CN1033075A - 用于测定酶动力学的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过测定被分析物催化反应的速 率进而定量测定样品中被分析酶的方法和工具。本 发明方法可用来测定稳定态和非稳定态酶反应动力 学，并提供了反映该结果的物理记录法。

Description

本发明涉及通过被分析物催化反应形成反应产物，由此来定量测定样品中的酶的方法和装置。更具体地讲，本发明涉及下述方法，其中将被分析酶固定在层析介质的反应位点上，并且，把用于被分析物催化反应的底物和辅因子，并且把反应产物通过层析溶剂输送至该位点并从该点离去。

用于检测样品中酶的已知方法一般包括使待分析样品与底物和辅因子混合物相接触，而该底物与辅因子的反应由被分析酶催化。作为被分析物催化反应的结果，通过观察反应产物的产生速率或反应物（底物或辅因子）的消耗速率可以测得样品中的被分析物。如果将反应中某一产物的产生速率用于指示某一酶的存在时，可用目视或分光光度法测定该产物。另外，如果用目视或分光光度法均难以测得反应产物时，使之经历一步或多步能产生易于测定反应产物的后续反应即可测定之。这类反应常常包括使染料前体材料活化的反应。如果将某一反应物的消耗速率用于指示某一酶的存在，该反应物应该是目视或分光光度法能够测得的。通常采用的反应物是分光光度法（于340nm处）或荧光测定法（于410nm处）能够测得的辅因子尼古丁腺嘌呤二核苷酸（nicotine    adenine    diuncleotide）（NADH）。在许多酶催化反应中，该辅因子被氧化为NAD+，后者并不产生特征分光光度或荧光信号。因此，许多被分析物催化反应是根据NADH的消失来跟踪的。

例如，已知一些方法可用于检测丙氨酸转氨酶（ALT），后者血浓度的增加与肝炎相关。对本发明有意义的是下述文献：Murray，“临床化学方法（Methods in Clinical Chemistry）PP.1062-1065，Pesce and Waplan，eds.，Mosby Publishing Co.，St.Louis.MO（1987）。ALT催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸的转氨反应，生成丙酮酸和L-谷氨酸。按照一种广泛采用的用于检测ALT的方法，将L-丙氨酸和α-酮戊二酸与血清一起保温，在精确计时后，使反应停止，新形成的丙酮酸与二硝基苯肼（DNPH）反应，形成相应的腙。然后将该反应混合物碱化，由于形成腙阴离子而产生兰色。因丙酮酸反馈抑制ALT，比色过程呈限制性线性。按照另一方法，将NADH与乳酸脱氢酶一道掺入反应介质中。乳酸脱氢酶催化丙酮酸转化为乳酸，同时使还原型NADH氧化为氧化型NAD⁺。NADH的消失可通过分光光度或荧光法跟踪。

已知类似的方法用于检测天门冬氨酸转氨酶（AST），后者的血清浓度增加与下列疾病有关：急性心肌梗塞，急性胰腺炎，病毒性或中毒性肝炎和急性肝硬化。AST催化天门冬氨酸和α-酮戊二酸的氨基转移反应，形成草酰乙酸和谷氨酸。用于检测该酶的方法包括将受试样品用含有天门冬氨酸，α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼的溶液保温，这样在AST催化产生草酰乙酸的同时形成2，4-二硝基苯基-腙-衍生物，后者在520nm处有光吸收。因此，可通过颜色信号指示样品液体中的AST，该颜色信号可用分光光度计测得或者与比色图表比较，由此半定量地指示AST的存在。已知类似的方法，用能与草酰乙酸反应的偶氮染料代替2，4-二硝基苯腙染料的前体化合物。还有其他用于检测AST的已知方法，其中包括：在利用马来酸脱氢酶和NADH和NAD⁺的反应中将草酰乙酸转化为马来酸。这种分析反应既可在容器（如：试管和微滴定井）中进行，也可在吸收浸渍条上进行。

