CN108152225A - 一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种缺血修饰白蛋白的测定方法，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，检测中所使用的显色剂为2,4‑二巯基嘧啶，用以检测反应体系中的游离钴。本发明所用的显色剂2,4‑二巯基嘧啶稳定性更高，分析灵敏度更高，价格较低，检测结果以游离钴浓度报告，避免采用吸光度报告时由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致IMA检测结果吸光度不稳定的问题。本发明还提供一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包括所述方法所用到的试剂。

Description

一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及对人血清中缺血修饰白蛋白进行检测的方法，尤其涉及一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒。

背景技术

缺血修饰白蛋白(ischemia modified albumin，IMA)是近年来发现的一种理想的心肌缺血标志物，在早期诊断急性冠状动脉综合症中具有独特的优势。急性冠状动脉综合症(Acute coronary syndromes ACS)是指冠状动脉粥样硬化斑块脱落，血小板聚集，血栓形成致使冠状动脉狭窄、阻塞，引起心肌缺血以及梗死的病理现象，从临床角度看，涵盖了一组连续进展的病症，包括不稳定心绞痛、非ST段抬高的心肌梗死和ST段抬高的心肌梗死。

人血清白蛋白(HSA)是一种循环蛋白，其氨基末端序列为人类所特有，能与金属钴、铜和镍等离子结合，与其它种属动物白蛋白相比，HSA的金属结合位点更易受生物化学因素的影响而被降解。人血清白蛋白在氧自由基作用下，其氨基末端结构发生改变，导致其与某些外源性金属钴、铜、镍结合能力减弱的白蛋白，称为缺血修饰白蛋白(Ischemiamodified albumin IMA)。

研究人员在寻找冠状动脉综合症(ACS)生化标志物时观察到患者血清白蛋白与外源性Co2+结合能力减弱，同时阐明缺血再灌注引起白蛋白改变的机制主要为内皮细胞损伤及细胞外缺氧，酸中毒，自由基损伤，细胞膜能量依赖的钠钾泵破坏和游离Co2+增多，这些反应在急性心肌缺血后数分钟内发生。当各种原因引起缺血时，局部血液灌注和供氧减少，组织细胞进行无氧代谢，消耗ATP。同时代谢产物(如乳酸)堆积，导致酸中毒，局部微环境pH下降致使Cu2+从循环蛋白的金属结合位点释放，在还原剂如VitC存在时，Cu2+→Cu+，后者可与氧反应生成氧自由基[O-]，在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下，使其转化为过氧化氢和氧。正常情况下过氧化氢无害，由SOD降解生成水和O2，当有金属离子存在时，过氧化氢通过Fenton反应形成[O-]，后者具有高度活性，导致蛋白、核酸损伤和脂质过氧化。HSA易受[O-]损害，使N-末端序列2-4个氨基酸(天冬氨酸-丙氨酸-丝氨酸-赖氨酸)发生转变形成IMA。也有报道是乙酰化或缺失1-2氨基酸。在这一过程中，游离Cu2+具有很高的毒性作用。游离Cu2+释放后，血清白蛋白的N-末端序列与其结合，迅速将其清除，当白蛋白在[O-]作用下被修饰后，结合Cu2+的能力减弱，Cu2+从结合位点释放，再次进入[O-]的形成过程或与正常的白蛋白结合，这就形成了一个链式反应，最终使IMA在缺血数分钟内迅速升高。理想的心肌缺血标志物应具有以下特征：(1)无论是否具有心肌坏死，都能查出心肌缺血，其他器官缺血、炎症或坏死时不增高。(2)缺血早期即可查出，升高程度与缺血程度一致。(3)标志物稳定，有足够的诊断窗口期，12-24小时内应能恢复至正常，以利于查出再次缺血。

研究表明IMA基本具备理想心肌缺血标志物基本特征，在以下几个方面具有重要价值：

(1)对于因胸痛或不适来就诊的急诊患者进行危险分层，对低危患者有助排除ACS诊断。

(2)作为对疑似ACS患者最早升高的短期缺血危险分层标志物，有助于临床医师早期恰当处理病人。传统的心肌损伤标志物常在心肌细胞发生坏死后血中浓度方可升高，IMA在心肌可逆的心肌缺血阶段血中浓度即迅速升高，可早期并灵敏地反应心肌缺血状况，将心肌缺血的诊断窗由原来的缺血发生后4-6小时提前到5-10分钟。

