CN1904617A - 血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法 - Google Patents

血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法 Download PDF

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本发明提出一种血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，获得吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度；根据检测结果，制作游离钴浓度指标与吸光度的关系曲线，确认钴浓度与吸光度之间的线性关系为C测定＝A(测定－测定对照管)/A(标准－标准对照管)*C标准。根据钴浓度与吸光度之间的这种线性关系，以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定。

Description

血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法
技术领域
本发明涉及对人血清中缺血修饰白蛋白进行检测的方法。该方法利用急性冠状动脉综合症(ACS)患者血清中缺血修饰白蛋白与外源性Co2+结合能力减弱的特性，在血清中加入一定浓度钴溶液，使其与血清中白蛋白充分结合，再加入试剂检测反应体系中的游离钴，通过吸光度变化表示游离钴含量变化，进而间接表示缺血修饰白蛋白的浓度。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是一种循环蛋白，其氨基末端序列为人类所特有，能与金属钴、铜和镍等离子结合，与其它种属动物白蛋白相比，HSA的金属结合位点更易受生物化学因素的影响而被降解。人血清白蛋白在氧自由基作用下，其氨基末端结构发生改变，导致其与某些外源性金属钴、铜、镍结合能力减弱的白蛋白，称为缺血修饰白蛋白(Ischemia modified albumin IMA)。
研究表明IMA基本具备理想心肌缺血标志物基本特征，在以下几个方面具有重要价值：
(1)对于因胸痛或不适来就诊的急诊患者进行危险分层，对低危患者有助排除ACS诊断。
(2)作为对疑似ACS患者最早升高的短期缺血危险分层标志物，有助于临床医师早期恰当处理病人。传统的心肌损伤标志物常在心肌细胞发生坏死后血中浓度方可升高，IMA在心肌可逆的心肌缺血阶段血中浓度即迅速升高，可早期并灵敏地反应心肌缺血状况，将心肌缺血的诊断窗由原来的缺血发生后4-6小时提前到5-10分钟。
目前，IMA测定一般利用正常人血清中白蛋白能与Co2+结合而缺血修饰白蛋白与Co2+结合能力减弱的特性，采用白蛋白-钴结合试验(ACB)进行。正常人白蛋白以活性形式存在，加入钴试剂后，Co2+与人血清白蛋白N-末端结合，溶液中游离Co2+浓度下降，心肌缺血病人血清标本中含有大量的IMA，加入同等量的钴试剂后，由于IMA与Co2+的结合能力下降，溶液中存在较多量的游离Co2+，加入二硫苏糖醇(DTT)试剂后，游离钴可与二硫苏糖醇反应，产生棕红色化合物。游离钴含量越高，颜色欲深，用分光光度计测定吸光度值大小，从而间接表示血清中IMA含量。
由于DTT做显色剂存在检测结果常随生产厂家、试剂种类、批号等引起结果不稳定，分辨率明显不高和测试溶液后价格略高的问题，本发明人提出了使用二硫赤藓糖醇(DTE)作为检测反应体系中游离钴的显色试剂的优选方法。
在上述缺血修饰白蛋白测定方法中，有二种结果表达方式：一种是吸光度单位；一种是单位定义，即在某一特定条件下吸光度上升或下降某一吸光度为1U/L，此二种结果表达方式均为相对单位，无法实现溯源，这对定量检测试验而言，属通常不采用的方式，应在无法溯源与无确定标准的情况下迫不得已才采取的一种方式。
发明内容
本发明的目的在于通过检测反应体系中剩余钴含量的方式，以游离钴含量表示血清与钴结合程度，表述缺血修饰白蛋白与钴结合力的下降，从根本上解决了缺血修饰白蛋白定量问题，并将检测结果以游离钴浓度报告。
本发明的血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，获得吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，并将所述的对游离钴检测的结果以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定。
本发明的缺血修饰白蛋白测定方法，根据检测结果数据，制作游离钴浓度指标与吸光度的关系曲线，确认钴浓度与吸光度之间的线性关系为：
C测定＝A(测定-测定对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准
其中，C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清反应体系中含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值。
本发明的血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，可以根据钴溶液的专用国家标准，实现数据的溯源。
在检测测定方法的精密度时，检测高低二个浓度样本，确定仪器内CV＜5％，批内CV＜5％，符合测试要求。
本发明的的缺血修饰白蛋白测定方法，避免采用吸光度报告时由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果不稳定的问题，本检测方法所使用的钴标准溶液可以溯源至国家标准。
具体实施方式
本发明以二硫赤藓糖醇(DTE)作为检测反应体系中的游离钴的显色试剂为例叙述具体的实施方式。所用的测试管采用血清180μl，加入2.48mmol/L氯化钴溶液120μl，加pH7.8的Tris-HCl缓冲液1600ul，混匀放37℃水浴箱8分钟，加入5mmol/L的DTE 200ul，混匀放37℃温育2分钟，在UV-2800紫外可见分光光度计下，在波长480nm处比色，测定游离钴浓度。具体的测试方案见表1：
表1
  测定管   标准管   测定对照管   标准对照管
 血清(μl)   180   --   180   --
 标准液(μl)   --   180   --   180
 钴试剂(μl)   120   120   120   120
 缓冲液(μl)   1600   1600   1600   1600
 混匀，放37℃水浴箱8分钟
 DTE(μl)   200   200   --   --
 缓冲液(μl)   --   --   200   200
 混匀，放37℃水浴箱2分钟
用分光光度计，10mm比色杯，在480nm处以蒸馏水调零，分别读取上述4个测试管的吸光度。
吸光度和血清反应体系中含游离钴的浓度之间所存在的对应关系，通过DTE法标准曲线的制作得出。
该曲线的制作方法是将CoCl2分别配置成620μmol/l，1240μmol/l，1860μmol/l，2480μmol/l四种不同浓度，用上述方法检测其浓度与吸光度的线性关系。
1.系列标准液按照下表配制：