与本发明有关的公开文献为美国专利3，875，014（Forgione），该专利公开了按上述公开的反应，利用天门冬氨酸，α-酮戊二酸和重氮盐测定血清中AST浓度的测定指示剂。该测定指示剂包括用一粘合剂使之彼此粘着的一对多孔条，上述粘合剂可选择地渗透草酰乙酸。其中第一层条包括底物L-天门冬氨酸和α-酮戊二酸。第二层条包括干燥的重氮盐。该指示剂与血清相接触，如果该血清中含有AST，它就可以催化底物反应，形成草酰乙酸。然后由此形成的所有草酰乙酸都渗到第二层条上，并使之与重氮盐的颜色反应致活。

由于酶催化反应的动力学性质，用于定量测定被分析酶的各种分析方法的精确度是有限的。这些分析方法一般是使含有未知量酶的样品与该酶的底物相接触，并测定在一定时间内由该反应所产生的产物量。产物量代表反应的平均速率，而该反应本身与样品中酶量相关。事实上，在经典分析条件下，采用反应平均速率测定酶量受到了限制，因为这些反应一般没有恒定的反应速率。在固定体积底物/辅因子溶液中进行的酶催化反应受到启动次数和影响反应速率的浓度效应的影响。一般来讲，酶催化反应的特征在于：在达到“稳定态”前采用低启动速率。在反应进行，消耗底物/辅因子组并使其浓度降低的同时，反应速率降低。当由于反应产物的蓄积而产生反馈抑制时，反应速率也应该降低。当采用改变反应条件或加入抑制剂终止被分析物催化反应时，反应终止可能不是完全瞬间，因此要将另外的测不准因素加入平均反应动力学的测定。因此，被分析物催化反应的真实稳定态反应动力学明显不同于在有限时间内评价所指示的平均反应速率。故以测定平均反应速率为基础测定酶浓度是相当不精确的，即稳定态反应动力学不同于平均反应速率。因此，理想的是建立一种能够评价某一给定反应的稳定态反应动力学，尤其是在任何时间的瞬时动力学的分析方法。

本发明涉及通过测定控制量底物/辅因子组中被分析物催化反应的速率来定量测定样品中被分析酶的方法。具体地讲，通过催化底物/辅因子组的反应可测得被分析酶，该方法包括下列步骤;（a）将存在于定量待分析样品中的被分析酶固定在层析介质上;（b）使该层析介质与含有底物/辅因子组反应的溶液相接触，至少形成一个反应产物的该反应由被分析酶以与固有酶量相关的速率催化之，（c）将该溶液输送至反应位点，并使底物/辅因子组在酶的存在下反应形成反应产物，（d）将该溶液和反应产物从反应位点输送至反应位点下游的检测区，（e）通过测定下列数据测定酶催化反应的速率，（ⅰ）底物/辅因子组的消耗速率或（ⅱ）反应产物的产生速率。反应产物的产生速率可由下述方法测得，即使产物经历一步或多步附加反应并测定（ⅰ）在所说附加反应中反应物的消耗速率或（ⅱ）在所说附加反应中产物的产生速率。通过在检测区的选择位点测定反应物或产物的浓度可以测得反应物消耗或产物产生的速率。本发明方法既可用于测定稳定态也可用于测定非稳定态酶反应动力学。本发明还提供了用于实施本发明方法的工具。

图1a和3a是两个不同类型的本发明试验装置的主视图;

图1b和3b分别为图1a和3a所示试验装置沿1b-1b和3b-3b线的剖视图;

图1c为图1a所示试验装置与一定体积底物/辅因子溶液接触的剖视图;

图2a-2d为实施本发明方法时，图1a所示装置在不同点即示的主视图;

