CN112159833B - 一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗诊断技术领域，公开了一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法。本发明所述试剂包括缓冲液、己糖/葡萄糖激酶、6‑磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、ATP、NADP、丙酮酸(钠)和磷酸肌酸(钠)。本发明采用试剂肌酸激酶(CK)和磷酸肌酸(钠)对普遍存在的ATP循环稳定性问题进行改进，另一方面偶联酶促反应消除中间副产物抑制而促进样品中的葡萄糖分解，在此基础上通过控制丙酮酸(钠)和NADP的添加比例增强NADP循环，去除过剩的还原性NADPH产物，更有效地消除高浓度的内源性葡萄糖干扰，同时增强试剂的热稳定性，使测试结果更准确。

Description

一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法
技术领域
本发明涉及医疗诊断技术领域，具体的说是涉及一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法。
背景技术
1,5-AG(1,5-脱水-D-山梨醇)与现有的糖尿病指标血糖、糖化白蛋白、糖化血红白蛋白等呈显著的负相关，血液中1,5-AG的减少程度与糖尿病病程密切相关，可反映患者近几天至1周的平均血糖水平且不受病人的年龄、性别、饮食、药物、活动及体内代谢变化影响。
目前国内外市场上主要采用酶法检测1,5-AG，其操作简便，适用于紫外-可见分光光度仪手工测试、半自动/全自动生化分析仪检测，有利于临床应用。市场上的酶法测定主要有氧化酶法和脱氢酶法。
氧化酶法主要应用吡喃糖氧化酶(PROD)催化1,5-AG生成1,5-脱水果糖和H2O2，再经过Trinder反应(偶联终点比色法)生成显色物质比色定量(如九强专利CN 102175670 A、美康专利CN 104483487 A)。
脱氢酶法利用ADP依赖型己糖激酶(ADP-HK)将1,5-AG磷酸化生成1,5-AG-6磷酸，再通过1,5-AG-6磷酸脱氢酶催化1,5-AG-6磷酸和NADP反应产生NADPH，具还原性的NADPH与显色剂反应显色(如KYOWA MEDEX产品)；专利CN 102154442 A在以上反应基础上去掉了NADP/NADPH参与的显色反应步骤，引入硫代氧化性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸促成1,5-AG-6磷酸脱氢酶催化下的氧化性NAD的循环，直接检测NAD吸光度的变化速率，放大了检测信号而提高检测灵敏度。
1,5-AG在结构上与葡萄糖相似，故通常在检测方法中加入对葡萄糖干扰的消除，也是实现1,5-AG准确检测的关键。目前消除内源性葡萄糖干扰的方法主要有如下三种：
(1)GOD法(葡萄糖氧化酶法)
Figure BDA0002524346860000011
Figure BDA0002524346860000021
(2)HK/GK结合G6PD法
Figure BDA0002524346860000022
Figure BDA0002524346860000023
(3)HK/GK结合PK法
Figure BDA0002524346860000024
Figure BDA0002524346860000025
以上三种方法在应用时均残存不同程度的葡萄糖干扰，可能原因在于产物抑制、或供能不足、或表现在试剂稳定性缺陷等。专利CN107703071A公布了一种R1试剂的选用，结合GK/HK+G6PD+PK+LDH法，可解除G6P产物抑制、实现ATP和NADP循环，更快更有效得消除1～20mM内源性葡萄糖干扰，测试更准确。创新方法的反应过程如下：
Figure BDA0002524346860000026
Figure BDA0002524346860000027
Figure BDA0002524346860000028
Figure BDA0002524346860000029
但是该专利中试剂热稳定性较差，会带来较大的干扰偏差；同时其更侧重于消除1～20mM内源性葡萄糖干扰。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂，使得所述试剂能够消除更高浓度的内源性葡萄糖干扰并具有较高的热稳定性；
本发明的另外一个目的在于提供上述试剂在制备检测1,5-AG试剂盒中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供消除内源性葡萄糖干扰的方法。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂，其特征在于，包括缓冲液、己糖/葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、ATP、NADP、丙酮酸(钠)和磷酸肌酸(钠)。