在心肌缺血5-10min内IMA即可升高，可持续6h，其诊断心肌缺血的敏感性优于目前所有的标志物和其他检查。IMA的测定通常是采用白蛋白-钴结合(albumin cobaltbinding，ACB)试验，鉴于白蛋白(Alb)N末端氨基酸序列能与钴离子(Co2+)结合，而经修饰的Alb即IMA不与Co2+结合，再加入显色剂二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，间接测定游离Co2+浓度，故血清中游离Co2+的浓度越高，样本中的IMA含量就越高。

但是，DTT做显色剂存在下列问题：

显色剂DTT的熔点低(42～43℃)，在37℃、0.67Pa时升华，易被空气氧化，气味难闻，可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。

显色剂DTT稳定性差，DTT在结构上存在四种同分异构体，有左旋、消旋结构，有1、4位-SH与2、3位-SH等结构，不同厂家、不同批号的DTT因生产流程的不同，结构、性质有所不同。即使能购到的同一结构、不同厂家的DTT试剂本身也存在一定差别。因市场上DTT品种多，试剂本身有一定差别，导致检测结果常随生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定。而且，DTT溶液冷藏或冷冻保存稳定时间相对较短。

显色剂DTT分析灵敏度：采用DTT做游离钴显色剂，制作标准曲线的斜率不高(与DTE比较)，因而表明采用DTT做游离钴显色剂分辨率明显不高。

(4)试剂价格：由于DTT空间结构的特点，与不同浓度游离钴反应时，最适显色浓度较高，按目前市场价格计算，虽然DTT每克价格不高，但由于DTT法测定所用浓度较高，故配成采用DTT检测IMA的测试溶液后价格略高(与DTE比较)。

因此，寻求一种稳定的显色剂替代DTT进行IMA的检测就非常必要。目前的现有技术中，1-亚硝基-2-萘酚微溶于水，溶解度不够，检测时线性范围较窄。需要对血样进行稀释后才能检测出。二硫赤藓糖醇DTE虽然可以解决稳定性问题，但是溶解度较低,大约20℃时15.4g/l,且易结晶。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，以使得测定方法更安全更灵敏。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，所述的测定方法使用测定管，标准管，测定对照管和标准对照管进行吸光度的测定，包括如下步骤：

步骤1、在测定管和测定对照管分别加入血清和检测试剂R1，在标准管和标准对照管分别加入标准溶液和检测试剂R1，混匀后放37℃水浴箱5分钟，其中，所述检测试剂R1为缓冲液1和氯化钴的混合溶液，所述标准溶液为白蛋白浓度已知的混合血清溶液；

步骤2、测定管和标准管分别加入检测试剂R2，测定对照管和标准对照管分别加入与所述检测试剂R2相同体积的缓冲液2，混匀放37℃温育5分钟，其中，所述检测试剂R2为缓冲液2和2,4-二巯基嘧啶的混合溶液；

步骤3、用分光光度计，比色杯，在505nm处以蒸馏水调零，分别读取4管的吸光度；

步骤4、使用标准管的吸光度差值和标准管的钴离子浓度制作标准曲线，将测定管中的钴离子浓度换算出来，该钴离子浓度和样本中缺血修饰白蛋白IMA浓度成正比。

进一步地，所述的测定管和测定对照管先加入的血清为30μl，所述检测试剂1为200μl；所述的标准管和标准对照管先加入的标准液为30μl，所述检测试剂1为200μl；测定管和标准管后加入的检测试剂2为100ul，测定对照管和标准对照管后加入的缓冲液为pH7.8的Tris-HCl缓冲液100ul。

进一步地，根据所测得的4管的吸光度值，用下述计算公式确定游离钴浓度：

C测定＝A(测定管-测定对照管)/A(标准管-标准对照管)*C标准

其中：C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为所测得测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为所测得标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值，游离钴浓度以μmol/L为单位表达。

进一步地，其中所述检测试剂1为45mg/L、pH7.8的Tris缓冲液和45mg/L氯化钴，所述检测试剂2为50mmol/L的Good’s缓冲液和1.5mmol/L的2,4-二巯基嘧啶。