图4是描述在本发明装置中丙氨酸转酶浓度和由于消耗MADH辅因子而引起的荧光减退之间的相关曲线图。

本发明提供了用于定量测定样品中酶的改进方法，其中通过酶催化底物/辅因子组的反应来测定酶。本发明方法避免了下述分析方法的限制，即通过在有限时间内测定被分析物催化反应的平均速率来测定被分析酶的浓度。本发明还避免了下述方法的限制，即为了得到有意义的结果，必须测定样品与分析试剂一起保温的时间。不是将含有被分析物的样品与给定体积含有底物/辅因子的溶液相接触（其中在酶催化的反应过程中反应物和产物的浓度改变），本发明将样品溶液中固有的酶固定在反应位点上，并连续地将含有新鲜底物/辅因子的溶液输送至该反应位点。另外，为了使处于反应位点的产物和反应物的浓度基本保持恒定，从反应位点沿层析介质的长度输送含反应产物和未反应底物/辅因子材料的溶液。以这种方式输送含未反应底物/辅因子组和反应产物的溶液使得沿该长度任一点所存在的反应产物和/或底物/辅因子组浓度可指示在某一特定时间的反应速率，而该反应速率是由成键酶的量，酶区的几何形状和溶液流速决定的。

相应于本发明的实施，提供了（最好以条状）层析介质。使定量的待分析样品与层析介质在反应位点相接触，并将样品中存在的所有酶都固定在反应位点。然后使该层析介质与层析流动溶液相接触，该层析流动溶液的PH和离子条件要经过选择，以适于该特定的反应系统，该系统包括底场/辅因子组，在被分析酶催化的反应中消耗所说底物/辅因子组产生反应产物。沿着层析介质将包括底物/辅因子组的溶液层析输送至反应位点，在此，在被分析酶催化的反应中消耗酶底物和辅因子，形成一个或多个反应产物。然后将这些反应产物与定量输送到反应位点的液体中未反应的底物/辅因子组成份一道，从反应位点沿层鼋橹适渌偷交虼┕觳馇钡绞渌屯Ｖ刮埂＜瓤稍谌芗链硬阄鼋橹实牡谝欢顺ナ保部梢栽诓阄鼋橹时ズ褪保ɡ纾蔽锪系酱锊阄鼋橹实牡诙耸保┲罩拐庖皇渌汀?

由于未反应溶液流入和反应溶液从反应位点流出是恒定的，因此，在反应位点底物、辅因子和反应产物的浓度基本上是恒定的。这样就可以基本上避免由于酶底物和辅因子浓度变化而带来的动力学效应造成的被分析物催化反应的反馈抑制作用。除启动效应引起的初始速率外，在反应位点的酶催化反应速率一般是十分恒定的。在适宜的底物/辅因子过量条件下，稳定态的反应速率与被分析酶浓度直接相关。从反应位点流出的溶液中，底物，辅因子和反应产物的浓度与在该反应位点酶催化反应的速率直接相关。因此，在反应位点下游沿层析路径的反应产物，酶底物，辅因子的浓度提供了在一定时间内在反应位点酶催化反应速率的年代记录。因此，本发明不仅可用于测定酶的未知浓度，也可更广泛地用于研究酶动力学。

因此，沿检测区，在控制反应条件下测定选自反应产物，酶底物和辅因子中某一成份的浓度都可以指示样品中被分析酶的浓度。为分析测定在底物和辅因子的稳定态反应期间所形成的产物浓度和所消耗的反应物浓度，一般应对下述三个区域作出选择;沿检测区的某一位点，整个区域本身或排除靠近第二端小区域的整个区域，所说小区域的产物及底物/辅因子浓度所反映出的是非稳定态反应动力学。除此之外，通过测定相应于这类反应动力学，沿检测区各位点所存在的产物量，可以分析该反应系统的启动或其他反应动力学。

通常被分析物催化反应产物不易被目视或分光光度法测得。在这种情况下，为了产生目视或分光光度法易测得的产物或消耗目视或分光光度法易测得的反应物，最好将一步或多步附加反应与被分析物催化反应相组合。可以将附加试剂掺入含底物/辅因子的溶液，这些试剂在组合反应中与被分析物催化反应的产物反应，消耗可测反应物或产生可测产物。组合反应是有次序的，第一反应中的一个或多个产物是第二反应中的反应物。一般用于进行一对组合反应的反应溶液应含有除第一反应的一个产物之外的用于第二反应的所有反应物。因此，当无被分析酶催化第一反应时，则不会消耗反应物或由第二反应产生的产物。理想的组合反应是：在含有底物/辅因子的溶液中存在的反应物在反应位点固有的条件下，可以容易地与一个或多个被分析物催化反应之产物完全反应。此外，组合的第二反应的速率也最好不是限速的。

