CN101216421B - 一种阿魏酸酯酶活性的检测方法 - Google Patents

一种阿魏酸酯酶活性的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿魏酸酯酶活性检测方法，包括将待测酶液与阿魏酸甲酯溶液混合反应，然后计算酶活性。本发明在1个96孔板上即可完成12个样品的检测，且样品用量极低，不仅简化了检测阿魏酸酯酶活性的步骤，而且大大节省了时间，降低了工作密度，同时测定结果精确，可操作性强，适合阿魏酸酯酶活性的批量检测工作。

Description

一种阿魏酸酯酶活性的检测方法
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体地，涉及一种通过测定反应体系的OD值检测阿魏酸酯酶活性的方法。
背景技术
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，也被称为肉桂酸酯酶，肉桂酸水解酶)是水解植物细胞壁中羟基肉桂酸和糖之间酯键的一类酶，其催化的主要反应为：多糖～阿魏酸酯+H2O＝阿魏酸+多糖(包括阿魏酸的一些衍生物)。
阿魏酸酯酶在造纸、食品、制药及饲料工业有很广泛的应用空间。近年来，阿魏酸酯酶在饲料消化中的作用日益引起人们的关注。秸秆和饲草干物质中约30％～80％为细胞壁成分，然而，反刍动物对这些细胞壁的消化利用率不超过50％。因此，细胞壁成为秸秆和饲草利用的瓶颈因素。
阿魏酸酯酶可以打开饲料细胞壁木质素中阿魏酸、对香豆酸及二聚阿魏酸等分子与半纤维素支链形成的致密网状交联结构，从空间上增加瘤胃微生物对细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推测认为是消除细胞壁降解限制因子的关键酶之一。
多种天然和合成底物被用来检测阿魏酸酯酶的活性，如脱淀粉小麦麸、阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯、阿魏酰基寡糖等。根据底物利用数据及一级序列同一性，阿魏酸酯酶已被分为4个亚类，type～A、B、C、D。这4类阿魏酸酯酶均可水解最简单的底物阿魏酸甲酯，释放出的阿魏酸通常经由HPLC、GC或分光光度计进行检测。
但是HPLC和GC所需仪器设备昂贵，操作复杂，花费较高，应用分光光度计进行检测相对成本较低，但这三种方法对样品的需要量都较大，步骤繁琐，费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速简便、可用于大量样品检测的阿魏酸酯酶活性检测方法。
为了实现本发明的目的，本发明的一种阿魏酸酯酶活性检测方法，其步骤包括：将待测酶液与阿魏酸甲酯溶液混合，进行反应，检测OD值，计算酶活性。
所述的待测酶液的制备步骤包括：在96孔板上每孔加入50～100μL适当稀释9～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟。优选地为39℃预热15分钟。
所述的阿魏酸甲酯溶液的制备步骤包括：称取适量104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH4.5～7)稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟。优选的为稀释至100μM，pH为6.0，预热为15分钟。所述的反应温度为35～65℃，反应时间依据样品活性而定，一般为10～30分钟。
所述的OD值是在340nm下用酶标仪检测。
所述的一种阿魏酸酯酶活性检测方法，具体包括如下步骤：
(1)称取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH4.5～7)稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟，得到阿魏酸甲酯溶液；
(2)在96孔板上每孔加入适当稀释6～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟，得待测酶液；
(3)在步骤(2)的待测酶液中，在48个孔中加入步骤(1)的阿魏酸甲酯溶液，35～65℃反应10～30分钟，使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白加入其余的48个孔中；
(4)通过如下公式计算阿魏酸酯酶的活性：
Figure S2007103047620D00031
其中OD反应起始：反应起始反应体系的OD值；
OD反应终止：反应终止反应体系的OD值；
OD酶空白起始：不加待测酶反应起始反应体系的OD值；
OD酶空白终止：不加待测酶反应终止反应体系的OD值；
V体系：反应体系的总体积；
l：光程厚度(cm)
ε阿魏酸甲酯：阿魏酸甲酯的消光系数；
ε阿魏酸：阿魏酸的消光系数；
V样品：待测酶液的体积。
其中，待测酶液与阿魏酸甲酯溶液的体积比为50～100∶100～200；优选地为100∶200。其中，步骤(1)、(2)和(3)中预热温度及反应温度应一致。
本发明的检测方法可用于阿魏酸酯酶酶制剂活性的批量检测，在饲料业、造纸业、制药业、香料生产中具有较高的实际应用价值。酶活定义：一定温度下，每分钟由阿魏酸甲酯释放出1uM阿魏酸所需酶量为1U，U/mL。
用本发明的检测方法在1个96孔板上即可完成12个样品的检测，且样品用量极低，不仅简化了检测阿魏酸酯酶活性的步骤，而且大大节省了时间，降低了工作密度，同时还可获得比较准确的实验效果，可操作性强，适合阿魏酸酯酶活性的批量检测工作。
本发明在实验室检测及饲料工业中具有较高的应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
利用本发明的阿魏酸酯酶活性检测方法测定肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性的日变化。
(1)称取适量104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)稀释至100μM，39℃预热15分钟，得阿魏酸甲酯溶液；
(2)在96孔板上每孔加入100μL稀释6.25倍的待测酶液，在39℃预热15分钟；
(3)然后在步骤(2)的待检测酶液中，分别在48个孔中各加入200μL阿魏酸甲酯溶液作为反应体系，39℃反应30分钟；
(4)使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；
用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白，在其余的48个孔中各加100mM MOPS缓冲液(pH6.0)。
按照表1中的时间采集待测样品，待测样品的反应体系和分别对应的酶空白各做4个平行，测定肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性，测定的OD值取其平均值，最后的OD值测定结果见表1：
表1反应体系和酶空白OD值测定
采样时间  OD<sub>反应起始</sub>  OD<sub>反应终止</sub>  OD<sub>酶空白起始</sub>  OD<sub>酶空白终止</sub>
1:00  1.150  1.123  0.524  0.509
3:00  1.086  1.049  0.581  0.561
5:00  1.230  1.202  0.869  0.860
7:00  1.563  1.526  0.799  0.799
9:00  1.311  1.272  0.745  0.741
11:00  1.231  1.172  0.651  0.614
13:00  1.260  1.232  0.715  0.710
15:00  1.011  0.967  0.506  0.481
17:00  1.062  1.044  0.672  0.670
19:00  1.218  1.160  0.611  0.581
21:00  1.070  1.029  0.576  0.569
23:00  1.208  1.189  0.614  0.612
本实施例1的V体系为300μL，lε阿魏酸甲酯为9.467L·mM-1，lε阿魏酸为2.049L·mM-1，V样品为100μL，将其和表1中的数据，通过本发明的酶活性的计算公式，计算得到阿魏酸酯酶活性检测方法测定肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性的日变化结果见表2。
表2肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性的日变化
采样时间 1:00  3:00  5:00  7:00  9:00  11:00
酶活(mU/mL) 1.011  1.432  1.559  3.160  2.907  1.854
采样时间 13:00  15:00  17:00  19:00  21:00  23:00
酶活(mU/mL) 1.938  1.601  1.264  2.401  2.907  1.432
实施例2
利用本发明的阿魏酸酯酶活性检测方法测定肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性，具体包括如下步骤：
(1)称取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH4.5)稀释至50μM，35℃预热30分钟，得到阿魏酸甲酯溶液；
(2)在96孔板上每孔加入50μL适当稀释6倍的待测酶液，35℃预热30分钟，得待测酶液；
(3)在步骤(2)的待测酶液中，在48个孔中各加入100ul步骤(1)的阿魏酸甲酯溶液，35℃反应30分钟，使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；
用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白，在其余的48个孔中各加100mM MOPS缓冲液(pH6.0)；
(4)使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；
采用本发明的计算阿魏酸酯酶的活性的公式计算肉牛瘤胃液中阿魏酸酯酶活性。
实施例3
利用本发明的阿魏酸酯酶活性检测方法测定阿魏酸酯酶制剂(Biocatalysts Co.Ltd，UK)中阿魏酸酯酶活性，具体包括如下步骤：
(1)称取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用100mM MOPS缓冲液(pH7)稀释至200μM，65℃预热10分钟，得到阿魏酸甲酯溶液；
(2)在96孔板上每孔加入100μL适当稀释1600倍的待测酶液，共加8个孔，65℃预热10分钟，得待测酶液；
(3)在步骤(2)的待测酶液中，在4个孔中各加入步骤(1)的200ul阿魏酸甲酯溶液，65℃反应10分钟，使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；
用100mM MOPS缓冲液(pH6.0)替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白，在其余的4个孔中各加100mM MOPS缓冲液(pH6.0)；
(4)使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；
采用本发明的计算阿魏酸酯酶的活性的公式计算阿魏酸酯酶制剂(Biocatalysts Co.Ltd，UK)中阿魏酸酯酶活性。