更进一步地，所述血清的制备方式为：取静脉血3ml，1500g/分离心5分钟，血清分离后在室温2小时内，或在2℃～8℃条件下储存48小时内，或在-40℃条件下储存一个月内测定。

本发明还提供一种使用如上方法的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包括试剂盒试剂盒壳体和位于所述试剂盒壳体内的检测试剂，所述检测试剂包括检测试剂R1、检测试剂R2、标准液以及缓冲液2，其中所述检测试剂R1为缓冲液1和45mg/L氯化钴的混合液，所述检测试剂R2为缓冲液2和2,4-二巯基嘧啶混合液，所述标准液为白蛋白浓度已知的混合血清溶液。

进一步地，所述检测试剂R1为20mmol/L、pH7.8的Tris缓冲液和45mg/L氯化钴，所述检测试剂R2为50mmol/L的Good’s缓冲液和1.5mmol/L的2,4-二巯基嘧啶，缓冲液2为50mmol/L的Good’s缓冲液，所述标准液为游离钴的浓度已知的氯化钴溶液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，所用的显色剂2,4-二巯基嘧啶为淡黄色片状晶体，熔点在230-248℃之间，不易升华，不易被空气氧化，安全性更高。

2、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，所用的显色剂2,4-二巯基嘧啶稳定性更高：与二硫苏糖醇(DTT)相比，结构单一，不存在同分异构体，性质较稳定，测定结果变化小；可避免DTT做显色剂存在的试剂本身有一定差别，导致检测结果常随生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定问题；显色剂2.2,4-二巯基嘧啶与DTT溶液稳定性也不尽相同，2,4-二巯基嘧啶溶液冷藏或冷冻保存稳定时间长于DTT溶液。

3、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，所用的显色剂2,4-二巯基嘧啶分析灵敏度更高：在两法各自最适反应条件下检测正常人与心肌缺血者，采用2,4-二巯基嘧啶做游离钴显色剂分辨率明显高于DTT。

4、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，所用的显色剂2,4-二巯基嘧啶价格较低：2,4-二巯基嘧啶法测定所用浓度低于DTT法，故配成测试溶液后采用2,4-二巯基嘧啶检测IMA价格略低。

5、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，其特征在于，检测中所使用的显色剂为2,4-二巯基嘧啶，用以检测反应体系中的游离钴检测结果以游离钴浓度报告，避免采用吸光度报告时由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致IMA检测结果吸光度不稳定的问题。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种缺血修饰白蛋白的测定方法的显色最佳时间及稳定性曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一、实施例一

本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，检测中所使用的显色剂为2,4-二巯基嘧啶，用以检测反应体系中的游离钴。具体操作步骤如下：

1、待检测样品血清的制备：取静脉血3ml，1500g/分离心5分钟，血清分离后在室温2小时内，或在2℃～8℃条件下储存48小时内，或在-40℃条件下储存一个月内测定。

2、准备测定方法所用的试剂：

表一

(1)20mmol/L Tris溶液的配制方法是：

配制1mol/L的Tris母液：首先称取12.114gTrisbase,然后用50ml蒸馏水溶解，用1M的Hcl调节pH至7.8,然后补足至100ml,这是配制成1mol/L的Tris母液。20mmol/L Tris溶液即用所述1mol/L的Tris母液再稀释50倍。

(2)Good’s缓冲液即两性离子缓冲剂，这类缓冲剂一般为氨基磺酸类有机化合物，配成溶液后，pH值比较稳定，与多种酶和化学试剂不发生反应，主要应用于生物学和医学。并且Good’s缓冲剂都有以下共性：在水中的溶解度较高；酸碱解离常数(pKa值)稳定，一般在6-8，释放质子的能力稳定，且受离子浓度、溶液组成和温度的影响较小；具有低细胞膜通透性，不易穿透生物膜；能够与低摩尔质量的金属离子进行螯合，但不与金属离子生成沉淀；化学稳定性较高；紫外和可见光波长范围内光吸收小；与生物体内的有机高分子发生盐析现象的可能性较小；高纯度的盐易于获得；不参与生物化学反应过程，不干扰生物化学反应过程。使用Good’s缓冲剂有多种配方，本实施例使用PH值为6.4的2-吗啉乙磺酸(MES)，2-吗啉乙磺酸分子量为195.2，先配制浓度为0.1mol/L的2-吗啉乙磺酸溶液，配置过程中，缓冲剂需要高温脱水，并于干燥器中冷却；同时配制浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液。2-吗啉乙磺酸溶液加156.3L和氢氧化钠溶液93.7L混合。