如果组合的附加反应在被分析物催化反应产物存在下自发进行，则第二反应可以并且应该在反应位点或其稍下的地方发生。因此，在该反应位点下游可测得该反应产生的可测产物或该反应消耗的可测反应物的浓度。

但是，也有这样的系统，即在被分析物催化反应产物存在下，组合的附加反应不会自发进行。在这种情况下，为了使反应进行完全，必须催化该附加反应。为了利用这类组合反应系统，本发明提供了分析装置，其中将酶或催化剂固定在第二反应位点或者最好是第一反应位点下游，在第一反应位点下游固有被分析酶。与实施本发明的这一特点相适应，将含有底物/辅因子组和该附加反应中任何反应物的溶液输送到第一反应位点，在该位点被分析酶催化底物/辅因子组的反应，形成一个或多个反应产物。那些反应产物与未反应底物/辅因子组和用于该附加反应的反应物一道，或者在第一反应位点，或者在处于第一反应位点下游的第二反应位点，与用于该组合附加反应的催化剂相接触。然后该催化剂催化被分析物催化反应产物的反应，另外该反应消耗目视或分光光度法可测得的反应物或产生类似的可测得产物。最好对反应条件，试剂的量和性质加以选择，以便完全消耗掉被分析物催化反应的产物。

当被分析物催化反应产物的反应是定量并完全时，根据从第二反应位点下游输出的可测反应物或产物的量即可确定第一反应产物的量以及由此而确定被分析酶的浓度。由于组合的附加反应速率与被分析物催化反应的速率相对应，因此通过观察组合反应即可确定被分析物催化反应动力学并由此来确定被分析酶的浓度。

根据附图，图1a，1b，1c描述了用于定量测定样品中酶的单一反应位点实验装置（10），该装置包括连接在惰性支撑条（12）上的一定长度的层析介质（11）。层析介质（11）具有第一端（13）和第二端（14），层析输送在（13）开始，在（14）结束。层析介质（11）包括：以层析材料第一端（13）取向配置的反应位点（15），在反应位点（15）和层析材料第二端（14）之间配置的检测区（16）。无论对该图还是其他图都应注意到：靠近第二端（14）的断线表示具有这一特征的部分与反应位点（15）之间的延伸距离，这一距离可以满足远向反应位点（15）以上层析输送底物/辅因子材料和反应产物。

根据使用图1a，1b，1c所示装置（10）的方法，将欲分析酶含量的液体样品施于反应位点（15）。然后，使装置（10）在其第一端（13）与容器（17）〔装有含底物/辅因子组的溶液（18）〕内的成份相接触，被分析酶可催化该反应。然后含有底物/辅因子的溶液沿层析介质（11）的长度穿行到达反应位点（15），在此，被分析酶起催化底物/辅因子组反应的作用，形成一个或多个反应产物。将含有未反应底物/辅因子组和被分析物催化反应的任何产物的溶液从反应位点向层析介质的第二端（14）输送，到达并穿过检测区（16）。含有反应产物和底物/辅因子组的溶液层析输送延续至该溶液前沿到达第二端（14）或延续至定量溶液耗干为止。然后通过检测（ⅰ）底物/辅因子组或检测（ⅱ）反应产物的浓度来评价检测区。

