CN1302119C

CN1302119C - 5ˊ－核苷酸酶活性测定方法及5ˊ－核苷酸酶诊断试剂盒

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Publication number: CN1302119C
Application number: CNB2004100419647A
Authority: CN
Inventors: 王尔中
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2004-09-14
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2024-09-14
Also published as: CN1749406A

Abstract

本发明涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷单磷酸、2-酮戊二酸酯、还原性辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶、稳定剂等。通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。

Description

5′-核苷酸酶活性测定方法及5′-核苷酸酶诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种测定5′-核苷酸酶活性的方法，同时本发明还涉及用于实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，5′-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5′-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5′-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。

5′-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为：5′-核苷酸酶作用于H³-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5′-核苷酸酶活性。或者利用5′-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5′-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种可以克服以上现有技术缺点的5′-核苷酸酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行5′-核苷酸酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明测定5′-核苷酸酶活性的步骤如下：

1)、将样品与主要由腺苷单磷酸、2-酮戊二酸酯、还原性辅酶、腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应：

2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。

这种方法应用5′-核苷酸酶偶联腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶反应连续监测法。5′-核苷酸酶水解腺苷单磷酸产生腺苷，然后腺苷脱氨酶再水解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(NADH、NADPH或其它类似物——在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(NAD⁺、NADP⁺或其它类似物——在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5′-核苷酸酶的活性大小。

用以实现本发明方法的5′-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液 40--200mmol/l

腺苷单磷酸 1--—50mmol/l

2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l

还原性辅酶 0.15--0.3mmo/l

腺苷脱氨酶 5000--500000U/1

谷氨酸脱氢酶 50000--500000U/l

稳定剂 10--80％(总体积)

也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源腺苷及氨的污染：

试剂I

缓冲液 40--200mmol/l

2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l

还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l

谷氨酸脱氢酶 50000--500000U/l

腺苷脱氨酶 5000--500000U/1

稳定剂 10--80％(总体积)

试剂II

缓冲液 40--200mmol/l

腺苷单磷酸 1--50mmol/l

稳定剂 10--50mmo/l

双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、谷氨酸脱氢酶、腺苷脱氨酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，腺苷单磷酸也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。

还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源腺苷及氨的污染，还更有利于试剂的稳定：

试剂I

缓冲液 40--200mmo l/l

2-酮戊二酸酯 0.5--50mmol/l

还原型辅酶 0.15--0.3mmol/l

稳定剂 10--50mmol/l

试剂II

缓冲液 40--200mmol/l

谷氨酸脱氢酶 50000--500000U/l

腺苷脱氨酶 5000--500000U/l

稳定剂 10--80％(总体积)

试剂III

缓冲液 40--200mmol/l

腺苷单磷酸 1--50mmol/l

稳定剂 10--50mmol/l

三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯等可以放在试剂II或试剂III中，试剂II其中的成分，谷氨酸脱氢酶、腺苷脱氨酶等也可以放在试剂I或试剂III中，如此可以形成多种配方，不一一详述。

缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等。

以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。

此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10-80％或者10-50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、盐或腺苷二磷酸等中的一种或一种以上。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明5′-核苷酸酶诊断试剂盒较为理想：

缓冲液 80--120mmol/l

腺苷单磷酸 5--20mmo l/l

2-酮戊二酸酯 5--20mmol/l

还原性辅酶 0.15--0.3mmo/l

腺苷脱氨酶 10000--20000U/l

谷氨酸脱氢酶 100000--200000U/l

稳定剂 20--50％

由于本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。

此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源腺苷及氨的污染，消除内、外源腺苷及氨的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源腺苷及氨已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试5′-核苷酸酶活性所需要的腺苷及氨都是产生于5′-核苷酸酶的活性。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一(单剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂盒包括：

缓冲液 80mmol/l

腺苷单磷酸 5mmol/l

2-酮戊二酸酯 5mmol/l

还原性辅酶 0.15mmo/l

腺苷脱氨酶 10000U/l

谷氨酸脱氢酶 100000U/l

稳定剂 30％(总体积)

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

实施例二(双剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液 100mmol/l

2-酮戊二酸酯 12mmol/l

还原性辅酶 0.2mmol/l

腺苷脱氨酶 15000U/l

谷氨酸脱氢酶 150000U/l

稳定剂 40％(总体积)

试剂II

缓冲液 100mmol/l

腺苷单磷酸 12mmol/l

稳定剂 30mmo l/l

测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

各反应步骤的反应时间控制在10分钟。

实施例三(三剂)

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂为三剂，有：

试剂I

缓冲液 120mmol/l

2-酮戊二酸酯 20mmol/l

还原性辅酶 0.3mmo/l

稳定剂 50mmol/l

试剂II

缓冲液 120mmol/l

腺苷脱氨酶 20000U/l

谷氨酸脱氢酶 200000U/l

稳定剂 50％(总体积)

试剂III

缓冲液 120mmol/l

腺苷单磷酸 20mmol/l

稳定剂 50mmol/l

在全自动生化分析仪上设定：温度25℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

具体测定步骤为：

各反应步骤的反应时间控制在10分钟。

实施例四

本实施例的5′-核苷酸酶诊断试剂有：

试剂I

缓冲液 120mmol/l

腺苷单磷酸 20mmol/l

2-酮戊二酸酯 20mmol/l

还原性辅酶 0.3mmo/l

谷氨酸脱氢酶 200000U/l

稳定剂 50％(总体积)

试剂II

缓冲液 120mmol/l

腺苷单磷酸 5mmol/l

腺苷脱氨酶 10000U/l

稳定剂 50％(总体积)

在生化分析仪上设定：温度25℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测5′-核苷酸酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。

加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应：

将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出5′-核苷酸酶的活性。

Claims

1.一种5′-核苷酸酶活性测定方法，步骤如下：

2.根据权利要求1所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于：所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm，吸光度下降的速度，测算出5′-核苷酸酶的活性大小。

3、根据权利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于：温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。

4、根据权利要求1或2所述5′-核苷酸酶活性测定方法，其特征在于：被测5′-核苷酸酶样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。

5.一种5′-核苷酸酶诊断试剂盒，由以下成分组成：

缓冲液 40——200mmol/l

腺苷单磷酸 1——50mmol/l

2-酮戊二酸酯 0.5——50mmol/l

还原性辅酶 0.15——0.3mmol/l

腺苷脱氨酶 5000——500000U/l

谷氨酸脱氢酶 50000——500000U/l

稳定剂 10——80％(总体积)。

6.根据权利要求5所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或三剂。

7.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵、NaCl或腺苷二磷酸中的至少一种。

8.根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲剂为三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。

9、根据权利要求5或6所述5′-核苷酸酶诊断试剂盒，其特征在于：所述还原型辅酶为NADPH、NADH、thio-NADH还原型烟酰胺辅酶中的一种。