(3)检测试剂R1配制方法：

以配制1L检测试剂R1为例，取体积1L的20mmol/L Tris加入45mg氯化钴混匀。

(4)检测试剂R2配制方法：50mmol/L、pH7.4的Good’s缓冲液以及1.5mmol/L的2,4-二巯基嘧啶。

(5)钴标准溶液配制方法以2.48mmol/L氯化钴溶液配制为例：

称590.1mg氯化钴，加水800ml溶解，倒入1000ml容量瓶中，补足至刻度线即可。利用2.48mmol/L氯化钴溶液的配制系列钴标准液的稀释方法是：

0μmol/L：(用生理盐水NS替代)

620μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液250ul+蒸馏水750ul；

1240μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液500ul+蒸馏水500ul；

1860μmol/L：2480μmol/L的氯化钴溶液500ul+1240μmol/L的氯化钴溶液500ul。

(5)标准液为测量的质控品，标准液的制备和有效期：

(1)采用低、高IMA浓度混合血清，分装后冷冻于-40℃冰箱，至少稳定一个月。

(2)采用牛血清白蛋白分别配成20g/L、60g/L浓度，冷藏保存，可稳定数日。

3、操作步骤：

操作流程如下：在30μl待测样本中添加试剂R1，加入量为200μL，测定一次试剂的吸光度作为空白吸光度，混合5分钟后，加入显色剂R2，R2的加入量为100μL，混合后，反应5分钟，反应结束后，使用主波长和副波长两个波长进行反应液的吸光度检测，检测结果减去空白吸光度，得到吸光度变化值。检测方法采用终点法，即采用添加试剂后在终点检测，不需要进行连续监测，检测过程反应温度为37℃，检测时采用的生化仪波长为505nm，采用对照的副波长为700nm。该变化值和样本中的缺血修饰白蛋白浓度成正比例。

混匀，37℃恒温5分钟，空白管调零，505nm测定各管吸光度A1

表2

4、计算：

根据两点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用线性校准法确定工作曲线，所测样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为所测浓度。

二、对比实施例一

DTT作为显色剂

测定方法所采用的试剂包括：R1：检测试剂1

检测计算方法同实施例一三、对比实施例二

DTE作为显色剂

测定方法所采用的试剂包括：R1：检测试剂1

检测计算方法同实施例一四、对比实施例三

NN作为显色剂

测定方法所采用的试剂包括：

R1：检测试剂1

检测计算方法同实施例一

1、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，反应体系的稳定性好。

样本加R1、R2后分别于即刻、5、10、12、15、20、25、30min时测定其吸光度值，作稳定性曲线。可以看到反应体系随时间变化反应稳定，加入显色剂后0～30min时吸光度值变化稳定。本研究选取Alb-Co2+结合时间为5min，显色时间为5min，见图1。

2、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，试剂稳定性好。

稳定性测定为先在最短时间内连续测定混合样本20次，计算出均值()和标准差(s)，再将试剂分别放置于室温和4℃，然后每天连续测定同一混合血清样本，再计算其差异，根据质控规则判断是否失效。先在最短时间内连续测定混合样本20次，结果为(0.650±0.016)ABSU。30d内，试剂在室温和4℃都没有超出范围，性能稳定。

3、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法及检测试剂盒，所用的显色剂2,4-二巯基嘧啶分析灵敏度更高。

