CN113624754A - 尿液草酸含量检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了尿液草酸含量检测试剂盒及检测方法，试剂盒包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂包括以下组分：柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.01‑1M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.1‑0.5mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.01‑0.5mM；R2试剂包括以下组分：pH值为5.6的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.1M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度大于50U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度大于5000U/L；所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。本发明所述试剂盒具有较高的检测限，能够用于尿液中草酸含量的检测，同时具有较高的检测灵敏度，且具有操作简单、快捷的优点。
Description
技术领域
本发明涉及尿液中草酸含量检测技术领域，具体涉及尿液草酸含量检测试剂盒及检测方法。
背景技术
草酸学名乙二酸(oxalic acid)，分子量90.2，可直接通过饮食进入身体，最终由肝脏进行代谢。
人体草酸有两个来源：①肠道吸收的外源性草酸，从食物获得，约占总草酸10％。②体内蛋白质、碳水化合物分解及某些药物所致的内源性草酸，约占90％。草酸的总排泄量包括内源性和饮食中的草酸在微生物降解后累积。饮食摄入的草酸盐近一半由细菌分解，它们在一定PH范围内具有酶解草酸盐的能力。有一些结石病患者因肠道缺少某种细菌，如囊性纤维化病患者由于长时间抗生素治疗，肠内缺少甲酸草酸杆菌，从而表现高草酸尿，进而引发结石。草酸是形成结石的重要成分，常见含钙结石几乎都含草酸钙。
泌尿系结石是一种全球性的疾病，也是我国最常见的泌尿外科疾病之一，尤其在我国南方，泌尿系结石的发病率很高，是世界上三个主要的泌尿系结石流行区之一。泌尿系结石以草酸钙结石最为多见，草酸代谢异常所致的高草酸尿对结石形成有重要影响。草酸对钙具有较强的螯合作用，因此能够影响人体对钙的吸收与代谢。首先，它可与膳食钙形成稳定的非水溶性螯合物，使钙难以进入人体内环境被人体吸收。其次，人体通过食物摄入和代谢产生的草酸又能与钙在体内形成沉淀，累积在肾小球，这是泌尿系结石的主要成因尿液中草酸的浓度与泌尿系结石密切相关，简便、精准地检测尿草酸含量对泌尿系结石的基础研究和临床治疗具有重要意义。草酸测定方法主要有滴定法、比色法、高压液相色谱法(HPLC)，离子色谱法、毛细管电泳法(CE)、酶法等。
滴定法通过选择一定的滴定剂滴定草酸提取液，以电位的突跃或指示剂的变色来指示滴定终点，再通过滴定溶液的消耗量来计算草酸的含量。滴定法作为一种经典方法至今仍在食品分析中广泛应用，但其灵敏度低，操作较繁琐、耗时；比色法将草酸通过预沉淀提取出来后用酸溶解，之后将草酸氧化或还原，或直接与一定的显色剂反应产生有色物质，通过比色来定量。比色法廉价、灵敏度高，但预沉淀操作难于完全将草酸提取出来，操作繁琐且重复性较差。离子色谱法(IC)借助离子在离子交换柱上，或在浸透过一种离子交换剂的薄膜上迁移率的差异，而进行离子分离的一种离子定性与定量的分析技术；毛细管电泳(CE)分析法高电压、快流速，减少了溶质在毛细管内的停留时间，降低了由于分子扩散而引起的区带扩展，突破性地解决了分析小分子离子的瓶颈，因此适用于微量检测；离子色谱法和毛细管电泳灵敏度高，操作也较简便，但该仪器尚未普及，且只适用于微量检测，不适用于常量检测。高效液相色谱法(HPLC)以邻苯二胺作为衍生剂，在与血和尿中的草酸反应后，可生成具有强紫外吸收的化合物—2,3-二羟基喹喔啉，通过反相C18柱分离，可检测草酸浓度。但高压液相色谱法在分离过程中无机酸的干扰较严重，且仪器昂贵，对操作人员要求较高，普及困难，适于在专业部门使用。
发明内容
本发明的目的在于提供尿液草酸含量检测试剂盒，具有较高的检测限，能够用于尿液中草酸含量的检测，同时具有较高的检测灵敏度，且具有操作简单、快捷的优点。
此外，本发明还提供上述检测试剂盒的检测方法。
本发明通过下述技术方案实现：
尿液草酸含量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.01-1M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.1-0.5mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.01-0.5mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为3.6-6的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.01-0.5M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度大于等于50U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度大于等于5000U/L；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用超纯水复溶。
本发明的R1试剂为无色透明液体，R2试剂冻干后为白色干粉末，复溶后为无色或淡黄色透明液体。
本发明的检测原理如下：
尿液中的草酸盐通过下述的偶联反应产生着色复合物可用自动化仪器测定；
本发明的核心成分为草酸氧化酶和过氧化物酶，但草酸氧化酶和过氧化物酶的最适pH不同，本发明通过合理设计R2试剂的配方，保证两种酶的较高活性，进而达到高灵敏度的特点，同时通过合理设计R1试剂的配方，使得整个试剂盒不仅灵敏度高，且检测限高，能够适用于尿液中草酸的检测。
