CN114164253A - 一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条及其制备、使用方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于尿液中草酸浓度快速检测的条带显色式试纸条及其制备、使用方法与应用，试纸条由样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫四个部分交叠组成，该方法在试纸条的结合垫上加载草酸氧化酶和辣根过氧化物酶，在反应膜上用显色剂均匀间隔划线多条。试纸条的检测限低于0.3mM，检测范围覆盖了从正常人到高草酸尿症患者的尿液中草酸浓度范围。本发明无需传统比色法依赖的图像采集和处理设备，实现了草酸的“无设备”检测，具有操作简便、成本低廉、可现场即时检测的优点；试纸条可大批量制备，广泛适用于家庭监测和床旁检测，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于即时检验技术领域，具体涉及一种条带显色式试纸条及其制备，以及半定量检测尿液中草酸的使用方法及其应用。
背景技术
肾结石是泌尿外科中最常见的疾病之一，全球人口患病率高达5％-10％，且在世界范围内发病率和流行率不断上升，并且其在5—10年内有高复发的可能性。在各种类型的肾结石中，草酸钙结石是泌尿系统中发病率最高的结石。临床上已经证明尿液中草酸的排泄量在草酸钙结石形成中起关键作用，高草酸尿被认为是与草酸钙结石高度相关的临床指标。目前临床诊断通过影像学手段判断结石的形成在疾病防治方面具有滞后性，因此，尿液中的草酸作为肾结石早期筛查的疾病标志物具有重要的检测意义。
目前已开发出多种方法来测量食物、尿液或血浆中的草酸盐，如分光光度法、离子色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、安培生物传感器、毛细管电泳法、电化学法等。上述检测方法具有较高的灵敏度和特异性，然而大都依赖昂贵而复杂的设备、大量的样品、有毒而昂贵的试剂和专业技术人员，不适用于即时检验(POCT)。而较为新型的检测手段如基于酶法的比色传感器虽然很大程度上降低了检测要求和成本，但还是需要图像采集和分析设备来获取结果。在现有产品方面，来自Sigma公司和Trinity公司的草酸检测试剂盒都是通过反应前后特征吸收峰的变化值来计算草酸浓度，因此也都需要专业设备来测定吸光值。
综上所述，目前草酸的检测还依赖于大型实验室设备或比色装置，但在一些发展落后地区或者资源短缺的特殊场景中，POCT的重要诉求之一就是“无设备”检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，并考虑到试纸条是实现“无设备”POCT的主要形式之一，目前在市面上易于获得的尿常规试纸条并没有将草酸列为目标检测物质，另外，典型的传统试纸条大部分还是采用免疫测定法，不适用于草酸小分子的检测，因此，提供了一种条带显色式试纸条及其制备，以及半定量检测尿液中草酸的使用方法及其应用。
在本发明一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，包括：样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫、底衬和负载在结合垫上的草酸氧化酶和辣根过氧化物酶以及以多条间隔划线的形式负载在反应膜上的显色剂。
进一步地，所述条带显色式试纸条在检测时，一定体积的样液被加至样品垫上，样液中的草酸流至结合垫时先在草酸氧化酶的催化作用下被氧化，生成的过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下能与反应膜上划线处的显色剂发生显色反应，使得划线处的显色剂从无色变为有色的条带；在条带显色的同时过氧化氢也被相应消耗，当液体中的过氧化氢殆尽时条带数也不再增加；一定体积的样液中草酸浓度越高，参与显色反应的草酸分解产物也越多，反应膜上的显色条带数也就越多；通过肉眼直接读取与草酸浓度成正相关的显色条带数，代入标定结果即可半定量检测草酸浓度。
进一步地，所述样品垫和所述结合垫均采用玻璃纤维膜，所述反应膜采用硝酸纤维素膜，所述吸收垫采用吸水性良好的吸水纸，所述底衬采用胶板。
进一步地，所述结合垫上负载有体积为5～15μL的草酸氧化酶和辣根过氧化物酶的混合酶溶液。
进一步地，所述反应膜上负载有3～8条3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色剂划线，相邻划线平行且不互相粘连，划线浓度为0.5～1.5μL/cm。
进一步地，所述条带显色式试纸条将草酸浓度转化为显色条带的数量进行直接测量，标定结果为显色条带数和其对应的草酸浓度范围。
在本发明另一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)在底衬上依次平行粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，相邻垫之间互相搭接交叠一小部分以保证液体的流通，组装成试纸条大板；
