4.0～7.5的缓冲溶液中加入10mmol草酸，得到标准草酸试剂；
B、收集、纯化待测样品，得到纯化待测液；将纯化待测液均分为若干份，向若干份纯化待测液中依次加入不同体积的标准草酸试剂，直至纯化待测液中草酸的浓度为0～100umol/L，得到若干份草酸浓度不同标定待测液；
C、将每份标定待测液平均分配为两组，将一组均作为测定组，另一组均作为对比组，向测定组加入草酸测定试剂并混合均匀，得到荧光待测组；向对比组加入草酸背景试剂，混合均匀，得到对比待测组后；在温度为15℃～40℃的条件下，将荧光待测组和对比待测组孵育20～60min；
D、测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，根据荧光值计算纯化待测液中草酸的浓度；所述草酸浓度的检出限为1.5～3nmol/L。
7.如权利要求6所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，其特征在于，步骤C包括以下步骤：依次将若干份标定待测液点入酶标板的孔中，每份标定待测液至少点入4个孔，将每份标定待测液对应的孔平均分为两组：测定组和对比组，向测定组中所有的孔内均加入50～90ul的草酸测定试剂，混合均匀，得到荧光待测组；向对比组中所有的孔内均加入与草酸测定液体积相同的草酸背景试剂，得到对比待测组，将荧光待测组和对比待测组均放置于温度为15℃～40℃的条件下孵育20～60min。
8.如权利要求6所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，其特征在于，步骤D包括以下步骤：在激发光为538nm、发射光为590nm的条件下，测定孵育后的荧光待测组和对比待测组的荧光值，计算得到荧光待测组中每份标定待测液的平均荧光值，作为草酸测定样品平均荧光值；计算得到对比待测组中每份标定待测液的平均荧光值作为草酸对比样品平均荧光值；
根据公式“样品草酸荧光值＝草酸测定样品平均荧光值-草酸对比样品平均荧光值”，计算每份标定待测液对应的草酸荧光值，以荧光值为纵轴，草酸浓度为横轴，根据所有标定待测液的草酸荧光值和对应的草酸浓度作图，得到待测液的草酸标准曲线；标准曲线中，Y为纵轴的取值，X轴为横轴的取值，计算标准曲线中Y＝0时，|X|的值，|X|为纯化待测液中草酸的浓度。
9.如权利要求8所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，其特征在于：所述得到待测液的草酸标准曲线之后，计算标准曲线中Y＝0时，|X|的值之前，还包括以下步骤：计算待测液的草酸标准曲线的拟合优度R2值，根据R2计算R，若R＞0.98，则为正常，计算标准曲线中Y＝0时，|X|的值；若R＜0.98，为异常，重复执行步骤B～步骤C。
10.如权利要求6至9中任一项所述的用于检测尿液和血液中草酸含量的方法，其特征在于：所述草酸含量的检出限为2.5nmol/L。
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