CN103725749A - 一种1,5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种1，5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。其特点是：通过葡萄糖激酶(GK)和磷酸葡萄糖异构酶(PGI)将样品中葡萄糖(Glu)转化为果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保Glu向Fru-6-P转化。样品中1，5-AG经吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5-脱水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系统显色定量。

Description

一种1,5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法
技术领域
本发明涉及1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)的氧化法测定方法，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。 
背景技术
血清中1，5-脱水葡糖醇浓度不受即时的饮食、葡萄糖摄食量影响，能快速、灵敏的反映3-5天内总血糖变化情况。糖尿病患者血清1，5-AG显著降低，当糖尿病得到良好控制时，血清1，5-AG的日回升率十分稳定，不受冶疗方法、性别、年龄、体重、患病时间和血清中1，5-AG起初的浓度影响，回升幅度和对糖尿病诊断的敏感性及特异性均明显大于常用的糖尿病诊断指标糖化血红蛋白(HbAlc)和果糖胺(GSP)。 
文献报道测定1，5-AG的方法有阴离子交换层析法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱质谱法(LC-MS)、全自动酶分析法等，前三种方法需要对1，5-AG进行衍生和复杂的样品前处理，同时需特殊、昂贵仪器，不适合临床常规分析。全自动酶法虽好，但易受血清中高浓度葡萄糖干扰，如Fukumura Y(Clin Chem，1994，40：2013-2016.)、陈国军等(中华医学检验杂志，1999，22(6)：358-361.)在测定1，5-AG时，将葡萄糖通过葡萄糖激酶(GK)转化为6-磷酸葡萄糖，然后用吡喃糖氧化酶(PROD)将1，5-AG氧化产生过氧化氢并偶联Trindre’s反应显色定量。由于PROD酶的底物特异性不佳，反应中生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足时易重新转化为葡萄糖，生成的葡萄糖被PROD酶氧化后参与Trindre’s反应并显色，从而引起1，5-AG的测定结果假性升高。 
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，将葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖后，进一步利用磷酸葡萄糖异构酶的催化作用将6-磷酸葡萄糖转化为不与PROD酶作用的6-磷酸果糖，并通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖转化，该法测定试剂4℃开瓶稳定性达27d，对1，5-AG具有良好的选择性，高达85.0mol/L的葡萄糖不干扰本法测定。 
发明内容
本发明提供了1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)的氧化酶法测定方法，用于血清1，5-脱水葡糖醇的测定。该测定体系主要是通过葡萄糖激酶(GK)和磷酸葡萄糖异构酶(PGI)将样品中葡萄糖(Glu)转化为果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保Glu 向Fru-6-P转化。样品中1，5-AG经吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5-脱水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系统显色定量。 
为了达到理想的检测效果，本发明还特别提供了1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)的氧化酶法测定试剂，分为A、B二个组份。两个组份的具体成份组成可表述如下。 
A组份： 
Figure BSA00000796106000021
B组份： 
Figure BSA00000796106000022
为了提高上述测定试剂的准确性和稳定性，消除测定结果受外界的多种干扰，所述的1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)的氧化酶法测定试剂中的缓冲液可以为GOOD’S系列缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸—醋酸钠缓冲液、柠檬酸—柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾—盐酸缓冲液，特别优选的缓冲液为GOOD’S系 列缓冲液；表面活性剂可以为SDS、Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、TritonX-100等非离子型表面活性剂其中的一种或几种的组合；稳定剂可以是氯化钠、抗生素、多元醇、牛血清白蛋白(BSA)等；防腐剂可以是NaN3、PC系列防腐剂等。 
具体实施方式
实施例：1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)的脱氢酶法测定试剂测定试剂，特别优选的缓冲液是pH8.0Tris-HCl缓冲液；特选优选的表面活性剂是TritonX-100；特选优选的防腐剂是PC300；特选的稳定剂是牛血清白蛋白。 
A组份： 
Figure BSA00000796106000031
B组份： 
Figure BSA00000796106000032
在实施例的试剂用于测定样本时，采用的测定方法为两点终点法，温度为37 ℃，R1∶样本∶R2为240∶5∶80，测定主/副波长为600/700nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育180～300秒后读取第1点吸光度，然后加入R2继续孵育300秒后读取第2点吸光度。 
用本法和文献法(陈国军，等.中华医学检验杂志，1999，22(6)：358-361.)同时测定了40例糖化1，5-脱水葡糖醇标本。表1为本实施例测定值与文献法测定值对照表，图1根据表1数据制成。本实施例和原子吸收法的相关系数r为0.9978，两者显示了极好的相关性。 
表1 
  文献法测定值(μmol/L)   实施例测定值(μmol/L)
  45.2   46.9
  65.3   67.5
  67.7   65.9
  51.8   50.4
  54.7   52.9
  55   54.8
  60.8   58.7
  62.4   63.7
  48.9   46.8
  55.9   53.2
  68.7   66.9
  78.5   75.4
  69.6   68.8
  72.5   70.3
  101.5   98.8
  122.4   121.6
  137.8   134.7
  136.9   135.7
  111   109.7
  87.4   86.4
[0021] 
  91.4   90.7
  70.6   69.3
  72.3   71.2
  76.1   74.9
  69.9   67.5
  105.8   103.5
  120.9   117.3
  145.7   143.5
  167.2   170
  114.8   118
  172.8   173.5
  175.9   170
  182.3   185
  194.7   201
  201.1   208
  214.5   215
  208.9   201
  215.7   214.3
  231.5   228.9
  233.7   229.3
上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。 
附图说明
图1是本发明的实施例测得值与文献法同时测定了40例糖化1，5-脱水葡糖醇标本测得值的相关性示意图。 

Claims (4)

1.一种5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法，其特征是通过葡萄糖激酶(GK)将主要干扰物葡萄糖转化为葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)，葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)再经磷酸葡萄糖异构酶(PGI)转化为果糖-6-磷酸(Fru-6-P)，并通过系统中的丙酮酸激酶(PK)和磷酸烯醇式丙酮酸盐(PEP)，建立ATP再生系统，确保Glu向Fru-6-P转化。样品中1，5-AG经吡喃糖氧化酶(PROD)作用生成1，5-脱水果糖(1，5-AF)和H2O2，后者借Trinder’s系统显色定量。
2.根据权利要求1所述的一种1，5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法，其特征是在将主要干扰物葡萄糖转化为果糖-6-磷酸(Fru-6-P)的同时，必须建立ATP再生系统。
3.根据权利要求1所述的一种1，5-脱水葡糖醇的氧化酶法测定方法，其特征是在将主要干扰物葡萄糖转化为葡萄糖-6磷酸(Glu-6-P)的酶是葡萄糖激酶(GK)。
4.根据权利要求1所述的一种1，5-脱水葡糖醇的氧化法测定方法，其特征是将待测物1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)氧化的酶是吡喃糖氧化酶(PROD)。 
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