四种诊断试剂盒的Co2+敏感性对比试验

表3

Co2+敏感性对比试验操作流程为：购买钴标准物质GBW08613，配制成所需溶液，先用2.0g/L CoC12：溶液作15次倍比稀释，分成2组，每组15支试管，每组按稀释顺序加3mLCoC12：溶液作为R1，再分别加入0.2mL混合血清样本水浴5min，然后第1组加入1.5g/L DTT溶液1.0mL，测定波长为570nm；第2组加入0.1g/L NN溶液1.0mL，第3组加入1.5g/L DTT溶液1.0mL，测定波长为570nm；第4组加入0.1g/L NN溶液1.0mL水浴5min后测定其吸光度值，测定波长为405nm。通过试验观察，用2,4-二巯基嘧啶作显色剂明显比DTT敏感，2,4-二巯基嘧啶作显色剂能检测到0.06mg/L CoC12；而以DTT作显色剂，在CoC12为7.813mg/L时才会有明显的吸光度变化；以DTE作显色剂，在CoC12为3.112mg/L时才会有明显的吸光度变化；以NN作显色剂，在CoC12为0.855mg/L时才会有明显的吸光度变化，四者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

4、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，重复性好。

重复性试验如下：

实施例	标准差(S)	变异系数(CV)
			实施例1	1.67％	3.44％
对比实施例1	2.65％	5.74％
			对比实施例2	3.97％	7.48％
对比实施例3	4.61％	6.45％

表四

分别选取1个混合血清样本连续测定20次和连续测定20d，分别计算出、S和变异系数(CV)。三种改良ACB试验和一种未改良的ACB实验分别为：实施例一批内CV为1.67％，批间CV为3.44％，对比实施例一批内CV为2.65％，批间CV为5.74％，，对比实施例二批内CV为3.97％，批间CV为7.48％，。对比实施例三批内CV为4.61％，批间CV为6.45％，

5、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，抗干扰性好。

干扰试验

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)评价方案，采用“配对差异”的试验方法。一份加干扰物[三酰甘油(TG)、总胆红素(TBil)、Hb]，另一份不加，以对照该组浓度判断有无干扰。混合血清IMA测定值为(0.892±0.043)ABSU、TG为0.59mmol/L、Hb为1.2g/L、TBil为12.6mol/L。加入干扰物，TG<2.02mmol/L、Hb<6.9g/L、TBil<66.0mol/L时四种试剂均无干扰。

6、本发明提供一种缺血修饰白蛋白的测定方法，线性良好。

线性评价

设5个不同浓度的样本。选择高值和低值样本各1个，高值样本为1号，低值样本为5号，二者3：1混匀为2号，等份混匀为3号，1：3混匀为4号，再拟合曲线。对检测的数据处理方法是将将测定的吸光度值，按测量函数转化为游离钴浓度值。

测量结果计算方程：X＝A1Y+b或C测定＝A(测定-测定对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准

计算的结果以游离钴含量表达，游离钴含量的单位为μmol/L。

检测的数据可靠性分析根据分析校准函数(测量函数的反函数)

本发明试剂盒的线性评价设的5个不同浓度的样本通过计算和测定吸光度，并进行曲线估计得到方程Y＝1.81-2.34X，线性良好。

7、本发明的试剂盒的IMA的测定

分别测定胸痛组和急性心肌梗塞(AMI)组的IMA值，并进行统计学分析。急性心肌梗塞(AMI)组IMA测定值为(1.215±0.420)ABSU，胸痛组IMA测定值为(0.735±0.028)ABSU，二者差异有统计学意义(P<0.01)。

8、本发明的测定方法所采用的仪器包括：

(1)紫外可见分光光度计(如日立UV-2800)，其安装条件：温度：5-35℃，湿度：45-85％；数据测定范围：ABS：-2.000-3.000；测定模式：ABS；％T；Conc；技术指标：波长：190-1100nm，波长准确度：±0.3nm，波长重现性：≤0.3nm，吸光度准确性：±0.002-0.004，吸光度重现性：±0.001-0.002，噪声：≤0.0003Abs，基线稳定性：≤0.0003Abs/h，光谱带宽：≤1.5nm，杂散光：≤0.05％T，双光束。

(2)pH计(如美国Orion公司的Orion250A型，分辨率：0.001)，其安装条件：温度：5-45℃湿度：5-85％；基本性能特征：pH范围：-2.0～19.99，Resolution：0.01/0.1，accuracy：±0.02，Slope：80％-120％，Temperature range：-5～105℃。

(3)分析天平(如北京分析仪器厂，精度：1/万)