①2480μmol/l CoCl2配置：称29.5mgCoCl2，用去离子水30ml将其溶解于烧杯中，待溶解后，移入50ml容量瓶中补足。
②1240μmol/l CoCl2配置：取10.0ml①液加入10.0ml去离子水混匀即可。
③1860μmol/l CoCl2配置：取5ml②液，加入5ml①液，混匀即可。
④620μmol/l CoCl2配置：取5ml②液，加入5ml去离子水混匀即可。
⑤0μmol/l CoCl2配置：用生理盐水替代。
2.标准曲线测定：
  测定   空白
  1   2   3   4   5   1   2   3   4   5
  Tris-Buffer(ul) 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600
  0μmol/l Cocl2(NS) 120ul - - - - 120ul - - - -
  620μmol/l Cocl2 - 120ul - - - - 120ul - - -
  1240μmol/lCocl2 - - 120ul - - - - 120ul - -
  1860μmol/lCocl2 - - - 120ul - - - - 120ul -
  2480μmol/lCocl2 - - - - 120ul   -120ul   -   -   -
  生理盐水   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul   160ul
  混匀，放37℃ 8分钟
  DTE(μl)   200   200   200   200   200   - -     -     -   -
  Tris   -   -   -   -   -   200   200   200   200   200
混匀放37℃  2min
取出，在Uv-2800分光光度计上480nm处比色，以空白管为空白，由低浓度到高浓度比色，记录各反应管吸光度。
3.测量结果如下表
  1   2   3   4   5
  A   0.021   0.253   0.474   0.680   0.869
  CoCl2   0   620   1240   1860   2480
A0＝-100.61
A1＝2917.3
R＝0.9992
4.结论
本法检测Co2+的线性可达2480μmol/l。
根据以上测量结果，确定吸光度与CoCl2浓度存在线性关系，其计算方程为：
C测定＝A(测定-测定对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准
其中，C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清反应体系中含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值。
利用测定的反应体系中游离钴含量，间接表示IMA浓度。以标本反应体系中含游离钴浓度(umol/l血清)报告结果。
计算的结果以游离钴含量表达，游离钴含量的单位为μmol/L。
检测的数据的可靠性分析根据分析校准函数(测量函数的反函数)
Y＝X/A1-b/A1，分析灵敏度R应在2700～3000之间；不确定度CV＜5％，线性：0-2480mmol/L。
测量正确度：该方法所用钴标准溶液已溯源至国家标准物质。(标准号GBW08613，200604)。
测量精密度：按EP5-A2文件要求，对本法进行精密度测试：高低二个浓度连续测定5日，每日测定8批，每批测定2个数据，共80个数据。统计结果：仪器内CV均＜5％。表明本试验精密度良好。
测量的检测限：受分析灵敏度、正确度、精密度和空白值的影响。本法检测限为：0-2480μmol/L。
测量的测定低限与高限：已测最低结果为770μmol/L，已测最高结果为1925μmol/L。
由于本法检测的核心物质是游离钴，国家计量院有钴国家标准物质(GBW08613)，故可以将该检测体系进行溯源。
根据下述实验，检测标准溶液的溯源性
采用的材料：钴标准物质(GBW08613 200604)，检测试剂盒。
采用的方法：
1.钴标准物质按1∶8，1∶10，1∶20比例稀释，配成2121，1697，848umol/l三种不同浓度钴溶液，分别按本法溯源。
2.按下述测定步骤：
生理盐水180μl，加入钴标准物质120μl，加PH7.8 Tris-HCl缓冲液1600ul，混匀放37℃水浴箱8分钟，加入5mmol/L DTE200ul，混匀放37℃温育2分钟，在UV-2800紫外可见分光光度计下480nm处比色，以蒸馏水为空白，测定游离钴浓度。
钴标准物质溯源步骤：
  溯源管   标准管   溯源对照管   标准对照管
  生理盐水(μl)   180   --   180   --
  标准液(μl)   --   180   --   180
  钴试剂(μl)   120   120   120   120
  Buffer(μl)   1600   1600   1600   1600
  混匀，放37℃   水浴箱   8分钟
  DTE(μl)   200   200   --   --
  Buffer(μl)   --   --   200   200
  混匀  放37℃  水浴箱  2分钟
用UV-2800分光光度计，10mm比色杯，在480nm处以蒸馏水调零，分别读取4管吸光度，根据下式计算反应体系中游离钴含量：C测定＝A(溯源-溯源对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准，得出游离钴浓度(umol/l)，报告结果。
3.若在生化分析仪上进行溯源，参数如下：
37℃           波长：480nm
样本：18μL    试剂2：43μL
试剂1：172μL
两点法，吸光度上升反应。
实验结果：
  标准物质(1∶8)   标准物质(1∶10)   标准物质(1∶20)
  理论值umol/l   2121   1697   847
  实测值umol/l   2112；2128   1687；1721   855；832
  偏差(％)   ＜1   ＜1   ＜1
结论：
该方法溯源结果满足溯源要求。按本法测定钴国家标准物质，钴国家标准物质(GBW08613 200604)测定值为999.3ug/ML(三种浓度测定均值)，与标示值(1000ug/ML)相差0.7ug/ML，＜1％，符合溯源要求。表明本法已经实现溯源。
用本法检测高低二个浓度样本，按EP5-2A文件要求，测定所建IMA测试方法的精密度度：
所用仪器为日立UV-2800紫外可见分光光度计，501-A超级恒温水浴箱，亚光温湿度计，倒计时器，芬兰雷伯移液器(10-200ul)，金花移液器(10-1000ul)；
试剂与方法IMA的游离钴浓度测定法相同；
样本：1号、2号高低二个浓度样本
结果对比：
根据获得的精密度实验原始数据按传统方法统计：
样本1： x＝1684.5
       SD＝54.99
       CV＝3.26％
样本2： x＝1149.2
       SD＝43.21
       CV＝3.76％
根据结果对比，可以得出结论：高、低二个浓度样本，按本法测定仪器内CV＜5％，批内CV＜5％，符合方法学测试要求。

