CN115786450B

CN115786450B - 一种1,5-脱水-d-山梨醇测定试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN115786450B
Application number: CN202211688601.7A
Authority: CN
Inventors: 赖华; 钟铃; 周鹏程
Original assignee: Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Uniten Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115786450A

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，公开了一种1,5‑脱水‑D‑山梨醇测定试剂盒及其制备方法。所述测定试剂盒由R1试剂和R2试剂组成，其中R1试剂由己糖激酶、ATP、丙酮酸激酶、PEP、抗坏血酸氧化酶、4‑AAP、脂肽和Tris缓冲液组成；R2试剂由过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯、表面活性剂和PBS缓冲液组成。本发明试剂盒通过在R1试剂和R2试剂中加入特定脂肽生物表面活性剂，可以同时达到抗干扰、抗菌防腐及提高稳定性的作用，无需添加其它复杂功能助剂。具有抗干扰能力强、稳定性高、安全性好的优势。

Description

一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

近年来，糖尿病的发病率急剧增长，已经成为威胁人类健康的主要疾病之一，引起了人们的极大关注。糖尿病作为一种慢性高发性疾病，早预防、早诊断、早治疗尤为重要，然而，作为目前临床上广泛使用诊断糖尿病的标准—口服葡萄糖耐量试验操作繁琐，患者依从性较差；而空腹血糖和糖化血红蛋白容易遗检早期糖尿病患者。所以，需要继续寻找更加敏感、更加特异的诊断指标，作为筛查早期糖尿病及其监控血糖波动水平。l,5-脱水-D-山梨醇(l,5-AG)是存在于人体血液中主要的多元醇糖物质之一，由于其代谢稳定，在含量波动范围小，可及时反映糖尿病患者的糖代谢情况，具有空腹血糖、果糖胺和糖化血红蛋白所不具备的特征，在糖尿病的早期诊断和治疗中有很高的临床价值。

专利CN 107907534A公开了一种用于1,5-脱水-D-山梨醇检测显色试剂，其组成为N-(羧甲基氨基羰基)-4,4’-双(二甲胺基)二苯胺钠盐(简称DA-64)和18-冠醚-6(CAS:17455-13-9)。通过在DA-64水溶液中添加18-冠醚-6，使DA-64与所添加的18冠醚-6形成复合物体系，增加了DA-64分子在溶液中的稳定性，从而获得具有长期稳定Trinder反应显色试剂。但冠醚有一定的毒性，必须避免吸入其蒸气或与皮肤接触，存在一定危害。

CN 107703071 B公开了一种检测1,5-AG的试剂盒，通过选择适宜的试剂R1和试剂R2，采用HK+G6PD法+乳酸脱氢酶法有效地消除了1,5-AG样品中的内源性葡萄糖，然后利用氧化酶-紫外分光光度法检测人体血清中1,5-AG的含量。该试剂盒能够有效消除1～20mM内源性葡萄糖的干扰。但该试剂盒为保证试剂的稳定性需加入较高含量的保护剂及防腐剂。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，其中R1试剂由己糖激酶、三磷酸腺苷(ATP)、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、抗坏血酸氧化酶、4-氨基安替比林(4-AAP)、脂肽和三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液组成；R2试剂由过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯、表面活性剂和磷酸盐(PBS)缓冲液组成。

进一步地，所述R1试剂中各组分含量如下：

己糖激酶3～25kU/L；

ATP 0.5～2mmol/L；

丙酮酸激酶2～15kU/L；

PEP 2～5mmol/L；

抗坏血酸氧化酶5～25kU/L；

4-AAP 0.5～2.5mmol/L；

脂肽0.1～10g/L；

Tris缓冲液10～100mmol/L。

进一步地，所述R2试剂中各组分含量如下：

过氧化物酶5～15kU/L；

吡喃糖氧化酶60～100kU/L；

羟基甲苯磺酰碘苯3～6mmol/L；

表面活性剂0.5～3g/L；

PBS缓冲液50～250mmol/L。

进一步优选地，所述脂肽为环状脂肽。

更优选地，所述脂肽为绿针假单胞菌脂肽或枯草菌脂肽。其结构分别如下：

绿针假单胞菌脂肽；

枯草菌脂肽。

本发明所采用的脂肽分子中具有由多个氨基酸组成的肽链形成的亲水基和脂肪经链形成的亲油基，其具有较强的表面活性，且具有相比其它合成表面活性剂更好的生物相容性，因而具有更好的稳定作用。同时脂肽还具有一定的抗菌活性，可达到抗菌防腐及进一步提高稳定性的作用。另外环状脂肽对部分重金属离子具有极强的结合作用，其在本发明中可与血红蛋白中的铁离子作用形成稳定的结合物，提高检测试剂盒的抗干扰作用。