图2a-2d是图1a所示装置的主视图。图2a描述已用定量含被分析物样品在反应位点（15）浸渍的装置（10）。该装置始终与含底物/辅因子组的溶液（18）相接触，并且在第一端（13）和反应位点（15）之间随溶剂前沿（19）不断从层析介质（11）的第一端（13）输送上述溶液。在图2b中，溶剂前沿（19）已穿过反应位点（15），并且反应位点（15）下游的溶剂含有定量的可测得反应产物，该产物是在底物/辅因子组的被分析物催化反应的启动期期间产生的。在图2c中，溶剂前沿（19）已向层析条的第二端推进。与此同时，在反应位点（15）发生的被分析物催化反应已经过启动期，依据产生较多的可检测反应产物这一事实，该反应正以稳定态速率进行。尽管从反应启动动力学向稳定态动力学的转化是一个逐步变化的过程，并且并不能在某一特定时间出现确切的变化，但根据（20）所示的稳定态反应前沿，仍可表示出在启动和稳定态反应动力学之间的这一界线。在图2d中，溶剂前沿（19）到达层析介质的第二端（14），并且且层析输送停止。在这一点，稳定态反应前沿（20）已越过检测区（16），因此，通过测定现存反应产物浓度可以评价被分析物催化反应的稳定态速率，由此评价现存被分析酶的量。

根据附图，图3a和3b描述了一个用于测定样品中被分析酶浓度的双反应位点试验装置（30），该装置包括与惰性固体支撑物（32）相连接的层析介质（31）。层析介质（31）具有第一端（33）和第二端（34）在（33）端开始层析输送，在（34）端结束层析输送。所说层析介质包括第一反应位点（35）和第二反应位点（36），在（35）位点接触含有能催化第一反应的被分析物样品并干燥之，催化剂被固定在（36）位点，该催化剂催化第二反应中一个或多个被分析物催化反应产物的反应。层析介质（31）还包括一个检测区（37），在该检测区检测第二反应位点（36）中的反应物或所产生的反应产物。

按照使用图3a，3b所示装置（30）的方法，将待分析酶含量的样品施于第一反应位点（35）。然后使该装置（30）与装有溶液（39）的容器（38）内的成份在该装置的第一端（33）相接触，溶液（39）含有底物/辅因子组，其反应由被分析酶催化，并且还包括与被分析物催化反应产物反应的试剂。然后该底物辅因子溶液沿层析介质（31）的长度穿过到达第一反应位点（35），在该位点被分析酶催化底物/辅因子组反应，形成反应产物。将含有未消耗底物/辅因子组，被分析物催化反应的任何反应产物和用于与被分析物催化反应产物反应的任何试剂的溶液从第一反应位点输送到第二反应位点（36）。然后，固定在第二反应位点（36）的催化剂催化分析物催化反应的第一产物的反应，产生一种或多种第二反应产物。然后，将第二反应产物与未反应底物/辅因子组和用于与被分析物催化反应产物反应的任何试剂一道，从第二反应位点（36）朝向层析介质第二端（34），抵达并穿过检测区（37）进行层析输送。连续层析输送该溶液直到溶液前沿到达第二端（34）为止，或者直到消耗完底物/辅因子溶液为止。评价检测区（37），以测定（ⅰ）第二反应产物的量或（ⅱ）第二反应的反应物量。

用于本发明的介质不仅包括层析介质，而且一般还包括用于输送本发明中所采用的各种试剂和反应产物的溶剂。所谓层析介质，按照严格的定义，是用来按照输送速度的差异进行材料分离的介质。适宜的层析介质包括对输送底物，辅因子和反应产物的溶剂具有毛细作用和容量的那些物质。用于本发明的层析介质最好是条形，但也可以根据对本领域普通工作人员显而易见的要求制成各种尺寸和形状。众多的各种层析材希纾河糜谥讲阄龅姆闹锖臀薹亩嗫撞牧希捎糜诒痉⒚鳌Ｌ乇鹩叛〉氖遣捎梦⒖谆蛭⒘１〔悴阄鑫镏剩蛭凑毡痉⒚鳎捎谜饫嗖牧峡梢愿纳品治鏊俣群头直媛省Ｆ渌室说慕橹拾ɑЦ男圆牧希纾聪喔咝П〔悴阄鼋橹驶蚧腔橹省Ｕ庋牟牧咸岣吡税凑招枰掷敕从ξ锖头从Σ锏哪芰ΑＮ⒖紫趸宋夭牧咸乇鸷茫詈檬遣捎肨ype    SSWP（Millipore    Corp.，Bedford，Massachusetts）孔径为3μm的微孔硝基纤维素材料。该材料最好是惰性的，一般不与任何底物，辅因子或反应产物发生化学或物理反应。

