CN1778954A - 无机磷的测定方法及其诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定无机磷的方法及其诊断试剂盒。利用丙酮酸氧化酶在血浆、血清等样品中无机磷的激活下与丙酮酸作用生成二氧化碳，二氧化碳在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下与磷酸烯醇式丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶的作用下将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，检测主波长340nm吸光度的下降幅度，从而测算出样品中无机磷的含量。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。

Description

无机磷的测定方法及其诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及测定无机磷的方法，以及应用该方法配制而成的诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

人体内部的磷元素约有87％存在于骨骼中，血液中的磷与骨骼中的磷保持动态平衡关系。另一方面，血液中钙和磷的浓度之间有一定关系，两者的乘积保持在一定范围之内，以毫克为单位，大约每100毫升血浆中钙和磷的含量之积为35～40。正常人血钙升高则血磷降低，反之亦然。当上述乘积大于40时，钙和磷以骨盐形式沉积在骨组织；大于70时，可发生转移性钙化；小于35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用，引起佝偻病或软骨病。一般地，可以通过维生素D、甲状旁腺激素、降钙素等来调节血浆中钙和磷的浓度。

目前，人体的含磷总量还不能直接测定，大多是检测血浆或血清中磷酸根离子浓度来反映。由于H₂PO₄ ^-在血液等自然条件下最能稳定存在，是无机磷的主要存在形式，因而测定H₂PO₄ ^-的浓度便能间接代表或推知无机磷的总量。常用的检测方法有：磷钼酸还原法/非还原法、染料结合法、酶法、同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度法、流动注射分析法等等。其中，决定性的方法是同位素稀释质谱法，中等实验室推荐使用的常规方法是磷钼酸比色法。

磷钼酸还原法又分“无蛋白血滤液法”和“不去蛋白法”，前者需将血液先去蛋白，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂的种类很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁、硫酸亚铁铵、硫酸肼、米吐尔等，表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。

磷钼酸非还原法又称“直接紫外法”，是在340nm或325nm波长直接测定磷钼酸杂聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸、溶血、脂浊血清在340nm有吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。

相比于其它检测方法，酶法以其选择性好、灵敏度高、可实现自动化分析等优点而备受人们青睐，用酶法测定无机磷含量既是目前人们的研究热点，也是将来的发展趋势。但是，采用不同的试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大的差别，直接影响到该方法的使用与推广。

发明内容

本发明的目的是：提供一种酶法测定无机磷含量的方法，以及应用该方法配制而成的无机磷诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中无机磷的含量进行快速、准确测定，以便推广使用该检测方法和诊断试剂，使本领域内医学检验测试手段得到丰富和发展。

为实现本发明的目的，一种测定无机磷的方法，通过以下步骤进行：

首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶以及还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，进而测算出样品中无机磷的含量。

测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

实现本发明方法测定血浆、血清等样品中无机磷含量的诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液                    40～200mmol/l，

丙酮酸                    0.5～20mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸          0.5～20mmol/l，

还原型辅酶                0.2～0.3mmol/l，

丙酮酸氧化酶              1000～60000U/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶    1000～60000U/l，

苹果酸脱氢酶              2000～80000U/l，

稳定剂/试剂总体积         10～80％。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合，配制成双剂，比如：

	成分	含量范围
			试剂I	缓冲液	40～200mmol/l
丙酮酸	0.5～20mmol/l
		磷酸烯醇式丙酮酸		0.5～20mmol/l
还原型辅酶	0.2～0.3mmol/l
		磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶		1000～60000U/l
苹果酸脱氢酶	2000～80000U/l
		稳定剂/试剂I总体积		10～80％
试剂	缓冲液				40～200mmol/l
		丙酮酸氧化酶	1000～60000U/l

II

稳定剂/试剂II总体积

10～80％

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分——丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等，可以放在试剂II，试剂II中的丙酮酸氧化酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

为使试剂更稳定，还可以配制成三剂，比如：

	成分	含量范围
			试剂I	缓冲液	40～200mmol/l
丙酮酸	0.5～20mmol/l
		磷酸烯醇式丙酮酸		0.5～20mmol/l
还原型辅酶	0.2～0.3mmol/l
		稳定剂		10～50mmol/l
试剂II	缓冲液				40～200mmol/l
		磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶	1000～60000U/l
	苹果酸脱氢酶			2000～80000U/l
		稳定剂/试剂II总体积	10～80％
	试剂III			缓冲液	40～200mmol/l
丙酮酸氧化酶		1000～60000U/l
			稳定剂/试剂III总体积	10～80％

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I的丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶等，可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的丙酮酸氧化酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是：“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。

