CN1778958A - 酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶法测定镁离子含量的方法以及镁离子诊断试剂盒。应用血浆、血清等样品中镁离子激活己糖激酶活性的特点，在腺苷三磷酸的存在下与葡萄糖反应生成葡萄糖－6－磷酸，再偶联葡萄糖磷酸脱氢酶、6－磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶，将两分子氧化型辅酶反应成两分子还原型辅酶，通过测定340nm吸光度的上升幅度而检测出样品中镁离子含量。该方法特异性高，不受内、外源物质污染，测试结果精确，准确性好、灵敏度高。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，测试成本低廉，便于行业内推广应用。

Description

酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及酶法测定血浆、血清等样品中镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

目前医学上测定血浆、血清等样品中镁离子含量(简称镁测定)的手段比较多，概括起来有：比色法、荧光法、离子色谱法、离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。其中决定性的方法是ID-MS，其次是AAS，这两种方法虽然结果准确，但设备复杂、费用昂贵，不适用于常规实验室和自动分析。

比色法是应用最广泛的方法，包括：甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、钙镁试剂法(Calmagite)以及新近报道的2-(8’-羟基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-变色酸法(8Q5SAC)。比色法操作简便、费用低，适合常规实验室应用，但存在试剂空白吸光度高、易受胆红素和其它阳离子干扰、试剂稳定性差，以及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法(ISE)可以测定生理溶液中镁离子活度，采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极，测定的准确度较高，但仍存在生理范围内的钙干扰，Ca²⁺最大干扰达10％。离子色谱法在测定之前需要对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该方法对五种“国际标准和技术学会”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35％，认为离子色谱法可作为测定镁元素总量的有价值的参考方法。

酶法测定血浆、血清等样品中镁离子(主要是Mg²⁺)的研究近几年非常活跃，取得了较大进展。目前已应用于Mg²⁺测定的酶学方法有：①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。

总体上看，采用酶法检测镁离子结果准确、干扰小、适合于自动化分析。但是，应用不同的检测试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大差别，直接影响到该方法的使用与推广，这正是人们在该领域内不断研究、发展和创新的原因所在。由于有着非常好的应用前景，对酶法检测镁离子的研究已经成为该领域内的热点。

发明内容

本发明的目的是：提供一种酶法测定镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中镁离子的含量进行快速、准确测定，以便推广使用酶法检测镁离子的方法以及相应的诊断试剂盒，使该领域内检测手段得到进一步丰富和发展。

为实现本发明的目的，一种酶法测定镁离子含量的方法，采用以下步骤进行：

首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有葡萄糖、腺苷三磷酸、己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

(其中“6-磷酸葡糖酸内酯”即6-phospho-D-gluconolactone)

然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升幅度，进而测算出样品中镁离子的含量。

测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

实现本发明方法的镁离子诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成：

缓冲液                    40～200mmol/l，

葡萄糖                    1～40mmol/l，

腺苷三磷酸                0.2～20mmol/l，

氧化型辅酶                0.2～5mmol/l，

己糖激酶                  4000～50000U/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶          4000～50000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶        4000～50000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶          4000～50000U/l，

稳定剂/试剂总体积         10～80％。

也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源葡萄糖-6-磷酸的污染，比如：

I	葡萄糖磷酸脱氢酶	4000～50000U/l
			6-磷酸葡糖酸内酯酶	4000～50000U/l
	磷酸葡糖酸脱氢酶	4000～50000U/l
			稳定剂/试剂I总体积	10～80％
	试剂II	缓冲液			40～200mmol/l
葡萄糖			1～40mmol/l
		腺苷三磷酸		0.2～20mmol/l
己糖激酶			4000～50000U/l
		稳定剂/试剂II总体积		10～80％

双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分：氧化型辅酶、葡萄糖磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的成分：葡萄糖、腺苷三磷酸、己糖激酶等，也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源葡萄糖-6-磷酸的污染，还有利于试剂更稳定：

III	腺苷三磷酸	0.2～20mmol/l
			己糖激酶	4000～50000U/l
	稳定剂/试剂III总体积	10～80％

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的氧化型辅酶可以放在试剂II或试剂III中；试剂II中的葡萄糖磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶等，可以放在试剂I或试剂III中；试剂III中的葡萄糖、腺苷三磷酸、己糖激酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。

上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是：“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。

此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。

用作稳定剂的物质可以是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

上述镁离子诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD⁺)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP⁺)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。

研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的镁离子诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：

缓冲液                80～120mmol/l，

葡萄糖                10～20mmol/l，

腺苷三磷酸            2～10mmol/l，

氧化型辅酶            1～5mmol/l，

己糖激酶              10000～30000U/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶      10000～30000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶    10000～30000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶      10000～30000U/l，