进一步地，所述R2试剂中过氧化物酶选自辣根过氧化物酶。

进一步地，所述R2试剂中表面活性剂选自吐温-20、绿针假单胞菌脂肽或枯草菌脂肽；更优选为枯草菌脂肽。所述枯草菌脂肽对羟基甲苯磺酰碘苯具有较强的稳定作用，且对其显色效果无明显不良影响。

本发明试剂盒的检验原理为：

吡喃糖氧化酶、己糖激酶和三磷酸腺苷重生系统可检测血清1,5-脱水山梨醇的浓度变化。己糖激酶和ATP重生系统可有效的将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的化合物葡萄糖-6-磷酸，使用这种方法可选择性的针对1,5-脱水山梨醇的变化。吡喃糖氧化酶氧化1,5-脱水山梨醇生成的过氧化氢可通过TRINDER反应进行检测。

上述1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)配制R1试剂：取设定量的水，依次加入Tris缓冲液、己糖激酶、ATP、丙酮酸激酶、PEP、抗坏血酸氧化酶、4-AAP和脂肽搅拌溶解均匀，调节PH值至7.0～9.0，即得R1试剂；

(2)配制R2试剂：取设定量的水，依次加入PBS缓冲液、过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯和表面活性剂搅拌溶解均匀，调节PH值至7.0～9.0，即得R2试剂；

(3)将R1试剂和R2试剂按规定剂量组合包装，得到1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明试剂盒具有抗干扰能力强、稳定性高、安全性好的优势。

(2)本发明试剂盒通过在R1试剂和R2试剂中加入特定脂肽生物表面活性剂，可以同时达到抗干扰、抗菌防腐及提高稳定性的作用，无需添加其它复杂功能助剂。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例的一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成，其中R1试剂规格为2×42ml，R2试剂规格为1×28ml。R1试剂和R2试剂的成分组成如下：

R1试剂：己糖激酶4kU/L，ATP 1mmol/L，丙酮酸激酶3kU/L，PEP 4mmol/L，抗坏血酸氧化酶5kU/L，4-AAP 1.5mmol/L，枯草菌脂肽4g/L，Tris缓冲液50mmol/L。

R2试剂：辣根过氧化物酶10kU/L，吡喃糖氧化酶80kU/L，羟基甲苯磺酰碘苯4.5mmol/L，枯草菌脂肽2g/L，PBS缓冲液100mmol/L。

本实施例1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒的制备方法如下：

(1)配制R1试剂：取设定量的水，依次加入Tris缓冲液、己糖激酶、ATP、丙酮酸激酶、PEP、抗坏血酸氧化酶、4-AAP和枯草菌脂肽搅拌溶解均匀，调节PH值至8.5，即得R1试剂；

(2)配制R2试剂：取设定量的水，依次加入PBS缓冲液、过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯和枯草菌脂肽搅拌溶解均匀，调节PH值至8.5，即得R2试剂；

(3)将R1试剂以2×42ml，R2试剂以1×28ml剂量组合包装，得到1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒。

对本实施例所得测定试剂盒进行如下性能指标测试，测试基本参数及测定方法分别如下表1和表2所示。

表1.基本参数

主波长	546nm	样本(S)	6μl
				副波长	700nm	试剂1(R1)	180μl
反应类型	终点法	试剂2(R2)	60μl
				反应方向	正反应	反应温度	37℃

表2.测定方法

1、空白吸光度测试：

使用分光光度计，以纯水作为样品，在37℃、546nm波长、1cm光径条件下，测试试剂空白吸光度＜0.1000。

2、灵敏度测试：

用试剂盒测试浓度为150±10μmol/L的样本，记录试剂盒在37℃、546nm波长、1cm光径条件下的吸光度变化，按式(1)换算为150μmol/L的吸光度差值(△A)，平行测定三次取平均值，结果显示△A＝0.1228。

式中：

△A已知样品—已知浓度样品的吸光度差值；

C已知样品—已知样品的浓度。

3、线性范围测试：

用接近线性区间下限的低浓度样品(L)稀释接近线性范围上限的高浓度样品(H)，按表3混合成5个稀释浓度(x_i)。对每一稀释浓度的样本重复测定3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值(y_i)。以xi为自变量，以yi为因变量求出线性回归方程。按式(2)计算线性回归的相关系数(r)，结果显示在[6.0，300.0]μmol/L范围内，线性相关系数r＝0.9979。