由于该装置的层析介质最好是化学惰性的，在任何反应位点它可能必须被活化，在该反应位点最好将被分析酶或催化剂固定，使其催化组合的第二反应而又抗溶剂输送。需要采用各种方法按照试剂具体的化学性质将试剂固定。一般来讲，当介质是硝基纤维素或混合型硝基纤维素酯时，为固定酶不需要采用特殊的化学键合。将含有被分析酶的样品施于层析介质。并于室温下10至15分钟后即可干燥。将存在于样品中的酶固定在反应位点以抗溶剂输送，一般应保留足够的或主要的酶活性。如果该分析利用一对组合反应，并且要催化第二反应，必须将用于组合的第二反应的催化剂固定在第二反应位点。用于组合的第二反应的催化剂最好是酶，这样就可以采用在第一反应位点固定被分析酶的相同方法固定该催化剂。

值得考虑的是：可利用本发明普遍地定量检测酶。被认为本发明特别适用于分析的酶包括：丙氨酸转氨酶（ALT），天门冬氨酸转氨酶（AST），乳酸脱氢酶（LDH），磷酸酶，醛缩酶，碱性磷酸酶，α-萘基丁酸酯酶，α-1胰蛋白酶，淀粉酶，血管紧张肽转化酶，血浆铜兰蛋白，氯乙酸酯酶，肌酸激酶，胆碱酯酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，γ-谷氨酰转移酶，血红蛋白（作为氧化酶），脂酶，溶菌酶，2′，5′腺苷酸磷酸二酯酶，2′，5′-腺苷酸合成酶，5′-核苷酸酶，血管紧张素肽原酶，胰蛋白酶和许多其他的酶。按照本发明可以被分析的酶仅局限于所选择的酶不能被固定在适宜的层析介质上，或者一旦被固定则基本上完全失去其酶活性。当将某些酶固定在第一反应位点时，它们可能在一定程度上失活，这一点并不妨碍本发明的应用，因为本领域普通工作人员有能力在评价分析结果时，对该失活作出计算。可以按照本发明方法分析的含酶样品包括各种生物学材料，其包括但不限于血液，血清，血浆，尿，唾液，大便，眼泪，喉头取样（throat    swabs），伤口渗出液，汗，细胞，细胞溶胞产物，细胞上清液，细菌和细菌媒介。

根据被分析酶的特殊性质选择对被分析酶反应敏感，并适用于本发明的各种底物/辅因子组试剂。这类反应系统一般对本领域来讲是公知的，并且按照本发明方法易于施用。一般来说，按照本发明可以利用适用于惯用试管或浸渍条方法的单一和组合酶反应系统。适宜的系统包括：在该系统中用于酶催化反应的底物或用于该反应的辅因子经反应得到目视或分光光度法可测得的反应产物，例如：染料。另外，酶底物或被分析物催化反应的辅因子本身可以是目视或分光光度法可测的（例如，辅因子NADH），但是，在该酶催化反应过程中要消耗该酶底物或辅因子。

按照本发明的某些实施例，如果用于酶催化反应的底物/辅因子组试剂或该反应的产物均不是目视或分光光度法易测得的，那么可以给该被分析物催化反应增加第二反应，该第二反应或者消耗易测得反应物，或者产生这样的产物。本文引为参照文献的1985年8月6日出版的美国专利4，533，629（Litman等）公开了许多用于在酶标记免疫分析中产生信号的酶的组合反应系统。这类组合反应系统经常利用水解或氧化-还原反应来活化染料前体。根据某些方法，将底物氧化产生过氧化氢，后者然后与染料前体反应使可测得染料致活。含有底物/辅因子组的溶液可以与其他试剂（例如，稳定剂，抑制剂等）混合。当给被分析物催化反应与第二反应组合时，含有底物/辅因子组的溶液也可以含有用于与被分析物催化反应产物反应的试剂。该试剂本身可以是可测的，并且在组合的第二反应中能够被消耗或者可以与被分析物催化反应的产物反应，产生可测得反应产物。