(2)将显色剂均匀划3～8条线在反应膜上，相邻两条划线间距相等且不互相粘连，平行于各垫搭接边界；
(3)将有效划线部分的试纸条大板切成2～4mm宽的试纸条，避光隔夜干燥以备用；
(4)使用试纸条检测前，在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液。
在本发明另一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的使用方法，包括以下步骤：
使用试纸条检测前，先在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液，然后在样品垫上滴加一定量的样液，待侧流完成后读取反应膜上的显色条数，代入标定结果即可获得样液中的草酸浓度范围。
在本发明另一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条在尿液中草酸的“无设备”快速检测以及相关疾病的早期筛查中的应用，所述条带显色式试纸条的检测限低于0.3mM，检测范围覆盖了从正常人到高草酸尿症患者的尿液中草酸浓度范围。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，可以实现对尿液中草酸浓度的半定量检测。与传统的免疫层析试纸条相比，本发明基于酶法和化学显色法实现了对小分子目标物的检测；与基于比色法的草酸检测方法相比，本发明不依赖于图像采集和处理设备，实现了草酸的“无设备”检测，具有操作简便、成本低廉、可现场即时检测的优点；试纸条可大批量制备，广泛适用于家庭监测和床旁检测。因此，本发明提出的条带显色式试纸条为尿液中草酸的即时检验、相关疾病的早期筛查提供了非常可行的技术方案。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
附图说明
通过结合附图考虑以下详细描述，可以容易地理解本发明的教导，其中：
图1是本发明一实施例中提供的条带显色式试纸条的结构示意图；
图2是本发明一实施例中提供的用草酸溶液半定量标定的结果图；
图中：样品垫1、结合垫2、反应膜3、吸收垫4、胶板5、显色剂划线6、液体流动方向7。
为了便于理解，在可能的情况下，使用相同的附图标记来表示附图中相同的元件。
具体实施方式
为了使得本发明的技术方案的目的、技术方案和优点更加清楚，下文中将结合本发明具体实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。附图中相同的附图标记代表相同的部件。需要说明的是，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本一实施例中提出了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，试纸条由样品垫1、结合垫2、反应膜3、吸收垫4四个基本部分和作为底衬5的胶板构成。其中，在一实施例中，样品垫1和结合垫2均采用玻璃纤维膜，反应膜3采用硝酸纤维素膜，尤其是CN140硝酸纤维素膜，吸收垫4采用吸水性良好的吸水纸，胶板为PVC胶板。
样品垫1、结合垫2、反应膜3、吸收垫4按照图1所示的叠加顺序搭接，相邻垫之间重合2mm以保证液体的顺利流通，共同粘贴在胶板5上组装成试纸条。
结合垫2上负载有草酸氧化酶和辣根过氧化物酶。其中，在一实施例中，结合垫上负载有体积为5～15μL的草酸氧化酶和辣根过氧化物酶的混合酶溶液；例如，在一优选的实施例中，草酸氧化酶和辣根过氧化物酶的混合溶液体积为5μL。
反应膜3上负载有多条间隔划线形式的显色剂。其中，在一实施例中，反应膜上负载有3～8条3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色剂划线，相邻划线平行且不互相粘连，划线浓度为0.5～1.5μL/cm；例如，在一优选的实施例中，反应膜3上负载有6条3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色剂划线6，采用相邻划线间距为3mm。
采用试纸条检测时，30μL体积的样液被加至样品垫1上，沿液体流动方向7从样品垫1流至吸收垫4。样液中的草酸流至结合垫2时先在草酸氧化酶的催化作用下被氧化，生成的过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下能与反应膜3上划线处的显色剂(例如，3,3',5,5'-四甲基联苯)发生显色反应，使得划线处的显色液从无色变为有色的条带。在条带显色的同时过氧化氢也被相应消耗，当液体中的过氧化氢殆尽时条带数也不再增加。一定体积的样液中草酸浓度越高，参与显色反应的草酸分解产物也越多，反应膜3上的显色条带数也就越多。通过肉眼直接读取与草酸浓度成正相关的显色条带数，代入标定结果即可半定量检测草酸浓度。
