CN107703071A - 一种检测1,5‑ag的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，公开了一种检测1,5‑AG的试剂盒及方法。本发明所述试剂盒通过选择适宜的试剂R1和试剂R2，采用HK+G6PD法+乳酸脱氢酶法有效地消除了1,5‑AG样品中的内源性葡萄糖，然后利用氧化酶‑紫外分光光度法检测人体血清中1,5‑AG的含量。试验结果表明，本发明提供的试剂盒能够有效消除1～20mM内源性葡萄糖的干扰，相比现有技术的检测试剂盒，应用范围更广，检测结果准确度高、精密度好、线性范围宽，可广泛用于于各级医院、卫生预防部门和医学生物科研单位测定血清中1,5‑AG含量。

Description

一种检测1,5-AG的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种检测1,5-AG的试剂盒及方法。
背景技术
干扰物是临床检测结果误差的主要来源。这种误差对病人的诊断非常不利，有时会导致非常严重的后果。
糖尿病是危害人类健康的以高血糖为特征的重要代谢性疾病，及时准确地测定和监测血糖可反映患者的代谢状况，为治疗提供依据。目前，糖尿病的诊断包括空腹血糖(FBG)、口服葡萄糖耐量实验(OGTT)、糖化血红蛋白(HbA1C)和果糖胺(FA)测定。FBG和OGTT实验均受饮食、药物、活动及体内代谢变化的影响；HbA1C和FA测试用于糖尿病的筛选灵敏度不够，主要用于中、长期血糖控制的监测，且HbA1C与年龄有关，尿毒症和甲亢病人可增高，FA受尿毒症、严重蛋白尿、血清蛋白异常的影响。
1,5-脱水-D-山梨醇又称1,5-脱水-葡萄糖醇(1,5-AG)，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖。人体血清中的1,5-AG与血糖浓度明显成负相关性，血液中1,5-AG的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关，是血糖监测的一项重要指标其血清水平稳定，波动幅度小，无昼夜间差异，不受葡萄糖摄取量影响，与体重、性别、年龄及糖尿病病程长短无关，可以反映近几天至1周的平均血糖水平，具有特殊的临床意义。
目前，测定1,5-AG的方法主要有氧化酶法和脱氢酶法，检测原理如下：
氧化酶法：
脱氢酶法：
NADPH+显色剂→有色物质+NADP
上述两种方法均采用紫外分光光度法检测1,5-AG，然而采用这种方法进行检测时，人体本身血清中的葡萄糖，即内源性葡萄糖的存在会严重干扰检测结果的准确性，因此，采用紫外分光光度法检测1,5-AG需要消除内源性的葡萄糖干扰。
目前，消除内源性葡萄糖的方法有三种：
1)GOD法
2)HK结合G6PD法
3)HK结合PK法
其中，采用GOD法分别对含有0、1、5、15、30mM葡萄糖的1,5-AG(200μM)待测样本前处理后再进行1,5-AG的检测，待测样本经一系列反应最终呈现不同颜色，其中，0mM的样本显浅红色，1～30mM的样本从浅紫色颜色逐渐加深。根据颜色变化可判断出检测过程中受内源性葡萄糖的影响较大，无法消除内源性葡萄糖干扰，因而1,5-AG的检测无法继续开展。
同样地，HK结合G6PD法分别对含有0、1、5、15、30mM葡萄糖的1,5-AG(200μM)待测样本处理后再进行1,5-AG的检测，待测样本经一系列反应最终也呈现不同的颜色，只有不含葡萄糖的样本显浅红色，其他均无色其中，含30mM葡萄糖的样品在加入样品的瞬间显浅紫色，反应5min后褪色。因此，采用该方法也无法有效消除内源性葡萄糖的干扰。
HK结合PK法能够消除1,5-AG待测样本中低浓度的内源性葡萄糖(1～15mM)的干扰，但无法消除高浓度葡萄糖的干扰，且实际样品中有其他干扰物质在该波长下有紫外吸收。
以上三种方法均存在局限性，GOD法和、HK结合G6PD法无法消除内源性葡萄糖的干扰，HK结合PK法仅能消除1～15mM内源性葡萄糖的干扰，无法消除更高浓度的内源性葡萄糖的干扰。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测1,5-AG的试剂盒及方法，使得所述试剂盒能够更有效地降低内源性葡萄糖对1,5-AG检测的干扰，应用范围更广。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测1,5-AG的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
其中，所述试剂R1包括己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、ATP、NADP、MgCl2、丙酮酸、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶、MES缓冲液、保护剂和防腐剂；
所述试剂R2包括吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替吡啉、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺、HEPES缓冲液和防腐剂。
本发明通过选择试剂R1，采用HK+G6PD法+乳酸脱氢酶法有效地消除了1,5-AG样品中的内源性葡萄糖，可以有效消除1～20mM内源性葡萄糖的干扰，应用范围更广，基本反应方程式如下：
优选地，本发明所述试剂盒中，试剂R1中各组分含量为：
所述试剂R2中各组分含量为：
更优选地，所述试剂R1中各组分含量为：
所述试剂R2中各组分含量为：