本申请由于具有较高的检测限，为1.8-180mg/L，在检测尿液中草酸含量时，无需对样本进行稀释就可直接进行测量。
在现有草酸测量中，大部分检测试剂盒的检测限均较低，基本都是在9-45mg/L，只能适用于血液中草酸含量的检测，当将其用于尿液中草酸含量检测时，需要对样本进行稀释，导致降低了检测结果的准确度。
此外，本发明的试剂中不含有荧光染料等试剂，荧光染料在空气中不太稳定，开启后应尽快使用，且在还原剂的存在下很不稳定，试剂的抗干扰能力弱，本发明试剂避免荧光染料对环境的污染。试剂品种简单，仅R1、R2两种试剂。且无需孵育，减少孵育所导致的时间浪费，可直接上机检测，定标方式简单，无需每次检测定标。操作简单快捷，上机后10min后即可出结果，时间快速，更适用于高通量检测以及即时检测，更适用于医学实验室以及医院检验科的大批量操作。
进一步地，R2试剂的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。
进一步地，柠檬酸盐缓冲液由0.01-0.5M的柠檬酸和0.01-0.5M的柠檬酸钠按体积比149:51-19:81混合获得。
进一步地，柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.05-0.3M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.15-0.3mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09-0.3mM。
进一步地，pH值为4-6的缓冲液，所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.05-0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为50-1000U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000-20000U/L。
进一步地，柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.07-0.2M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.18-0.29mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09-0.2mM，所述缓冲液pH值为5-5.8，在R2试剂中的浓度为0.05-0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为50-400U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000-10000U/L。
进一步地，R1试剂的制备过程如下：
DMAB溶解于甲醇中制备DMAB母液，将MBTH溶解于水中制备MBTH母液，柠檬酸溶解于水中制备柠檬酸溶液，然后将DMAB母液、MBTH母液和柠檬酸溶液按比例混合获得R1试剂。
进一步地，R2试剂的制备过程如下：
将草酸氧化酶用水复溶形成溶液并在2-8°下保存，将过氧化物酶用水复溶形成溶液并在2-8°下保存，将缓冲液、草酸氧化酶水溶液和过氧化物酶水溶液按比例混合获得R2试剂。
进一步地，还包括草酸标准品。
基于尿液草酸含量检测试剂盒的检测方法，
将尿液样本、R1试剂和R2试剂放置在仪器的对应位置，启动仪器直接测量。
仪器为BioSystems A400全自动特定蛋白分析仪。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明草酸检测试剂盒使草酸氧化酶和过氧化物酶在合适的PH条件下，均达到较高的活性，提高了检测灵敏度。
2、本发明测得草酸检测试剂盒线性范围为1.8-180mmol/L。
3、本发明的检测体系自动化仪器操作，在保证检测结果准确的同时，操作更加方便，快捷。
附图说明：
图1为实施例1的线性图；
图2为实施例2的线性图；
图3为实施例3的线性图；
图4为对比例1的线性图；
图5为对比例2的线性图；
图6为对比例3的线性图；
图7为对比例4的线性图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
尿液草酸含量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.07M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.18mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.06M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为100U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.06M的柠檬酸和0.06M的柠檬酸钠按体积比41：59混合获得；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
本实施例的检测方法为：
将尿液样本、R1试剂和R2试剂放置在仪器的对应位置，启动仪器直接测量，仪器采用BioSystems A400全自动特定蛋白分析仪。
实施例2：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，各个组分的浓度不同，具体地：
尿液草酸含量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.2M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.29mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.2mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5.8的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为300U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为10000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.2M的柠檬酸和0.2M的柠檬酸钠按体积比47:153混合获得；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
