CN106290212A - 一种灵敏度高的丙酮酸检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血丙酮酸检测技术领域，特别涉及一种经过优化后灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1中主要的组成成分为：缓冲液、NADPH、保护剂、表面活性剂、氯化锂、金属螯合剂、叠氮钠；试剂R2中主要包含缓冲液、保护剂、乳酸脱氢酶、叠氮钠等组成成分，成色物质的更换和优质表面活性剂的组合使试剂的分析灵敏度大大提高，从而使临床中应用检测丙酮酸，更加准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种灵敏度高的丙酮酸检测试剂，属于临床体外检测技术领域。
背景技术
丙酮酸是糖酵解途径产物，在正常情况下通过三羧酸循环氧化成CO2和水，使血内乳酸/丙酮酸比值维持在9左右，当机体处于缺氧状态，丙酮酸则被还原成乳酸，该比值上升，缺氧越严重比值越高；该比值测定可推测循环衰竭的严重程度；轻微的活动会引起乳酸和丙酮酸同时升高，但比值不变。血液丙酮酸的测定主要用于维生素B1缺乏症的诊断，维生素B1的焦磷酸酯是丙酮酸在细胞内进一步氧化分解为乙酰辅酶A时的脱羧辅酶；维生素B1缺乏时，体内丙酮酸的氧化发生障碍，使丙酮酸的含量增加。血中丙酮酸增高还见于糖尿病、心力衰竭、腹泻，严重肝损伤、急性感染等病症中。
目前监测丙酮酸的方法比较多，有液相分析法、二硝基苯腙法、化学发光法、酶法，其中二硝基苯腙法出现的较早，但是为手工操作，且特异性较差，使用较少，而液相和化学发光有较好的准确性和灵敏度，但是成本较高，随着对丙酮酸检测方法的不断推进和全自动生化分仪的普及，酶法检测血丙酮酸的研究越来越多，酶法检测丙酮酸有两种方法一种是基于过氧化物酶TRINDER反应，而另一种是基于丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下NADH被氧化成NAD，前者反应较为复杂，且由于TRINDER反应本身固有的抗干扰问题一直非常突出，使用往往受到样本的限制，后者反应简单，特异性强，一直受到人们的青睐，但是由于人体中丙酮酸的含量一般非常的少，在使用时由于分析灵敏度不够容易导致结果不准确，因此根据这个问题，发明了一种分析灵敏度高的酶法检测丙酮酸检测试剂。
发明内容
本发明涉及一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，以及检测方法。
检测原理：
在乳酸脱氢酶（LDH）的存在下，NADPH与丙酮酸反应，NADPH被氧化成NADP，在波长340nm处吸光度的降低与丙酮酸的含量成正比。
见图1。
一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂试剂组成成分如下：
本发明是通过以下步骤得到的：
试剂 R1：
缓冲液 10mmol/L
NADPH 2mmol/L-5mmol/L
保护剂 1g/L-3g/L
表面活性剂 1 2ml/L-5ml/L
表面活性剂 2 0.5ml/L-0.75ml/L
氯化锂 0.1g/L-0.5g/L
金属螯合剂 1mmol/L-5mmol/L
叠氮钠 0.1g/L-1g/L
试剂 R2：
缓冲液 100mmol/L
保护剂 5g/L-10g/L
乳酸脱氢酶 2KU/L-5KU/L
叠氮钠 0.1g/L-1g/L。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1中缓冲液为25℃，PH=9.5的浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R2中缓冲液为25℃，PH=6.5的浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲液。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1中所述保护剂为壳聚糖。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1所述表面活性剂1为Surfynol 485(上海西宝生物)。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1所述表面活性剂2为ZonylFSN 100(上海西宝生物)。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1所述金属螯合剂为二羟乙基甘氨酸(DEG)。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R2所述保护剂为海藻糖。
所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340nm。
所述的试剂为液态双试剂，试剂比例为3:1。
本发明的创新之处如下：
1）本发明为双试剂，本发明优先选择更加灵敏的NADPH作为底物替代原有的NADH，大大提高了反应的效率，提高反应的灵敏度；
2）在试剂1中选择添加了A和B两种表面活性剂，两种表面活性剂的同时加入能够提高反应液体在340波长下颜色的变化的明显程度，且能够使体系中的颜色在完成变化后保持颜色的稳定性；