Claims (8)

1.一种阿魏酸酯酶活性检测方法，包括步骤：将待测酶液与阿魏酸甲酯溶液混合进行反应，检测反应体系在反应起始及终止时的OD值，检测酶空白反应体系在反应起始及终止时的OD值，并通过下述公式计算酶活：
Figure FA20191913200710304762001C00011
其中，
OD反应起始：反应起始反应体系的OD值；
OD反应终止：反应终止反应体系的OD值；
OD酶空白起始：不加待测酶反应起始反应体系的OD值；
OD酶空白终止：不加待测酶反应终止反应体系的OD值；
V体系：反应体系的总体积；
l：光程厚度(cm)；
ε阿魏酸甲酯：阿魏酸甲酯的消光系数；
ε阿魏酸：阿魏酸的消光系数；
V样品：待测酶液的体积；
其特征在于，所述的OD值是在340nm下用酶标仪检测；所述的待测酶液的制备步骤包括：在有96个孔的板上加入50～100μL适当稀释6～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的待测酶液的制备步骤中在39℃预热为15分钟。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的阿魏酸甲酯溶液的制备步骤包括：称取适量104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用pH为4.5～7的100mM MOPS缓冲液稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的阿魏酸甲酯溶液的制备步骤中稀释至100μM，pH为6.0，预热为15分钟。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的待测酶液与阿魏酸甲酯溶液的体积比为50～100∶100～200。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的待测酶液与阿魏酸甲酯溶液的体积比为100∶200。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的反应温度为35～65℃，时间为10～30分钟
8.如权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
(1)称取104.11mg阿魏酸甲酯，充分溶于20ml无水乙醇中，用pH为4.5～7的100mM MOPS缓冲液稀释至50～200μM，35～65℃预热10～30分钟，得到阿魏酸甲酯溶液；
(2)在有96个孔的板上加入适当稀释6～1600倍的待测酶液，35～65℃预热10～30分钟，得待测酶液；
(3)在步骤(2)的待测酶液中加入步骤(1)的阿魏酸甲酯溶液，35～65℃反应10～30分钟，使用酶标仪在340nm检测反应体系在反应起始及终止时的OD值；用pH为6.0的100mM MOPS缓冲液替代阿魏酸甲酯溶液作为酶空白；
(4)通过如下公式计算阿魏酸酯酶的活性：
Figure FA20191913200710304762001C00021
其中，待测酶液与阿魏酸甲酯溶液的体积比为50～100∶100～200。
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