CN1789428A

CN1789428A - 单胺氧化酶活性测定方法及单胺氧化酶诊断试剂盒

Info

Publication number: CN1789428A
Application number: CN 200410066194
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Current assignee: Suzhou ANJ Biotech Co Ltd
Priority date: 2004-12-13
Filing date: 2004-12-13
Publication date: 2006-06-21

Abstract

本发明涉及单胺氧化酶活性的测定方法及其诊断试剂盒。利用单胺氧化酶水解苄胺、对苯甲胺－β－偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β－苯乙基胺、酪胺等胺类化合物产生氨，再偶联谷氨酸脱氢酶反应，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，通过测定主波长340nm处吸光度的下降速度定量反映出样品中单胺氧化酶的活性大小。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。

Description

单胺氧化酶活性测定方法及单胺氧化酶诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及酶法测定单胺氧化酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的单胺氧化酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

现有技术中，测定单胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有：荧光法、免疫抑制法和化学分光光度法。荧光法是以β-苯乙胺作为底物来检测单胺氧化酶，其依据是：β-苯乙胺在10～100mg时反应速度最大，高于苄胺和5-羟色胺的反应速度。免疫学方法则利用单胺氧化酶抗体与单胺氧化酶发生反应，测定反应后形成的单胺氧化酶同工酶，目前应用较多的单克隆抗体有MAO-A3C9、MAO-A4F10、MAO-A7B10、MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

相对而言，化学分光光度法应有更为普遍。可以用单胺氧化酶催化胺类释放出的过氧化氢(H₂O₂)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氢-吩噻嗪(MCDP)等发色剂进行测定，也可以应用苄胺(Benzylamine)、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、β-苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine，又称“3-对羟基苯乙胺”，3-parahdroxyphenylethylamine)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine)等作为反应底物来测定单胺氧化酶的活性。其中，应用苯甲胺类型底物测得的单胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺作底物测得的活性约为3-对羟基苯乙胺作底物的30％。目前，单胺氧化酶测定多用苄胺和对苯甲胺-β-偶氮萘酚作为底物。苄胺法的原理是苄胺在单胺氧化酶的作用下生成苄醛，然后在强碱性氢氧化钠的条件下与二硝基苯肼反应，生成醛苯腙，这在生化仪上测定较困难；对苯甲胺-β-偶氮萘酚方法则需要用环乙烷提取，限制了该方法的实用性，且不能应用全自动生化仪分析。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可以克服现有技术缺点的测定单胺氧化酶活性的方法，以及应用该方法配制而成的单胺氧化酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪进行单胺氧化酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，为在医学检测领域切实推广单胺氧化酶活性测定方法及其诊断试剂盒提供技术支撑。

为实现本发明的目的，一种测定单胺氧化酶活性的方法，采用以下步骤进行：

首先，将需要测定的样品与含有胺类化合物、2-酮戊二酸酯、谷氨酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，进而测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。

上述测定单胺氧化酶活性的方法中，所述胺类化合物是以下物质之一，苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物。

测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

实现本发明单胺氧化酶活性测定方法的诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液 40～200mmol/l，

胺类化合物 0.5～20mmol/l，

2-酮戊二酸酯 0.5～50mmol/l，

还原型辅酶 0.15～0.3mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 10000～500000U/l，

稳定剂/试剂总体积 10～80％。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源氨污染，比如：

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分：2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的胺类化合物也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源氨污染，还有利于试剂更稳定：

I	还原型辅酶	0.15～0.3mmol/l
	还原型辅酶	0.15～0.3mmol/l	稳定剂	10～50mmol/l
	试剂II	缓冲液	稳定剂	10～50mmol/l	40～200mmol/l
谷氨酸脱氢酶		缓冲液	10000～500000U/l		40～200mmol/l
谷氨酸脱氢酶		稳定剂/试剂II总体积	10000～500000U/l	10～80％
试剂III		稳定剂/试剂II总体积	缓冲液	10～80％	40～200mmol/l
	胺类化合物	0.5～20mmol/l	缓冲液		40～200mmol/l
	胺类化合物	0.5～20mmol/l	稳定剂	10～50mmol/l