条带显色式试纸条将草酸浓度转化为显色条带的数量进行直接测量，标定结果为显色条带数和其对应的草酸浓度范围。
在一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)在底衬上依次平行粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，相邻垫之间互相搭接交叠一小部分以保证液体的流通，组装成试纸条大板；例如，在一实施例中，采用在60mm×30cm尺寸的PVC胶板上按照叠加顺序依次平行粘贴上15mm×30cm的样品垫、9mm×30cm的结合垫、25mm×30cm的硝酸纤维膜(NC膜)和17mm×30cm的吸收垫，相邻垫之间搭接2mm，组装成60mm×30cm的试纸条大板；
(2)将显色剂均匀划3～8条线在反应膜上，相邻两条划线间距相等且不互相粘连，平行于各垫搭接边界；例如，在一实施例中，将划膜喷金仪的划线浓度设置为0.8μL/cm，用划膜喷金仪将3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液平行于试纸条边界地均匀划六条线在硝酸纤维素膜上，相邻划线间隔均为3mm，第一条划线与结合垫之间的距离也为3mm；例如，在一实施例中，用斩切机将有效划线部分的试纸条大板切成尺寸为60mm×3mm的试纸条，置于装有干燥剂的试纸条密封筒中，在4℃的冰箱中隔夜干燥以备用；
(3)将有效划线部分的试纸条大板切成2～4mm宽的试纸条，避光隔夜干燥以备用；
(4)使用试纸条检测前，在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液。例如，在一实施例中，将活性为1.31U/mg的草酸氧化酶冻干粉用纯水配制成浓度为76.4mg/mL的草酸氧化酶溶液。将活性为340U/mg的辣根过氧化物酶冻干粉用纯水配制成浓度为1mg/mL的辣根过氧化物酶溶液。按体积比为1:2的比例混合两种酶溶液，置于4℃的冰箱中冷藏备用。
在一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的使用方法，包括以下步骤：
使用试纸条检测前，先在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液，然后在样品垫上滴加一定量的样液，待侧流完成后读取反应膜上的显色条数，代入标定结果即可获得样液中的草酸浓度范围。在一实施例中，使用试纸条检测前，将配制好的混合酶溶液置于室温中复温10min，在试纸条的结合垫上滴加5μL混合酶溶液。
在一实施例中，提供了一种使用所述条带显色式试纸条对草酸溶液浓度进行检测的方法并给出用草酸溶液标定的结果，具体步骤如下：
(1)配制一系列不同浓度的草酸溶液，0.3-1mM之间每0.05mM设置一个浓度梯度，1mM以上设置1.5mM、2mM两个浓度，共有17个不同浓度，分别为0.3mM、0.35mM、0.4mM、0.45mM、0.5mM、0.55mM、0.6mM、0.65mM、0.7mM、0.75mM、0.8mM、0.85mM、0.9mM、0.95mM、1mM、1.5mM、2mM；
(2)分别在试纸条的样品垫上加载30μL体积的各浓度的草酸溶液，每个浓度设置3个重复组。20min后观察各试纸条的显色结果，计数每个试纸条上的显色条数。
(3)将每一草酸溶液浓度和该浓度下响应的显色条数作成散点统计图，半定量标定结果如图2所示。从图2中可以得到各草酸溶液浓度与显色条数之间的对应关系，其中浓度高于0.6mM时显色条数均为6条，图中未予全部显示。对于某一未知浓度的草酸溶液，用试纸条检测后读取其显色条数，即可判断其草酸浓度的范围。
在一实施例中，提供了一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条在尿液中草酸的“无设备”快速检测以及相关疾病的早期筛查中的应用，条带显色式试纸条的检测限低于0.3mM，检测范围覆盖了从正常人到高草酸尿症患者的尿液中草酸浓度范围。
在一实施例中，使用本发明的条带显色式试纸条对实际尿液样本中的草酸浓度进行检测，验证所述试纸条的临床应用效果。
先用高效液相色谱法测出实际尿液样本中的草酸浓度为0.16mM，将液相色谱结果作为实际尿液中草酸浓度真实值。然后在尿液样本中加标0.3mM、0.5mM、1mM的草酸浓度，那么加标后的尿液中草酸浓度分别为0.46mM、0.66mM和1.16mM。用试纸条检测加标前后共四组不同草酸浓度的尿液中的草酸浓度范围，重复测量两次，对比试纸条检测结果与标准值是否一致。具体检测结果如表1所示。
表1本发明的试纸条对实际尿液样本中草酸浓度检测结果与真实值的对比。
由表1可知，使用本发明的试纸条对实际尿液样本的检测结果与草酸溶液标定结果均一致：显色条数为0时草酸浓度未达到0.30mM；显色条数为3时，草酸浓度大致在0.45-0.50mM之间；显色条数为6时，草酸浓度大于0.6mM。
