CN1786185A - 血管紧张素转换酶活性测定方法及血管紧张素转换酶诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血管紧张素转换酶活性的测定方法及其诊断试剂盒。发明应用人工合成底物FAPGG直接与血管紧张素转换酶作用，生成在340nm没有吸收峰的呋喃基－丙烯酰－苯丙氨酸，通过检测340nm吸光度的下降速度定量反映出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好，制成的试剂稳定性好，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及酶法测定血管紧张素转换酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的血管紧张素转换酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
血管紧张素转换酶(简称ACE)的主要生理功能是将血管紧张素I转化为血管紧张素II。血清中ACE活性的测定方法有：生物法、比色法、放射性同位素法、荧光光度法、高压液相色谱法和免疫测定法等，其中后4种测定方法的灵敏度和精密度较好，但因受仪器和试剂等条件制约未能普及。目前使用较多的是分光光度法，它又有多种测定方法。
紫外分光光度法测定ACE活性的反应原理是：利用血管紧张素转换酶水解马尿酰甘氨酸(HGG)底物，生成马尿酸和甘氨酰甘氨酸，在228nm处其吸光度与马尿酸的含量成正比，而马尿酸产生的量与血管紧张素转换酶的活性成正比。
三硝基苯磺酸钠(TNBS)显色法测定ACE活性的反应原理是：以马尿酰-甘氨酰-甘氨酸作为底物，在血管紧张素转换酶作用下，释放出甘氨酰甘氨酸，后者与三硝基苯磺酸钠作用，生成黄色的三硝基苯甘氨酰甘氨酸(TNP-Gly-Gly)，产物中TNP-Gly-Gly的含量与ACE活性呈正相关。
现有技术中采用酶偶联法检测ACE活性的方法是，用马尿酸双甘肽作为反应底物，与血管紧张素转换酶反应生成马尿酸和双甘肽，再偶联γ-谷氨酰基转移酶催化L-γ-谷氨酰-3-羟基-4-硝基苯胺与双甘肽反应，产生3-羟基-4-硝基苯胺，3-羟基-4-硝基苯胺于410nm波长有吸收峰，通过测定410nm处吸光度，从而反映血管紧张素转换酶活性。
发明内容
本发明的目的是：提供一种酶法测定血管紧张素转换酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的血管紧张素转换酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪进行血管紧张素转换酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，丰富和提高医学领域血管紧张素转换酶活性检测技术。
为实现本发明的第一个目的，一种测定血管紧张素转换酶活性的方法，采用以下步骤进行：
首先，将需要测定的样品与含有“呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸”的试剂混匀，使该化合物与样品中含有的血管紧张素转换酶反应，生成呋喃基-丙烯酰-苯丙氨酸和双甘肽，即：
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，进而测算出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
为实现本发明的第二个目的——血管紧张素转换酶诊断试剂盒，按以下成分和用量配制试剂，按规格分装后得到试剂盒：
缓冲液 40～200mmol/l，
呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸 0.1～10mmol/l，
稳定剂 10～50mmol/l。
上述血管紧张素转换酶诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是：“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为保持试剂的稳定性以便长期储存，以上试剂中通常加入稳定剂，其浓度在10～50mmol/l范围之内。用作稳定剂的物质可以是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：
缓冲液 80～120mmol/l，
呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸 0.3～2mmol/l，
稳定剂 20～30mmol/l。
本发明应用人工合成底物“呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸”(furyl-acryloyl-phe-gly-glycine，FAPGG)直接与血管紧张素转换酶作用，生成呋喃基-丙烯酰-苯丙氨酸和双甘肽，其中呋喃基-丙烯酰-苯丙氨酸在340nm没有吸收峰，在该位置反应所引起的吸光度的变化与样品中血管紧张素转换酶的活性成正比。因此，在固定时间间隔内测定340nm处吸光度的下降速度，便能很好地反映出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：
(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过FAPGG直接与ACE作用，定量反映出被测样品中ACE的活性，测试结果准确；
(2)参与酶偶联反应的成分是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；
(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，可用于检测各种样品，便于推广应用；
(5)本发明提供的血管紧张素转换酶诊断试剂盒稳定性好，存在于其中的各有效成分的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果，并可长时间储存。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一
按以下成分和用量配制血管紧张素转换酶活性诊断试剂盒：
Tris-HCl缓冲液 80mmol/l，
FAPGG 0.3mmol/l，
乙二醇 20mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测血管紧张素转换酶样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-52000。
加入样品和配成的试剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二
按以下成分和用量配制血管紧张素转换酶活性诊断试剂盒：
咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，
FAPGG 1.2mmol/l，
甘油 25mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测血管紧张素转换酶样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-52000。
加入样品和配成的试剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三
按以下成分和用量配制血管紧张素转换酶活性诊断试剂盒：
三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，
FAPGG 2mmol/l，
丙二醇 30mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测血管紧张素转换酶样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-52000。
加入样品和配成的试剂，两者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应：
检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血管紧张素转换酶样品的活性大小，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的血管紧张素转换酶活性诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中血管紧张素转换酶的活性。
Claims (7)
1.一种测定血管紧张素转换酶活性的方法，包括以下步骤：
①将待测样品与含有“呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸”的试剂混匀，使该化合物与样品中含有的血管紧张素转换酶反应，生成呋喃基-丙烯酰-苯丙氨酸和双甘肽，即
②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出样品中血管紧张素转换酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述的测定血管紧张素转换酶活性的方法，其特征在于：待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的测定血管紧张素转换酶活性的方法，其特征在于：反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
4.一种血管紧张素转换酶诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：
缓冲液 40～200mmol/l，
呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸 0.1～10mmol/l，
稳定剂 10～50mmol/l。
5.根据权利要求4所述的血管紧张素转换酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的血管紧张素转换酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4～6所述的任意一种血管紧张素转换酶诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
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