实施例1

按照本实施例，制作用于定量测定乳酸脱氢酶（LDH）的装置，并且按本发明所述方法使用之。将厚度接近0.15mm，孔径为3μm的微孔硝基纤维素材料（Millipore    SSWP）在薄膜干燥装置中于60至65℃复盖在聚酯薄膜和粘合剂（Mono-kote，Top    Flite    Models，Inc.，Chicago，IL）上。将膜和衬垫物切成长8.5cm，宽0.3cm的长条。

按照使用上述制成装置的方法，制备LDH（Sigma，Chemi-cal    Co.，St.Louis，No）的各种稀释液的溶液，在该溶液中包括0.8mg/ml小牛血清清蛋白。兹以2μl为整份的LDH溶液在距第一端1cm处的反应位点浸渍在层析条上。然后将该条的第一端浸在含有下述成份的溶液中;0.1M的磷酸缓冲液，PH7.8，丙酮酸盐，0.2mM还原型β-尼古丁腺嘌呤二核苷酸（NADH）和1mM丙酮酸钠。将该缓冲液源源不断地沿着该条层析输送直到它到达反应位点为止，事先已将LDH样品固定在该反应位点。在此，LDH催化丙酮酸与NADH和质子的反应，形成乳酸和尼古丁腺嘌呤二核苷酸的氧化型（NAD）。将这些反应产物与溶液中的其他成份一道，从反应位点下游沿层析条层析输送，直到溶液到达条的末端为止，并停止溶液输送。根据在紫外（375nm）灯下观察反应位点下游荧光消失，目视观察结果。

实施例2

按照本实施例，制作用于定量测定酶ALT的双反应位点装置，并按本发明所述方法使用之。在薄膜干燥装置中，于60至65℃，将厚度接近0.15mm，孔径为3μm的微孔硝基纤维素材料（Millipore    SSWP）复盖在聚酯薄膜和粘合剂（Monokote，Top    Flite    Models，Inc.，Chicago，IL）上。将膜和衬垫物切成0.3cm宽，8.5cm长的条。将2μl整分份的乳酸脱氢酶（LDH）（Sigma    Chemical    Co.，St.Louis，Mo）固定在距每条第一端2cm处的第二反应位点上。

按照使用上述制作装置的方法，配制ALT的各种稀释液的溶液，在该溶液中含有0.8mg/ml小牛血清清蛋白（BSA）。然后通过临床化学试剂法（A-gent，Abbot    Labora-tories，North    Chicago，IL）分析该溶液的酶活性。将2μl含ALT的溶液浸渍到第一反应位点，该反应位点位于LDH浸过的位点和第一端之间，离第一端1cm处。使酶样品在反应位点干燥10至15分钟。

将各条的第一端浸于含下述成份的溶剂溶液中：500mML-丙氨酸，0.3mM还原型β-尼古丁腺嘌呤二核苷酸（NADH），15mMα-酮戊二酸，0.1mM吡哆醛-5-磷酸酯，100mM三（羟甲基）-氨基甲烷，30.3mM琥珀酸和2.26mM乙二胺四乙酸钠（EDTA）。沿该条层析输送该溶剂直到它到达第一反应位点为止，事先已将ALT样品固定在该第一反应位点。在此ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸的反应，形成丙酮酸和L-谷氨酸。然后在溶剂不断推进的同时，将这些反应产物与未反应酶底物，辅因子和流动缓冲液中其他成份一道，从第一反应区层析输送至第二反应区，在第一反应区事先已固定了ALT样品，在第二反应区事先已固定了LDH。当溶剂中的丙酮酸和其他成份接触到固定在第二反应区的LDH时，LDH催化丙酮酸与NADH和质子的反应，形成乳酸和氧化态尼古丁腺嘌呤二检苷酸（NAD⁺）。然后将第二反应的这些产物沿层析介质输送3至4cm，直到层析输送停止为止。通过在紫外（375nm）灯下观察LDH反应位点下游的荧光消失，目视跟踪NADH至NAD⁺的氧化。前沿前的流体不呈现荧光，而相应于启动动力学的前沿流体出现一荧光峰，该峰降至一恒定水平（相应于稳定态动力学），然后该水平延续至第二反应位点。