实施例3：
本实施例基于实施例1，与实施例1的区别在于，各个组分的浓度不同，具体地：
尿液草酸含量检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.15M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.2mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.15mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为5的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.13M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为200U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为8000U/L；所述缓冲液为柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液有0.13M的柠檬酸和0.13M的柠檬酸钠按体积比41：59混合获得；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
由附图1-附图3可知：
本发明的测得草酸检测试剂盒线性范围为1.8-180mmol/L。
对比例1：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，R2试剂中缓冲液的pH不同，具体为pH值为3。
对比例2：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，R2试剂中缓冲液的pH不同，具体为pH值为7。
对比例3：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，R2试剂中草酸氧化酶的浓度不同，具体为10U/L。
对比例4：
本对比例基于实施例1，与实施例1的区别在于，R2试剂中草酸氧化酶的浓度不同，具体为10000U/L。
对实施例1-实施例3，对比例1-对比例4进行准确度、线性实验和重复性实验：
1、准确度数据，配置90mg/L的草酸盐溶液，检测其准确性，结果如表1所示：
表1
2、线性数据：
应用尿液标本，进行稀释，验证其试剂线性，实施例1-实施例3，对比例1-对比例4的线性数据分别如图1-图7所示。
3、重复性数据：
浓度(80mg/L)的数据如表2所示：
表2
| 重复性 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 1 | 78.68 | 80.25 | 79.34 | 54.77 | 62.34 | 53.16 | 64.20 |
| 2 | 78.71 | 81.07 | 75.23 | 83.23 | 91.22 | 51.40 | 67.86 |
| 3 | 78.72 | 82.29 | 80.11 | 34.54 | 48.68 | 53.67 | 65.84 |
| 4 | 78.58 | 80.15 | 82.99 | 34.56 | 88.71 | 55.60 | 64.12 |
| 5 | 78.31 | 80.88 | 83.12 | 10.90 | 62.21 | 55.69 | 64.70 |
| 6 | 74.10 | 81.68 | 78.96 | 34.33 | 38.45 | 56.90 | 65.35 |
| 7 | 79.14 | 80.72 | 77.67 | 38.98 | 43.66 | 52.04 | 68.58 |
| 8 | 79.31 | 82.90 | 75.78 | 45.78 | 51.27 | 50.77 | 66.32 |
| 9 | 78.17 | 79.73 | 78.09 | 34.89 | 39.08 | 52.32 | 63.79 |
| 10 | 75.83 | 78.35 | 79.67 | 45.34 | 50.78 | 53.38 | 62.68 |
| 11 | 76.34 | 76.87 | 79.09 | 43.23 | 48.42 | 54.99 | 61.49 |
| 12 | 76.89 | 78.43 | 81.52 | 12.23 | 73.70 | 55.62 | 62.74 |
| 13 | 79.23 | 80.81 | 80.33 | 67.89 | 76.04 | 53.82 | 64.65 |
| 14 | 78.45 | 83.02 | 76.11 | 65.67 | 73.55 | 57.99 | 66.42 |
| 15 | 77.67 | 79.22 | 78.91 | 78.56 | 87.99 | 52.87 | 63.38 |
| AVG | 77.88 | 80.43 | 79.13 | 45.66 | 62.41 | 54.02 | 64.81 |
| SD | 1.48 | 1.73 | 2.36 | 21.28 | 18.37 | 2.07 | 1.95 |
| CV | 1.89％ | 2.15％ | 2.99％ | 46.60％ | 29.44％ | 3.82％ | 3.02％ |
浓度(10mg/L)的数据如表3所示：
表3
| 重复性 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 1 | 9.68 | 9.87 | 9.70 | 6.19 | 0.09 | 5.19 | 7.76 |
| 2 | 9.71 | 9.90 | 8.33 | 1.17 | 8.66 | 4.17 | 6.67 |