本发明实施例提供的一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，可以实现对尿液中草酸浓度的半定量检测。与传统的免疫层析试纸条相比，本发明基于酶法和化学显色法实现了对小分子目标物的检测；与基于比色法的草酸检测方法相比，本发明不依赖于图像采集和处理设备，实现了草酸的“无设备”检测，具有操作简便、成本低廉、可现场即时检测的优点；试纸条可大批量制备，广泛适用于家庭监测和床旁检测。因此，本发明提出的条带显色式试纸条为尿液中草酸的即时检验、相关疾病的早期筛查提供了非常可行的技术方案。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征等同替换所组成的技术方案。本发明的未尽事宜，属于本领域技术人员的公知常识法。
Claims (9)
1.一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于，包括：样品垫、结合垫、反应膜、吸收垫、底衬和负载在结合垫上的草酸氧化酶和辣根过氧化物酶以及以多条间隔划线的形式负载在反应膜上的显色剂。
2.根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于：所述条带显色式试纸条在检测时，一定体积的样液被加至样品垫上，样液中的草酸流至结合垫时先在草酸氧化酶的催化作用下被氧化，生成的过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下能与反应膜上划线处的显色剂发生显色反应，使得划线处的显色剂从无色变为有色的条带；在条带显色的同时过氧化氢也被相应消耗，当液体中的过氧化氢殆尽时条带数也不再增加；一定体积的样液中草酸浓度越高，参与显色反应的草酸分解产物也越多，反应膜上的显色条带数也就越多；通过肉眼直接读取与草酸浓度成正相关的显色条带数，代入标定结果即可半定量检测草酸浓度。
3.根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于：所述样品垫和所述结合垫均采用玻璃纤维膜，所述反应膜采用硝酸纤维素膜，所述吸收垫采用吸水性良好的吸水纸，所述底衬采用胶板。
4.根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于：所述结合垫上负载有体积为5～15μL的草酸氧化酶和辣根过氧化物酶的混合酶溶液。
5.根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于：所述反应膜上负载有3～8条3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色剂划线，相邻划线平行且不互相粘连，划线浓度为0.5～1.5μL/cm。
6.根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条，其特征在于：所述条带显色式试纸条将草酸浓度转化为显色条带的数量进行直接测量，标定结果为显色条带数和其对应的草酸浓度范围。
7.一种如根据权利要求1所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在底衬上依次平行粘贴样品垫、结合垫、反应膜和吸收垫，相邻垫之间互相搭接交叠一小部分以保证液体的流通，组装成试纸条大板；
(2)将显色剂均匀划3～8条线在反应膜上，相邻两条划线间距相等且不互相粘连，平行于各垫搭接边界；
(3)将有效划线部分的试纸条大板切成2～4mm宽的试纸条，避光隔夜干燥以备用；
(4)使用试纸条检测前，在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液。
8.一种如根据权利要求1—6中任一项所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用试纸条检测前，先在试纸条的结合垫上滴加一定量冷藏后复温的草酸氧化酶溶液和辣根过氧化物酶溶液，然后在样品垫上滴加一定量的样液，待侧流完成后读取反应膜上的显色条数，代入标定结果即可获得样液中的草酸浓度范围。
9.一种如根据权利要求1—6中任一项所述的用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条在尿液中草酸的“无设备”快速检测以及相关疾病的早期筛查中的应用，其特征在于：所述条带显色式试纸条的检测限低于0.3mM，检测范围覆盖了从正常人到高草酸尿症患者的尿液中草酸浓度范围。
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| CN202111405324.XA CN114164253B (zh) | 2021-11-24 | 一种用于尿液中草酸检测的条带显色式试纸条及其制备、使用方法与应用 |
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