3）在试剂1中优先选择了二羟乙基甘氨酸(DEG)，作为重金属离子的螯合剂，能够有效的防止重金属离子对NADPH的干扰，且添加了壳聚糖来保护NADPH的稳定性。
附图说明
图1是丙酮酸反应原理图；
图2是12个不同低浓度梯度的丙酮酸四种方法检测结果对比情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明
实施例1
本实施例描述的是一种现有的丙酮酸检测试剂的配方：
试剂1（R1）:
磷酸盐缓冲液 100mmol/L，PH=8.0；
NADH 2.5mmol/L；
叠氮钠 0.5g/L；
试剂 R2：
磷酸盐缓冲液 100mmol/L，PH=7.0；
乳酸脱氢酶 2KU/L；
叠氮钠 0.5g/L；
实施例2
本实施例描述的是一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂的配方：
试剂 R1：
TRIS 10mmol/L；
NADPH 2mmol/L；
壳聚糖 1g/L；
Surfynol 485 2ml/L；
Zonyl FSN 100 0.5ml/L；
氯化锂 0.1g/L；；
二羟乙基甘氨酸(DEG) 1mmol/L；
叠氮钠 0.1g/L；
试剂 R2：
磷酸盐缓冲液 100mmol/L；
海藻糖 5g/L；
乳酸脱氢酶 2KU/L；
叠氮钠 0.1g/L；
实施例3
本实施例所描述的是一种关键原材料增加后的灵敏度高的丙酮酸检测试剂的配方；
试剂 R1：
TRIS 10mmol/L；
NADPH 5mmol/L；
壳聚糖 3g/L；
Surfynol 485 5ml/L；
Zonyl FSN 100 0.75ml/L；
氯化锂 0.5g/L；
二羟乙基甘氨酸(DEG) 5mmol/L；
叠氮钠 1g/L；
试剂 R2：
磷酸盐缓冲液 100mmol/L；
海藻糖 10g/L；
乳酸脱氢酶 5KU/L；
叠氮钠 1g/L。
本实施例描述的是一种关键原材料增加后的灵敏度高的丙酮酸检测试剂的灵敏度的验证方法，将本实施例的配方、实施例1中的配方、实施例2的配方和化学发光法进行同步检测，对比检测结果。
试验的具体操作方法：选取12个已知不同浓度的丙酮酸样本，然后将十二个不同的样本分别使用本实施例的配方、实施例1中的配方、实施例2的配方和化学发光法，其中实施例1、实施例2和本实施例的试剂借助全自动生化分析仪器，化学发光法借助化学发光仪对不同浓度的同一丙酮酸样本进行检测，检测结果如图2。
统计结果显示：实施例1中检测结果在低值部分很难检测出结果多出现0值，甚至出现负值，由此可见试剂的分析灵敏度不够，而实施例2和本实施例中检测结果与灵敏度较高的化学发光法相比较，检测结果相关性较好，与理论浓度偏差较小，并且在非常低的浓度下也能够检测出，说明发明具有较高的灵敏度。
Claims (10)
1.本发明描述的是一种经过优化后灵敏度高的丙酮酸检测试剂，其组成成分如下：
试剂 R1：
缓冲液 10mmol/L；
NADPH 2mmol/L-5mmol/L；
保护剂 1g/L-3g/L；
表面活性剂 1 2ml/L-5ml/L；
表面活性剂 2 0.5ml/L-0.75ml/L；
氯化锂 0.1g/L-0.5g/L；
金属螯合剂 1mmol/L-5mmol/L；
叠氮钠 0.1g/L-1g/L；
试剂 R2：
缓冲液 100mmol/L；
保护剂 5g/L-10g/L；
乳酸脱氢酶 2KU/L-5KU/L；
叠氮钠 0.1g/L-1g/L。
2.所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1中所述保护剂为壳聚糖。
3.所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1所述表面活性剂1为Surfynol485。
4.所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R1所述表面活性剂2为Zonyl FSN100。
5.所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，试剂R2所述保护剂为海藻糖。
6.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，其特征在于试剂R1中加入了表面活性剂1和表面活性剂2，两者结合使用对试剂的灵敏度有较高的提高。
7.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，其特征在于试剂R1中使用了NADPH替换原有的NADH。
8.根据权利要求1所述的一种分析灵敏度高的丙酮酸检测试剂，其特征在于所述重金属螯合剂为二羟乙基甘氨酸(DEG)。
9.一种使用权利要求1-4中任一项所述的丙酮酸检测试剂来检测血丙酮酸的方法，其特征在于使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340nm。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
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