| 3 | 8.72 | 8.89 | 8.74 | 2.17 | 0.09 | 4.17 | 6.19 |
| 4 | 9.58 | 9.77 | 9.47 | 0.19 | 1.85 | 4.19 | 7.58 |
| 5 | 8.31 | 8.48 | 9.73 | 1.19 | 5.12 | 4.19 | 7.78 |
| 6 | 9.10 | 9.28 | 9.60 | 2.19 | 0.98 | 5.79 | 8.68 |
| 7 | 9.14 | 9.32 | 9.16 | 1.18 | 1.52 | 4.98 | 7.33 |
| 8 | 9.31 | 9.50 | 9.33 | 1.19 | 4.70 | 5.09 | 6.46 |
| 9 | 8.17 | 8.33 | 9.91 | 5.20 | 7.31 | 6.21 | 7.93 |
| 10 | 9.83 | 10.03 | 9.85 | 9.20 | 6.24 | 4.61 | 8.88 |
| 11 | 9.34 | 9.53 | 9.36 | 0.19 | 3.73 | 5.65 | 7.49 |
| 12 | 9.89 | 10.09 | 9.12 | 2.18 | 4.48 | 4.99 | 7.29 |
| 13 | 9.23 | 9.41 | 9.25 | 5.18 | 0.62 | 4.48 | 6.40 |
| 14 | 9.45 | 9.64 | 8.19 | 8.16 | 1.51 | 6.01 | 6.55 |
| 15 | 8.67 | 8.84 | 8.69 | 3.17 | 1.03 | 5.12 | 6.95 |
| AVG | 9.21 | 9.39 | 9.23 | 3.25 | 3.20 | 4.99 | 7.33 |
| SD | 0.53 | 0.54 | 0.53 | 2.87 | 2.76 | 0.69 | 0.81 |
| CV | 5.79％ | 5.79％ | 5.79％ | 88.15％ | 86.47％ | 13.86％ | 11.04％ |
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；
所述R1试剂包括以下组分：
柠檬酸、DMAB和MBTH，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.01-1M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.1-0.5mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.01-0.5mM；
R2试剂包括以下组分：
pH值为3.6-6的缓冲液、草酸氧化酶和过氧化物酶；所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.01-0.5M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度大于等于50U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度大于等于5000U/L；
所述R2试剂为干粉状态，使用时采用水复溶。
2.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述柠檬酸盐缓冲液由0.01-0.5M的柠檬酸和0.01-0.5M的柠檬酸钠按体积比149:51-19:81混合获得。
4.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.05-0.3M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.15-0.3mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09-0.3mM。
5.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，pH值为4-6的缓冲液，所述缓冲液在R2试剂中的浓度为0.05-0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为50-1000U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000-20000U/L。
6.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述柠檬酸在R1试剂中的浓度为0.07-0.2M，所述DMAB在R1试剂中的浓度为0.18-0.29mM；所述MBTH在R1试剂中的浓度为0.09-0.2mM，所述缓冲液pH值为5-5.8，在R2试剂中的浓度为0.05-0.2M，所述草酸氧化酶在R2试剂中的浓度为50-400U/L，所述过氧化物酶在R2试剂中的浓度为5000-10000U/L。
7.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的制备过程如下：
DMAB溶解于甲醇中制备DMAB母液，将MBTH溶解于水中制备MBTH母液，柠檬酸溶解于水中制备柠檬酸溶液，然后将DMAB母液、MBTH母液和柠檬酸溶液按比例混合获得R1试剂。
8.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的制备过程如下：
将草酸氧化酶用水复溶形成溶液并在2-8°下保存，将过氧化物酶用水复溶形成溶液并在2-8°下保存，将缓冲液、草酸氧化酶水溶液和过氧化物酶水溶液按比例混合获得R2试剂。
9.根据权利要求1所述的尿液草酸含量检测试剂盒，其特征在于，还包括草酸标准品。
10.基于权利要求1-9任一项所述的尿液草酸含量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，
将尿液样本、R1试剂和R2试剂放置在仪器的对应位置，启动仪器直接测量。
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