表3.稀释比例示例表

序号	1	2	3	4	5
						空白样品	0份	1份	2份	3份	4份
高浓度样品	4份	3份	2份	1份	0份

将稀释浓度(x_i)代入线性回归方程，按式(3)、式(4)计算测试均值(y_i)与相应估计值(y)的绝对偏差或相对偏差(S)，结果显示在[6.0，30.0]μmol/L范围内，绝对偏差为-0.2μmol/L～0.7μmol/L；[30.0，300.0]μmol/L范围内，相对偏差为0.51％～2.08％。

S_绝对偏差＝y_i-y…………………………………………………………………(3)；

4、重复性测试：

用试剂盒分别测试一个医学决定水平正常浓度(10μmol/L)控制物质和一个异常浓度(200μmol/L)控制物质，重复测试10次，分别计算测量值的平均值和标准差(SD)，按式(5)计算变异系数(CV)，结果显示正常浓度重复测量结果的变异系数为0.87％，异常浓度重复测量结果的变异系数为0.39％。

式中：

CV—变异系数；

SD—10次测量结果的标准差；

—10次测量结果的平均值。

5、批间差测试：

用3个不同批号的试剂盒测试相同控制物质的差异，所得结果以批间相对极差(R)表示。每个批号测试3次，分别计算每批3次检验的均值按式(6)、式(7)计算相对极差(R)，结果显示批间相对极差为1.85％。

式中：

—三批测试值的均值；

R—批间相对极差；

的最大值；

的最小值。

6、准确度测试：

用试剂盒测定有证参考品(300μmol/L)，重复测定3次，测试结果记为(x_i)，按式(8)分别计算相对偏差(B_i)，3次测量结果相对偏差分别为-2.20％、-2.74％、1.28％。

式中：

B_i—相对偏差；

x_i—测试结果；

T—标准物质标示值。

7、稳定性测试：

将试剂盒置于37℃恒温摇床内，分别在0周、1周、2周、4周、8周、16周检测靶值为150μmol/L质控品的数值，重复检测三遍，记录并计算平均值(x_i)，按式(8)分别计算相对偏差(B_i)，结果如下表4所示。

表4

序号

0周

1周

2周

4周

8周

16周

相对偏差B_i

-2.34％

1.08％

-1.26％

-1.79％

-3.05％

-4.69％

通过以上结果可见，本发明的测定试剂盒具有良好的准确度、灵敏度和稳定性。

对比例1

本对比例与实施例1相比，试剂盒中R1试剂不含枯草菌脂肽，其余相同。R1试剂和R2试剂的成分组成如下：

R1试剂：己糖激酶4kU/L，ATP 1mmol/L，丙酮酸激酶3kU/L，PEP 4mmol/L，抗坏血酸氧化酶5kU/L，4-AAP 1.5mmol/L，Tris缓冲液50mmol/L。

按实施例1中的方法进行相应性能指标测试，灵敏度测试显示△A＝0.0941；线性范围测试结果显示在[6.0，300.0]μmol/L范围内，线性相关系数r＝0.9620；在[6.0，30.0]μmol/L范围内，绝对偏差为-2.8μmol/L～-1.6μmol/L；[30.0，300.0]μmol/L范围内，相对偏差为-6.85％～-4.43％；重复性测试显示正常浓度重复测量结果的变异系数为6.24％，异常浓度重复测量结果的变异系数为4.09％；批间差测试显示批间相对极差为4.58％；准确度测试结果显示3次测量结果相对偏差分别为-5.74％、-6.52％、-5.67％。稳定性测试结果如下表5所示。

表5

序号

0周

1周

2周

4周

8周

16周

相对偏差B_i

-4.73％

-5.57％

-5.32％

-6.65％

-7.88％

-10.12％

通过本对比例与实施例1的比较结果可见，本发明通过在R1试剂中加入枯草菌脂肽，可在一定程度上提高检测灵敏度，明显改善试剂盒的线性范围和提高试剂盒的检测准确度，并在一定程度上改善试剂盒稳定性。

实施例2

本实施例与实施例1相比，试剂盒中R2试剂采用等量吐温-20替代枯草菌脂肽，其余相同。R1试剂和R2试剂的成分组成如下：

R2试剂：辣根过氧化物酶10kU/L，吡喃糖氧化酶80kU/L，羟基甲苯磺酰碘苯4.5mmol/L，吐温-20 2g/L，PBS缓冲液100mmol/L。

按实施例1中的方法进行相应性能指标测试，灵敏度测试显示△A＝0.1231；线性范围测试结果显示在[6.0，300.0]μmol/L范围内，线性相关系数r＝0.9964；在[6.0，30.0]μmol/L范围内，绝对偏差为-0.8μmol/L～-0.2μmol/L；[30.0，300.0]μmol/L范围内，相对偏差为-2.43％～0.76％；重复性测试显示正常浓度重复测量结果的变异系数为1.23％，异常浓度重复测量结果的变异系数为0.54％；批间差测试显示批间相对极差为1.82％；准确度测试结果显示3次测量结果相对偏差分别为-1.79％、1.06％、-2.44％。稳定性测试结果如下表6所示。