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的2-酮戊二酸酯和还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的谷氨酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的胺类化合物也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

本发明测定单胺氧化酶活性的诊断试剂盒的成分当中，所述胺类化合物优选以下物质之一：苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物，但选择范围不受这些列举所限制。

配制诊断试剂盒时，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是：“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。

用作稳定剂的物质可以是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

上述诊断试剂盒的成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD⁺)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP⁺)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。

研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：

缓冲液 80～120mmol/l，

胺类化合物 1～10mmol/l，

2-酮戊二酸酯 3～20mmol/l，

还原型辅酶 0.2～0.3mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 50000～200000U/l，

稳定剂/试剂总体积 20～50％。

本发明技术路线上采取单胺氧化酶偶联谷氨酸脱氢酶反应连续监测单胺氧化酶的活性，具体为：单胺氧化酶水解苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺等胺类化合物产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中单胺氧化酶的活性成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的下降速度，便能很好地反映出样品中单胺氧化酶的活性大小。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：

(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，定量反映出被测样品中单胺氧化酶的活性，测试结果准确；

(2)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；

(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；

(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中单胺氧化酶的活性大小；

(6)本发明提供的液态单胺氧化酶活性诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例一(单剂)

按以下成分和用量配制单胺氧化酶活性诊断试剂盒：

双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，

丁基胺 1mmol/l，

2-酮戊二酸酯 3mmol/l，

thio-NADH 0.2mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 50000U/l，

乙二醇 50％(占试剂总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测单胺氧化酶样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例二(双剂)

按以下成分和用量配制单胺氧化酶活性诊断试剂盒：

试剂I——

咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，

2-酮戊二酸酯 12mmol/l，

NADPH 0.25mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 120000U/l，

甘油 50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，

β-苯乙基胺 6mmol/l，

乙二醇 20mmol/l。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测单胺氧化酶样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例三(三剂)

按以下成分和用量配制单胺氧化酶活性诊断试剂盒：

试剂I

三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，

2-酮戊二酸酯 20mmol/l，

thio-NADPH 0.3mmol/l，

丙二醇 20mmol/l；

试剂II——

三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 200000U/l，

丙二醇 50％(占试剂II总体积)；

试剂III——

三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，

酪胺 10mmol/l，

乙二醇 20mmol/l。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

先加入样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例四(双剂优选例)

按以下成分和用量配制单胺氧化酶活性诊断试剂盒：

试剂I——

Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，

2-酮戊二酸酯 7mmol/l，

NADH 0.25mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 150000U/l，

甘油 50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，

苄胺 3mmol/l，

甘油 50％(占试剂II总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应：

检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

本发明的显著特色之一是可以消除内、外源氨的污染。消除内、外源氨的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间，受污染的内、外源氨已经被消耗殆尽，而后半段时间检测所需要的氨都是产生于单胺氧化酶的活性。

总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出单胺氧化酶样品的活性大小，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的单胺氧化酶活性诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中单胺氧化酶的活性。

Claims

1.一种测定单胺氧化酶活性的方法，包括以下步骤：

①将待测样品与含有胺类化合物、2-酮戊二酸酯、谷氨酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出样品中单胺氧化酶的活性大小。

2.根据权利要求1所述的测定单胺氧化酶活性的方法，其特征在于：所述胺类化合物是以下物质之一，苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的测定单胺氧化酶活性的方法，其特征在于：待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

4.一种单胺氧化酶诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：

缓冲液 40～200mmol/l，

胺类化合物 0.5～20mmol/l，

2-酮戊二酸酯 0.5～50mmol/l，

还原型辅酶 0.15～0.3mmol/l，

谷氨酸脱氢酶 10000～500000U/l，

稳定剂/试剂总体积 10～80％。

5.根据权利要求4所述的单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述胺类化合物是以下物质之一，苄胺、对苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羟色胺或者这七种物质的衍生物。

6.根据权利要求4或5所述的单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。

7.根据权利要求6所述的单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。

8.根据权利要求4或5所述的单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

9.根据权利要求4或5所述的单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP⁺、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD⁺或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP⁺；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。

10.权利要求4～9中任意一种单胺氧化酶诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。