(4)容量瓶

本发明的测定方法的标本要求为：空腹静脉取血3ml，室温2小时内离心分离血清，血清分离后储存于室温，2小时内测定结束。暂不能测定时，可在2℃～8℃储存48小时，或置-40℃一个月内测定。

在测量系统的操作中，应当对设备与辅助设备测量功能的有效性验证，分光光度计每年由计量部门定时检定。在每次使用前利用蒸馏水调零点，验证仪器性能。蒸馏水为空白，测定标准对照，标准，质控对照，质控，标本对照，标本，记录吸光度。

pH计校准：在室温25±1℃，使用pH7.00和pH10.01的标准缓冲液校准。

水浴箱的温度应恒定在37±0.1℃。

校准品范围：2480μmol/l钴标准液按本发明的方法测试吸光度应在0.95±0.1范围内。

样本检测范围：游离钴浓度在770-1925μmol/l之间。

试剂对照范围：吸光度在0.008±0.004之间。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种缺血修饰白蛋白的测定方法，其特征在于，所述的测定方法使用测定管，标准管，测定对照管和标准对照管进行吸光度的测定，包括如下步骤：

步骤1、在测定管和测定对照管分别先后加入血清和检测试剂R1，在标准管和标准对照管分别先后加入标准溶液和检测试剂R1，混匀后放37℃水浴箱5分钟，其中，所述检测试剂R1为氯化钴和缓冲液1的混合溶液，所述标准溶液为白蛋白浓度已知的混合血清溶液；

步骤2、测定管和标准管分别加入检测试剂R2，测定对照管和标准对照管分别加入与所述检测试剂R2相同体积的缓冲液2，混匀放37℃温育5分钟，其中，所述检测试剂R2为2,4-二巯基嘧啶和缓冲液2的混合溶液；

步骤3、用分光光度计，比色杯，在505nm处以蒸馏水调零，分别读取4管的吸光度；

步骤4、使用标准管的吸光度差值和标准管的钴离子浓度制作标准曲线，将测定管中的钴离子浓度换算出来，该钴离子浓度和样本中缺血修饰白蛋白IMA浓度成正比。

2.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白的测定方法，其特征在于，所述的测定管和测定对照管先加入的血清为30μl，所述检测试剂R1为200μl；所述的标准管和标准对照管先加入的标准溶液为30μl，所述检测试剂R1为200μl；测定管和标准管后加入的检测试剂R2为100ul，测定对照管和标准对照管后加入的缓冲液2为pH7.8的Tris-HCl缓冲液100ul。

3.根据权利要求1或2任一所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于，根据所测得的4管的吸光度值，用下述计算公式确定游离钴浓度：

C测定＝A(测定管-测定对照管)/A(标准管-标准对照管)*C标准，

其中：C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为所测得测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为所测得标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值，游离钴浓度以μmol/L为单位表达。

4.如权利要求1所述的缺血修饰白蛋白的测定方法，其特征在于，其中所述检测试剂R1为20mmol/L、pH7.8的Tris缓冲液和45mg/L氯化钴，所述检测试剂R2为50mmol/L的Good’s缓冲液和1.5mmol/L的2,4-二巯基嘧啶。

5.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白测定方法，其特征在于，所述血清的制备方式为：取静脉血3ml，1500g/分离心5分钟，血清分离后在室温2小时内，或在2℃～8℃条件下储存48小时内，或在-40℃条件下储存一个月内测定。

6.一种使用权利要求1-5任意所述方法的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括试剂盒试剂盒壳体和位于所述试剂盒壳体内的检测试剂，所述检测试剂包括检测试剂R1、检测试剂R2、标准溶液以及缓冲液2，其中所述检测试剂R1为缓冲液1和45mg/L氯化钴的混合液，所述检测试剂R2为缓冲液2和2,4-二巯基嘧啶混合液，所述标准溶液为白蛋白浓度已知的混合血清溶液。

7.根据权利要求6所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂R1为20mmol/L、pH7.8的Tris缓冲液和45mg/L氯化钴，所述检测试剂R2为50mmol/L的Good’s缓冲液和1.5mmol/L的2,4-二巯基嘧啶，缓冲液2为50mmol/L的Good’s缓冲液。