尽管目视可以观察到该荧光，但也可以用薄层层析扫描器例如（CAMAG    Scamner    п，CAMAG，Muttenz，Switzerland）分光光度观察到。该扫描器采用365nm的激发波长，并采用过滤除去低于420nm的波长来检测。

根据前文描述，本领域普通的工作人员应该认识到本发明的许多变化和改进，使之更适于应用。因此，正如下文权利要求所述，对本发明化有这些限制。

Claims (10)

1、一种定量测定样品中被分析酶的方法，其中通过酶催化底物/辅因子组的反应可以测定该酶的存在，该方法包括下列步骤：

(a)将存在于定量待分析样品中的被分析酶固定在层析介质上的某一反应位点，

(b)使所说层析介质与包括底物/辅因子组的溶液相接触，该反应辽傩纬梢桓龇从Σ锊⒂伤当环治雒复呋浞从λ俾视胨嬖诿傅牧肯喙兀?

(c)将所说溶液输送到所说反应位点并使所说底物/辅因子组在所说酶存在下反应，形成所说反应产物，

(d)将所说溶液和所说反应产物从所说反应位点输送至所说反应位点下游的检测区，和

(e)通过测定(i)底物/辅因子组的消耗速率或(ii)所说反应产物的产生速率来确定该酶催化反应的速率。

2、权利要求1所述方法，其中通过使反应产物经历一步或多步附加反应并且通过测定（ⅰ）在一步或多步所说附加反应中反应物的消耗速率或（ⅱ）在一步或多步所说附加反应中产物的产生速率来确定所说反应产物的产生速率。

3、权利要求1或2所述方法，其中通过测定检测区中某一选择位点上所说成份的浓度，由此来确定选自下列成份之一的消耗或产生速率，这些成份包括：（1）底物/辅因子组;（2）所说第一反应产物;（3）至少一步所说附加反应或多步附加反应中的某一反应物或（4）至少一步所说附加反应或多步附加反应中的某一产物。

4、权利要求3所述方法，其中检测区中的选择位点含有选择自下列成份之一，这些成份包括：（1）底物/辅因子组;（2）所说第一反应产物;（3）至少一步所说附加反应或多步附加反应中的某一反应物和（4）至少一步所说附加反应或多步附加反应中的某一产物，在被分析酶的稳定态反应期间产生上述产物。

5、权利要求2所述方法，其中通过催化剂固定在第二反应位点来催化所说一步附加反应或多步附加反应。

6、权利要求5所述方法，其中所说催化剂是一种酶。

7、权利要求3所述方法，其中通过目视或分光光度计测定选自下列成份之一的浓度，这些成份包括：（1）底物/辅因子组;（2）所说第一反应产物;（3）至少一步所说附加反应或多步附加反应的某一反应物和（4）至少一步所说附加反应或多步附加反应的某一产物。

8、权利要求7所述方法，其中用目视法测定所说浓度。

9、一种用于定量测定样品中被分析酶的工具，其中通过催化底物/辅因子组成份的反应可以测定所说酶，该工具包括：

（a）一种层析介质，该介质包括一个反应位点，可以将存在于所说样品中的被分析酶固定在该位点上;和

（b）一种定量的溶液，该溶液包括由所说酶催化的底物/辅因子组反应成份。

10、权利要求9所述工具，其中所说层析介质包括一个第二反应位点，催化剂固定在该位点并能催化消耗所说被分析酶催化反应产物的第二反应。

Images