CN1786694A - 二氧化碳含量测定方法及二氧化碳诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及二氧化碳含量的测定方法及其诊断试剂盒。发明直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和丙酮酸经苹果酸脱氢酶脱羧作用后产生苹果酸，并将还原型辅酶氧化为氧化型辅酶，测定主波长340nm吸光度下降速度便能定量反映样品中二氧化碳含量，进而推知碳酸氢根浓度。该方法特异性高，不受内、外源污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用。

Description

二氧化碳含量测定方法及二氧化碳诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及酶法测定二氧化碳含量的方法，以及应用该方法配制而成的二氧化碳诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术
血液PH值恒定是维持生命活动必不可少的条件。血浆中有多种缓冲系统，以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的PH值。正如大家所熟知，碳酸氢根HCO3′ -与二氧化碳CO2之间有比较强烈的对应平衡关系，因此，血液中CO2含量对人体内部酸碱平衡调节起着重要作用。血液中CO2含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱：单纯性代谢性酸或碱中毒是血液中HCO3 -的浓度下降或升高，总CO2含量也随之下降或升高；单纯性呼吸性酸或碱中毒与上述情形正好相反。
现有技术中，总二氧化碳或碳酸氢根的测定方法较多，可分为直接测定和间接推算两大类。直接测定主要有：量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法、酶法等；间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PCO2，根据以下H-H方程变换形式计算获得。
HCO3 -(mmol/l)＝0.03×PCO2(mmHg)×antilog(PH-p ka)或
HCO3 -(mmol/l)＝0.225×PCO2(kPa)×antilog(PH-p Ka)
式中PH为37℃时测得值，p ka在37℃为6.10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性可以符合临床要求。直接法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。
近年来，酶法检测技术得到长足发展。该方法以其特异性高、稳定性好、检测速度快、结果准确可靠等优点而受到普遍欢迎。与检测其它物质类似，酶法检测血清、血浆等各种样品中二氧化碳含量的技术，已经成为人们研究的一个方向。
发明内容
本发明的目的是：提供一种酶法测定二氧化碳含量的方法，以及应用该方法配制而成的二氧化碳诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪进行二氧化碳含量测定，而且测定速度快、准确度高，为丰富和发展二氧化碳检测手段提供技术支撑，以期在临床和分析测试领域推广酶法测定二氧化碳含量技术。
为实现本发明的第一个目的，一种测定二氧化碳含量的方法，采用以下步骤进行：
首先，将需要测定的样品与含有丙酮酸、苹果酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，进而测算出样品中二氧化碳的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
为实现本发明第二个目的——二氧化碳含量诊断试剂盒，可以按以下成分和用量配制成单剂：
     缓冲液                  40～200mmol/l，
     丙酮酸                  1～50mmol/l，
     还原型辅酶              0.15～0.3mmol/l，
     苹果酸脱氢酶            500～50000U/l，
     稳定剂/试剂总体积      10～80％。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源污染，比如：
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I中的丙酮酸和还原型辅酶可以放在试剂II；试剂II中的苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源污染，还有利于试剂更稳定：
  III   稳定剂/试剂III总体积   10～80％
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的丙酮酸可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
本发明测定二氧化碳含量的诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是：“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是：乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
上述诊断试剂盒的成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案：
     缓冲液                 80～120mmol/l，
     丙酮酸                 5～20mmol/l，
     还原型辅酶             0.2～0.3mmol/l，
     苹果酸脱氢酶           6000～12000U/l，
     稳定剂/试剂总体积      20～50％。
本发明直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和丙酮酸经苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.38或EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40或EC 1.1.1.83之一)脱羧作用后产生苹果酸，并将还原型辅酶氧化为氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中二氧化碳的含量成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的下降速度，便能很好地反映出样品中二氧化碳的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在：
(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，定量反映出被测样品中二氧化碳的含量，测试结果准确；
(2)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；
(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；
(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用；
(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中二氧化碳的含量；
(6)本发明提供的液态二氧化碳含量诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各成分的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)
按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒：
     双甘氨肽缓冲液           80mmol/l，
     丙酮酸                   5mmol/l，
     thio-NADH                0.2mmol/l，
     苹果酸脱氢酶             6000U/l，
     乙二醇                   50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)。
加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)
按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒：
试剂I——
     咪唑～盐酸缓冲液         100mmol/l，
     丙酮酸                   13mmol/l，
     NADPH                    0.25mmol/l，
     甘油                     20mmol/l；
试剂II——
     咪唑～盐酸缓冲液         100mmol/l，
     苹果酸脱氢酶             9000U/l，
     乙二醇                   50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)
按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒：
试剂I——
     三乙醇胺缓冲液           120mmol/l，
     thio-NADPH               0.3mmol/l，
     丙二醇                   20mmol/l；
试剂II——
     三乙醇胺缓冲液           120mmol/l，
     丙酮酸                   20mmol/l，
     丙二醇                   20mmol/l；
试剂III——
     三乙醇胺缓冲液           120mmol/l，
     苹果酸脱氢酶             12000U/l，
     乙二醇                   50％(占试剂III总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例四(双剂优选例)
按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒：
试剂I——
     Tris-HCl缓冲液         100mmol/l，
     NADH                     0.3mmol/l，
     甘油                     20mmol/l；
试剂II——
     Tris-HCl缓冲液         100mmol/l，
     丙酮酸                 20mmol/l，
     苹果酸脱氢酶           6000U/l，
     甘油                   50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定：温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应：
检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出样品中二氧化碳含量，进而推知碳酸氢根浓度，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的二氧化碳诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍能准确检测各种类型样品中的二氧化碳含量。

Claims (9)

1.一种测定二氧化碳含量的方法，包括以下步骤：
①将待测样品与含有丙酮酸、苹果酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出样品中二氧化碳的含量。
2.根据权利要求1所述的测定二氧化碳含量的方法，其特征在于：待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的测定二氧化碳含量的方法，其特征在于：反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
4.一种二氧化碳诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成：
缓冲液                      40～200mmol/l，
丙酮酸                      1～50mmol/l，
还原型辅酶                  0.15～0.3mmol/l，
苹果酸脱氢酶                500～50000U/l，
稳定剂/试剂总体积           10～80％。
5.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于：所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于：所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于：所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
9.根据权利要求4～8所述的任意一种二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
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