优选地，试剂R1中，所述保护剂为抗坏血酸氧化酶。
抗坏血酸氧化酶是一种氧化还原酶，主要是通过催化抗坏血酸酸与氧作用生成脱氢抗坏血酸，用来去除人体内抗坏血酸(或抗坏血酸盐)对检测的影响，保护检测体系的稳定性。
防腐剂是一类能够杀灭或抑制微生物生长的化学物质，在液体试剂中发挥着重要的防腐作用。作为优选，本发明试剂盒中，试剂R1和试剂R2中防腐剂的浓度均为0.05％～0.2％(质量百分比)，防腐剂的种类为本领域技术人员熟知的防腐剂即可，无特殊的限制，可选自NaN3、硫柳汞、庆大霉素、Proclin系列，本发明优选为NaN3。
本发明还提供了一种采用上述试剂盒检测1,5-AG的方法，包括如下步骤：
依次加入试剂R1、待测样品，37℃孵育4～8min，然后加入试剂R2，混匀，37℃反应4～8min，在555nm波长下检测吸光度，对照标准曲线计算待测样品中1,5-AG的浓度。
作为优选，建立标准曲线采用的1,5-AG校准品溶液的浓度为0～500.6μM。
在本发明提供的一些具体实施例中，1,5-AG校准品溶液的浓度为0μM、25.4μM、40.4μM、152.3μM、247.9μM、500.6μM。
本发明通过选择适宜的试剂R1和试剂R2，采用HK+G6PD法+乳酸脱氢酶法有效地消除了1,5-AG样品中的内源性葡萄糖，在此基础上，利用氧化酶-紫外分光光度法检测人体血清中1,5-AG的含量，试验结果表明，本发明提供的试剂盒能够有效消除1～20mM内源性葡萄糖的干扰，解决了现有技术检测1,5-AG时受内源性葡萄糖干扰的瓶颈，应用范围更广，且检测结果准确度高、精密度好、线性范围宽。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测1,5-AG的试剂盒及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种检测1,5-AG的试剂盒及方法进行详细说明。
实施例1～3本发明所述试剂盒
按照表1制备检测试剂盒：
表1
其中，MES缓冲液的pH值为5.9，HEPES缓冲液的pH值为7.2。
对比例1
现有技术公开的采用HK+PK法消除葡萄糖干扰的检测试剂盒，试剂R1组成：4KU/L葡萄糖激酶、3KU/L丙酮酸激酶、1mM ATP、4mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.5mM 4-氨基安替吡啉、7.5mM MgCl2、50mM KCl、5KU/L抗坏血酸氧化酶、50mM MES缓冲液；
R2组成：100KU/L吡喃糖氧化酶、10KU/L辣根过氧化物酶、4.5mM羟基甲苯磺酰碘苯、200mM HEPES缓冲液。
实施例4本发明所述试剂盒对内源性葡萄糖的抗干扰试验
采用类似人血清基质的溶液：NaCl 0.8％，BSA0.2％，NaN3 0.4％，Tris-HClpH8.0，制备含有5、10、15、20、25、30mM GLU的1,5-AG样本，以不含葡萄糖的样本作为对照，其中1,5-AG的浓度均为200μM。向离心管中分别加入上述方案实施例1～3和对比例1试剂盒中的试剂R1，然后加入10μL待测样本，37℃水浴锅中反应5min；再加入对应的试剂R2 75μL，混匀，37℃水浴中反应5min，在555nm波长下检测吸光度。结果如表2所示
表2
从表2可以看出，相比现有技术公开的采用HK+PK法，本发明实施例1～3提供的试剂盒能够有效地消除0～20mM内源性葡萄糖的干扰，显著地改善了存在内源性葡萄糖情况下的准确性，适用范围更广。
实施例5本发明试剂盒的性能评估：
将1,5-AG溶于类似人血清基质的溶液(NaCl 0.8％，BSA0.2％，NaN3 0.4％，Tris-HCl pH8.0)中制成不同浓度的校准品，采用九强1,5-AG检测试剂盒(批号：15-1218)及配套标准品浓度对不同浓度的校准品进行定值，得到1,5-AG的原校准品的浓度为25.4μM、40.4μM、152.3μM、247.9μM、500.6μM，并配置0μM的溶液，共配成6个浓度的溶液。其中，葡萄糖浓度为10mM。
向离心管中分别加入实施例1试剂盒中的试剂R1，加入不同浓度的校准品溶液10μL，混匀，37℃孵育5min，加入75μL试剂R2，混匀，37℃反应5min，在555nm波长下检测吸光度每管重复3次，以三次吸光值的平均值为横坐标，对应的校准品的浓度为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为：y＝2565.4x-235.46。
取待测血清样本，同法测定样本的吸光值，代入上述标准曲线，计算得到1,5-AG的浓度。以实施例1制备的试剂盒为例对线性范围、准确度、灵敏度、精密度、抗干扰性、相关性和稳定性等相关性能进行验证。其中，检测过程中采用的样品中葡萄糖浓度为10mM。
(1)线性范围检测
取高1,5-AG的血清样品(浓度为500μM)，按照1、7/10、5/10、3/10、1/10、1/20稀释成6个不同的浓度，用理论1,5-AG浓度作为横坐标自变量Xi，以采用本发明实施例1的试剂盒检测的三次平均值为实际测试值作为纵坐标应变量Yi求出线性回归方程，计算线性回归相关系数r。结果如表3所示。
表3线性范围分析结果
结果显示，线性回归方程为Y＝1.0022x+0.0575，其相关系数r＝1。连续测试十组空白样品的吸光度为0.092、0.092、0.091、0.090、0.091、0.091、0.092、0.092、0.091、0.091、0.092，由定值方程y＝2565.4x-235.46计算出的浓度结果再根据最低检出限的计算公式3σ得出最低检出限为5.19μM，表明本发明在线性范围5.2μM—500μM内相关性较好，适用范围广。