表6

序号

0周

1周

2周

4周

8周

16周

相对偏差B_i

-1.85％

-2.24％

-2.97％

-6.36％

-8.58％

-12.65％

通过本实施例与实施例1的比较结果可见，本发明通过在R2试剂中加入枯草菌脂肽，相比常规表面活性剂吐温-20具有更高的稳定性，且对检测准确度无明显不利影响。说明枯草菌脂肽与羟基甲苯磺酰碘苯形成的复合物体系有利于显色物质羟基甲苯磺酰碘苯在溶液中的长期稳定。

实施例3

本实施例与实施例1相比，试剂盒中R2试剂采用等量绿针假单胞菌脂肽替代枯草菌脂肽，其余相同。R1试剂和R2试剂的成分组成如下：

R2试剂：辣根过氧化物酶10kU/L，吡喃糖氧化酶80kU/L，羟基甲苯磺酰碘苯4.5mmol/L，绿针假单胞菌脂肽2g/L，PBS缓冲液100mmol/L。

按实施例1中的方法进行相应性能指标测试，灵敏度测试显示△A＝0.0923；线性范围测试结果显示在[6.0，300.0]μmol/L范围内，线性相关系数r＝0.9895；在[6.0，30.0]μmol/L范围内，绝对偏差为-1.3μmol/L～-0.6μmol/L；[30.0，300.0]μmol/L范围内，相对偏差为-4.55％～-1.46％；重复性测试显示正常浓度重复测量结果的变异系数为3.76％，异常浓度重复测量结果的变异系数为2.38％；批间差测试显示批间相对极差为3.04％；准确度测试结果显示3次测量结果相对偏差分别为-3.83％、-3.95％、-4.07％。稳定性测试结果如下表7所示。

表7

序号

0周

1周

2周

4周

8周

16周

相对偏差B_i

-3.66％

-3.92％

-4.57％

-5.04％

-5.56％

-6.25％

通过本实施例与实施例1和2的比较结果可见，本发明通过在R2试剂中加入绿针假单胞菌脂肽，相比常规表面活性剂吐温-20具有更高的稳定性，说明绿针假单胞菌脂肽与羟基甲苯磺酰碘苯形成的复合物体系有利于显色物质羟基甲苯磺酰碘苯在溶液中的长期稳定；但会造成检测灵敏度和准确度一定程度的降低，其原因可能在于绿针假单胞菌脂肽与羟基甲苯磺酰碘苯形成的复合物体系会在一定程度上降低羟基甲苯磺酰碘苯的显色效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒，其特征在于，由R1试剂和R2试剂组成，其中R1试剂由己糖激酶、ATP、丙酮酸激酶、PEP、抗坏血酸氧化酶、4-AAP、脂肽和Tris缓冲液组成；R2试剂由过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯、表面活性剂和PBS缓冲液组成；

所述R1试剂中脂肽为绿针假单胞菌脂肽或枯草菌脂肽；所述R2试剂中表面活性剂为枯草菌脂肽；

所述R1试剂中各组分含量如下：

己糖激酶3~25kU/L；

ATP 0.5~2mmol/L；

丙酮酸激酶2~15kU/L；

PEP 2~5mmol/L；

抗坏血酸氧化酶5~25kU/L；

4-AAP 0.5~2.5mmol/L；

脂肽0.1~10g/L；

Tris缓冲液10~100mmol/L；

所述R2试剂中各组分含量如下：

过氧化物酶 5~15kU/L；

吡喃糖氧化酶60~100kU/L；

羟基甲苯磺酰碘苯 3~6mmol/L；

表面活性剂 0.5~3g/L；

PBS缓冲液50~250mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中过氧化物酶选自辣根过氧化物酶。

3.权利要求1或2所述的一种1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

（1）配制R1试剂：取设定量的水，依次加入Tris缓冲液、己糖激酶、ATP、丙酮酸激酶、PEP、抗坏血酸氧化酶、4-AAP和脂肽搅拌溶解均匀，调节PH值至7.0~9.0，即得R1试剂；

（2）配制R2试剂：取设定量的水，依次加入PBS缓冲液、过氧化物酶、吡喃糖氧化酶、羟基甲苯磺酰碘苯和表面活性剂搅拌溶解均匀，调节PH值至7.0~9.0，即得R2试剂；

（3）将R1试剂和R2试剂按规定剂量组合包装，得到1,5-脱水-D-山梨醇测定试剂盒。