稳定剂/试剂总体积     20～50％。

本发明应用镁离子激活己糖激酶活性的特点，己糖激酶活性激化的程度与血浆、血清等被测样品中镁离子的含量成正比，在腺苷三磷酸的存在下与葡萄糖反应生成葡萄糖-6-磷酸，再偶联葡萄糖磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶，将两分子的氧化型辅酶反应成两分子的还原型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中镁离子的含量成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的上升幅度，便能很好地反映出样品中镁离子的含量。

本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：

(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将氧化型辅酶反应成还原型辅酶，定量反映出被测样品中镁离子的含量，测试结果准确；

(2)通过多种酶的偶联反应，将两分子的氧化型辅酶反应成两分子的还原型辅酶，检测灵敏度与普通方法相比提高了一倍；

(3)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；

(4)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；

(5)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；

(6)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内镁离子的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中的镁离子；

(7)本发明提供的液态镁离子诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。

实施例一(单剂)

按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒：

双甘氨肽缓冲液                80mmol/l，

葡萄糖                        10mmol/l，

腺苷三磷酸                    2mmol/l，

thio-NAD⁺                    1mmol/l，

己糖激酶                      10000U/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶              10000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶            10000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶              10000U/l，

乙二醇                        50％(占试剂总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为正反应(吸光度上升，下同)。

加入血清样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。一共检测读点31次，大约每隔20秒记录一次数据，根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例二(双剂)

按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒：

试剂I——

咪唑～盐酸缓冲液                100mmol/l，

葡萄糖                          15mmol/l，

腺苷三磷酸                      6mmol/l，

NADP⁺                          3mmol/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶                  20000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶                20000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶                  20000U/l，

甘油                              50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

咪唑～盐酸缓冲液                  100mmol/l，

己糖激酶                          20000U/l，

乙二醇                            50％(占试剂II总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。

先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例三(三剂)

按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒：

试剂I——

三乙醇胺缓冲液                120mmol/l，

葡萄糖                        20mmol/l，

腺苷三磷酸                    10mmol/l，

thio-NADP⁺                   5mmol/l，

丙二醇                        20mmol/l；

试剂II——

三乙醇胺缓冲液                120mmol/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶                        30000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶                      30000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶                        30000U/l，

丙二醇                                  50％(占试剂II总体积)；

试剂III——

三乙醇胺缓冲液                          120mmol/l，

己糖激酶                                30000U/l，

乙二醇                                  50％(占试剂III总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为正反应。

先加入血清样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

实施例四(双剂优选例)

按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒：

试剂I——

Tris-HCl缓冲液                    100mmol/l，

NAD⁺                             4mmol/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶                  15000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶                15000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶                  15000U/l，

甘油                              50％(占试剂I总体积)；

试剂II——

Tris-HCl缓冲液                      100mmol/l，

葡萄糖                              20mmol/l，

腺苷三磷酸                          5mmol/l，

己糖激酶                            15000U/l，

甘油                                50％(占试剂II总体积)。

在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间1O分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为正反应。

先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应：

检测、记录340nm吸光度的上升情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。

本发明的显著特色之一是可以消除内、外源葡萄糖-6-磷酸的污染。消除内、外源葡萄糖-6-磷酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间，受污染的内、外源葡萄糖-6-磷酸已经被消耗殆尽，而后半段时间检测所需要的葡萄糖-6-磷酸都是源自样品中含有的镁离子。发明通过多种酶之间的偶联反应，将两分子的氧化型辅酶反应成两分子的还原型辅酶，检测灵敏度与普通方法相比提高了一倍

总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等样品中镁离子的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的镁离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的镁离子含量。

Claims (10)

1.一种酶法测定镁离子含量的方法，包括以下步骤：

①将待测样品与含有葡萄糖、腺苷三磷酸、己糖激酶、葡萄糖磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷酸葡糖酸脱氢酶和氧化型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，

②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的上升幅度，测算出样品中镁离子的含量。

2.根据权利要求1所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于：待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。

3.根据权利要求1或2所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于：反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。

4.一种镁离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：

缓冲液                 40～200mmol/l，

葡萄糖                 1～40mmol/l，

腺苷三磷酸                      0.2～20mmol/l，

氧化型辅酶                      0.2～5mmol/l，

己糖激酶                        4000～50000U/l，

葡萄糖磷酸脱氢酶                4000～50000U/l，

6-磷酸葡糖酸内酯酶              4000～50000U/l，

磷酸葡糖酸脱氢酶                4000～50000U/l，

稳定剂/试剂总体积               10～80％。

5.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。

6.根据权利要求5所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。

8.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于：所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD⁺、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP⁺、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD⁺或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP⁺；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。

9.权利要求4～8中任意一项镁离子诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。