目前的现有技术中常常使用丙酮酸激酶-磷酸烯醇式丙酮酸组合实现ATP循环，再偶联酶促反应消除中间副产物抑制而促进样品中的葡萄糖消除，例如现有专利CN107703071A技术，但此类技术无法更好地消除高于20mM内源性葡萄糖干扰，同时ATP循环需要试剂有较高的稳定性，否则会出现偏差，并且中间反应产生的还原性NADPH会存在消除不足而过剩，干扰1,5-AG的准确测定。
本发明采用试剂肌酸激酶(CK)和磷酸肌酸(钠)改进ATP循环应用，选择控制丙酮酸(钠)和NADP的添加比例改进NADP循环和还原性NADPH消除，从而去除更高浓度的葡萄糖干扰，同时保证试剂具有较高的热稳定性。避免出现过大偏差而影响检测准确性。
作为优选，本发明所述试剂包括20-100mmol/L缓冲液、1-10KU/L己糖/葡萄糖激酶、5-30KU/L6-磷酸葡萄糖脱氢酶、50-100KU/L乳酸脱氢酶、1-10KU/L肌酸激酶、0.5-10mmol/L ATP、1.5-8mmol/L NADP、8-20mmol/L丙酮酸(钠)和5-30mmol/L磷酸肌酸(钠)。其中，丙酮酸(钠)表示可以为丙酮酸或丙酮酸钠或两者组合，磷酸肌酸(钠)表示可以为磷酸肌酸或磷酸肌酸钠或两者组合；所述磷酸肌酸(钠)浓度更优选为10-30mmol/L。
在本发明具体实施方式中，所述缓冲液浓度为50mmol/L；所述己糖/葡萄糖激酶浓度为3.5-8KU/L；所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶浓度为7.5-10KU/L；所述乳酸脱氢酶浓度为60-65KU/L；所述肌酸激酶浓度为3.75-4KU/L；所述ATP浓度为2-3mmol/L；所述磷酸肌酸(钠)浓度为5-20mmol/L；
在本发明中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶催化反应中的NADP浓度、丙酮酸(钠)浓度非常关键。NADP的浓度优选为1.5-8mmol/L，更优选为2mmol/L，还可以选择1.5mmol/L、4mmol/L或8mmol/L；丙酮酸钠浓度优选为8～20mmol/L，更优选为12mmol/L。
此外，本发明所述试剂中还可以加入常规技术中经常加入的酶保护剂、酶促进剂和抗VC干扰剂中的一种或两种以上。在本发明具体实施方式中，所述酶保护剂选自蔗糖、甘氨酸、牛血清白蛋白和表面活性剂(包括吐温系列、Triton系列等)中的一种或两种以上；所述酶促进剂选自氯化镁、硫酸镁、氯化钾中的一种或两种以上；所述抗VC干扰剂为抗坏血酸氧化酶；所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、Proclin系列、苯甲酸钠中的一种或两种以上。
作为优选，所述酶保护剂浓度为0.01-5wt％，更优选为0.5wt％；所述酶促进剂浓度为0.1-20mmol/L，更优选为7mmol/L；所述抗VC干扰剂浓度为1-10KU/L，更优选为5-6.5KU/L；所述防腐剂浓度为0.05-0.2wt％，更优选为0.125wt％。
作为优选，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液或双甘氨肽缓冲液。
本发明以现有专利CN107703071A技术和常规的HK+PK法作为对照进行1,5-AG的测定，结果显示本发明可更稳定、高效地去除样本中30mmol/L葡萄糖对测试的干扰，干扰偏差可控制在10％以内；同时，在试剂置于37℃5天后仍能保持较高的抗葡萄糖干扰能力，偏差控制在10％以内；而作为对照两种现有技术在上述两方面偏差远超10％，无法消除内源性葡萄糖的干扰。
基于上述优异的技术效果，本发明提供了所述试剂在制备检测1,5-AG的试剂盒中的应用或在消除内源性葡萄糖干扰中的应用。
根据应用，本发明提供了一种检测1,5-AG的试剂盒，包括本发明所述试剂，以及利用氧化酶法或脱氢酶法检测1,5-AG的试剂。所述利用氧化酶法或脱氢酶法检测1,5-AG的试剂在本领域中属于常规试剂，可以参照现有技术所记载的试剂组成。在本发明具体实施方式中，本发明采用利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂：包括缓冲液、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和可发生Trinder反应的色原物质。其中，4-氨基安替比林可以置于本发明所述的消除内源性葡萄糖干扰的试剂中(在具体实施方式中为R1试剂)，也可以置于利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂中(在具体实施方式中为R2试剂)，或者在两种试剂中均添加；
其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液或双甘氨肽缓冲液。
作为优选，所述利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂还可添加防腐剂；所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、Proclin系列、苯甲酸钠中的一种或两种以上。