(2)准确度检测
采用国际标准的高、低值血清校准品各两支。利用本发明的实施例1的试剂盒进行测试，每支样品重复检测3次，并与校准品靶值进行比较。结果见表4：
表4准确度检测结果
样本 测定值X1 测定值X2 测定值X3 平均值 靶值 准确度
1 22.7 24.6 23.6 23.6 25.4 -1.8μM
2 42.1 40.7 40.7 41.1 42.7 96.3％
3 49.0 50.4 49.0 49.4 49.9 99.0％
4 292.4 288.2 289.6 290.1 286.0 98.6％
5 398.9 396.1 397.5 397.5 400.1 99.4％
由表4数据可知，本发明提供的试剂盒测定的1,5-AG的平均值与靶值很接近，低值样品检测的准确度分别为-1.8μM、96.3％和99％，高值样品检测的准确度为分别为98.6％和99.21％，表明本发明试剂盒准确度高。
(3)精密度检测
取1,5-AG浓度由高到低四个血清样本，重复检测十次，计算其变异系数，结果见表5。
表5精密度测试结果
测试序号 样本1 样本2 样本3 样本4
1 23.7 42.1 248.1 457
2 24.6 44.8 257.8 448.7
3 23.2 42.1 248.1 450.1
4 24.5 40.7 248.1 458.4
5 24.1 40.7 248.1 451.4
6 22.7 40.7 249.5 452.8
7 23.6 42.1 249.5 445.9
8 22.5 42.1 255.1 455.6
9 22.4 42.1 250.9 448.7
10 24.7 42.1 248.1 450.1
均值 23.6 41.9 250.4 451.9
SD 0.876 1.211 3.400 4.021
CV 3.71％ 2.90％ 1.40％ 0.90％
结果显示，标准差率小于标准的3％，表明本发明所述试剂盒精密度高。(4)稳定性检测
对本发明实施例1的试剂盒进行开瓶稳定性测试。取本发明试剂盒开瓶后分别在4℃和37℃环境下贮存6天，6天后对浓度分别为40.4、247.9和454.6μM的校准品进行开瓶稳定性测试，计算开瓶6天后测试结果偏差值，结果见表6。
表6稳定性实验结果
结果表明，25.4μM的校准品在4℃环境下对开瓶储存6天后测定的偏差为-1.4μM，小于±2μM，37℃环境下开瓶储存6天测定的偏差为0.8μM，小于±3μM；浓度分别为40.4、247.9和454.6μM的校准品在4℃环境下对开瓶储存6天后测定的偏差依次0.5％、0.1％和0.9％，小于1％，37℃环境下开瓶储存6天测定的偏差依次6.4％、9.1％和6.3％，均小于10％，表明本发明试剂盒具有良好的稳定性，满足检测要求。
其中，线性范围比目前九强试剂盒的线性范围宽，达到[5.2,500]μM，低值准确度有所提高，在[0,30]μM范围内，偏差不超过±2μM。
将实施例2～3制备的试剂盒进行线性范围、准确度、精密度、和稳定性的验证，结果与实施例1制得的试剂盒的效果相同或相近，无显著差异(P>0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种检测1,5-AG的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；
其中，所述试剂R1包括己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、ATP、NADP、MgCl2、丙酮酸、乳酸脱氢酶、丙酮酸激酶、MES缓冲液、保护剂和防腐剂；
所述试剂R2包括吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替吡啉、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺、HEPES缓冲液和防腐剂。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中各组分含量为：
所述试剂R2中各组分含量为：
3.根据权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中各组分含量为：
所述试剂R2中各组分含量为：
4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述保护剂为抗坏血酸氧化酶。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述防腐剂为NaN3。
6.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2中，防腐剂为NaN3。
7.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测1,5-AG的方法，其特征在于，包括如下步骤：
依次加入试剂R1、待测样品，37℃孵育4～8min，然后加入试剂R2，混匀，37℃反应4～8min，在555nm波长下检测吸光度，对照标准曲线计算待测样品中1,5-AG的浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述标准曲线采用的1,5-AG校准品溶液的浓度为0～500.6μM。
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