用作稳定剂的物质可以是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

上述无机磷诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP⁺、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD⁺或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP⁺；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。

研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的无机磷诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：

缓冲液                        80～120mmol/l，

丙酮酸                        3～15mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸              2～8mmol/l，

还原型辅酶                    0.2～0.3mmol/l，

丙酮酸氧化酶                  6000～12000U/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶        4000～10000U/l，

苹果酸脱氢酶                  8000～16000U/l，

稳定剂/试剂总体积             20～50％。

本发明利用丙酮酸氧化酶在血浆、血清等样品中的无机磷的激活下与丙酮酸作用生成二氧化碳，二氧化碳在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下与磷酸烯醇式丙酮酸反应生成草酰乙酸，草酰乙酸再在苹果酸脱氢酶的作用下将还原型辅酶反应成氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，因此，测量反应前后340nm处吸光度的下降幅度，便能很好地反映出被测样品中无机磷的含量。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：

(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将氧化型辅酶反应成还原型辅酶，定量反映出被测样品中无机磷的含量，测试结果准确；

(2)参与酶偶联反应系统的反应成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；

(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；

(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内血磷的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中无机磷的含量；

(6)本发明提供的液态无机磷诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后，能够进一步减少各种成分之间的交叉影响，提高试剂的稳定性，便于长期储存。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例一(单剂)

按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒：

双甘氨肽缓冲液                80mmol/l，

丙酮酸                        3mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸              2mmol/l，

thio-NADH                     0.2mmol/l，

丙酮酸氧化酶                  6000U/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶        4000U/l，

苹果酸脱氢酶                  8000U/l，

乙二醇                        50％(占试剂总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)。

加入血清样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。一共检测读点31次，大约每隔20秒记录一次数据，根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例二(双剂)

按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒：

试剂I——

咪唑～盐酸缓冲液                100mmol/l，

丙酮酸                          9mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸                5mmol/l，

NADPH                           0.25mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶          7000U/l，

苹果酸脱氢酶                    12000U/l，

甘油                            50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

咪唑～盐酸缓冲液                100mmol/l，

丙酮酸氧化酶                    9000U/l，

乙二醇                          50％(占试剂II总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。

先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例三(三剂)

按以下成分和用量配制血清中无机磷诊断试剂盒：

试剂I——

三乙醇胺缓冲液            120mmol/l，

丙酮酸                    15mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸          8mmol/l，

thio-NADPH                0.3mmol/l，

丙二醇                    20mmol/l；

试剂II——

三乙醇胺缓冲液            120mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶    10000U/l，

苹果酸脱氢酶              16000U/l，

丙二醇                    50％(占试剂II总体积)；

试剂III——

三乙醇胺缓冲液            120mmol/l，

丙酮酸氧化酶              12000U/l，

乙二醇                    50％(占试剂III总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应。

先加入血清样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例四(双剂优选例)

按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒：

试剂I—

Tris-HCl缓冲液            100mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸            2mmol/l，

NADH                        0.25mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶      10000U/l，

苹果酸脱氢酶                10000U/l，

甘油                        50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

Tris-HCl缓冲液            100mmol/l，

丙酮酸                      3mmol/l，

丙酮酸氧化酶                10000U/l，

甘油                        50％(占试剂II总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。

先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应：

检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中无机磷的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

本发明的显著特色之一是可以消除内、外源二氧化碳的污染。消除内、外源二氧化碳的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间，受污染的内、外源二氧化碳已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试血浆、血清等样品中无机磷含量所需要的二氧化碳都是源自样品中无机磷的作用。

总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等样品中无机磷的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的无机磷诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的无机磷含量。

Claims (9)

1.一种测定无机磷的方法，包括以下步骤：

①将待测样品与含有丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶以及还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，测算出样品中无机磷的含量。

2.根据权利要求1所述的测定无机磷的方法，其特征在于：待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。

3.根据权利要求1或2所述的测定无机磷的方法，其特征在于：反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

4.一种无机磷诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：

缓冲液                40～200mmol/l，

丙酮酸                0.5～20mmol/l，

磷酸烯醇式丙酮酸      0.5～20mmol/l，

还原型辅酶            0.2～0.3mmol/l，

丙酮酸氧化酶          1000～60000U/l，

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶      1000～60000U/l，

苹果酸脱氢酶                2000～80000U/l，

稳定剂/试剂总体积           10～80％。

5.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。

6.根据权利要求5所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”或者“碳酸钠～碳酸氢钠缓冲液”中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

8.根据权利要求4所述的无机磷诊断试剂盒，其特征在于：所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP⁺、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD⁺或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP⁺；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。

9.权利要求4～8中任意一项无机磷诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。