Claims (4)

1.一种血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，其利用缺血修饰白蛋白钴结合能力减弱的特性，使用化学试剂检测反应体系中的游离钴，获得吸光度变化表示游离钴含量变化，间接表示缺血修饰白蛋白的浓度，其特征在于：对游离钴检测的结果是以游离钴浓度指标替代吸光度，避免由于仪器或试剂性能差别和不稳定导致缺血修饰白蛋白检测结果的不稳定。
2.根据权利要求1的血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，其特征在于：根据检测结果数据，制作游离钴浓度指标与吸光度的关系曲线，确认钴浓度与吸光度之间的线性关系为：
C测定＝A(测定-测定对照管)/A(标准-标准对照管)*C标准
其中，C标准为标准液含游离钴的浓度，C测定为所测血清反应体系中含游离钴的浓度，A(测定-测定对照管)为测定管吸光度与测定对照管吸光度的差值，A(标准-标准对照管)为标准管吸光度与标准对照管吸光度的差值。
3.根据权利要求1或2的血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，其特征在于：该方法所用钴溶液已溯源至国家标准物质，实现数据的溯源。
4.根据权利要求1或2的血清缺血修饰白蛋白的游离钴定量测定方法，其特征在于：在检测测定方法的精密度时，检测高低二个浓度样本，确定仪器内CV＜5％，批内CV＜5％，符合测试要求。
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