作为优选，所述利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂各组分的浓度如下：
Figure BDA0002524346860000051
更优选地，所述利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂各组分的浓度如下：
Figure BDA0002524346860000052
作为优选，所述能够与4-氨基安替比林发生Trinder反应的色原物质为TOOS。
此外，本发明还提供了一种基于本发明试剂消除内源性葡萄糖干扰的方法，包括：
步骤1、葡萄糖和ATP在己糖/葡萄糖激酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸和ADP；
步骤2、磷酸肌酸(钠)与步骤1生成的ADP在肌酸激酶的作用下生成肌酸和ATP；生成的ATP循环用于步骤1；
葡萄糖-6-磷酸和NADP在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖酸内酯和NADPH；丙酮酸(钠)和NADPH在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸和NADP；生成的NADP循环使用。
上述方法的反应过程可参见如下：
Figure BDA0002524346860000061
Figure BDA0002524346860000062
Figure BDA0002524346860000063
Figure BDA0002524346860000064
完成上述去内源性葡萄糖干扰后，进行1,5-AG主反应即可检测：
Figure BDA0002524346860000065
Figure BDA0002524346860000066
由以上技术方案可知，本发明采用试剂肌酸激酶(CK)和磷酸肌酸(钠)对普遍存在的ATP循环稳定性问题进行改进，另一方面偶联酶促反应消除中间副产物抑制而促进样品中的葡萄糖分解，在此基础上通过控制丙酮酸(钠)和NADP的添加比例增强NADP循环，去除过剩的还原性NADPH产物消除高浓度的内源性葡萄糖干扰，同时增强试剂的热稳定性，使测试结果更准确。
附图说明
图1所示为国产试剂盒和本发明试剂盒的临床相关性；
图2所示为进口试剂盒和本发明试剂盒的临床相关性。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述试剂及其应用和方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的试剂及其应用和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，本发明提供了所述试剂的组成(R1试剂)：
Figure BDA0002524346860000071
以及用于检测1,5-AG的试剂(R2试剂)：
Figure BDA0002524346860000072
所述R1和R2组成检测1,5-AG的试剂盒，检测方法如下：
(1)在225μLR1试剂中加入10μL待测样本，37℃孵育3-5min，测试吸光度1；
(2)再加入75μLR2试剂，混匀，37℃反应3-5min，测试吸光度2。
以上吸光度检测均在540～560nm波长下进行(全自动生化分析仪可选546nm)，计算吸光度变化，对照标准曲线计算待测样品溶液中1,5-AG的浓度。
在本发明提供的对比试验中，各组除应有的差别外，其他各试验条件保持一致；本发明NADP表示氧化型NADP(NADP+)。
以下就本发明所提供的一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂及其应用和方法做进一步说明。
实施例1：本发明所述试剂R1和检测1,5-AG的试剂R2
R1试剂：
Figure BDA0002524346860000081
R2试剂：
Figure BDA0002524346860000082
实施例2：本发明所述试剂与其它试剂的对比
对比本发明去除内源性葡萄糖干扰的试剂以及现有专利CN107703071A试剂和常规的HK+PK法试剂，各组试剂配方见表1，检测1,5-AG的试剂各组统一采用表2试剂；
表1
Figure BDA0002524346860000091
表2(R2试剂)
HEPES缓冲液 200mmol/L
吡喃糖氧化酶 125KU/L
过氧化物酶 12.5KU/L
4-氨基安替比林 1.6mmol/L
TOOS 2.75mmol/L
防腐剂 0.125wt％
采用类人血清基质溶液：NaCl 0.8％，BSA 0.2％，NaN3 0.4％，Tris-HCl pH8.0，制备含有5、10、15、20、25、30mM葡萄糖的1,5-AG样本，以不含葡萄糖的样本作为对照，其中1,5-AG的浓度均为150μmol/L。按照如下测试方法在全自动生化分析仪546nm波长下测定反应度：225μL R1加入10μL样本，37℃反应5min，测吸光度1；再加入75μL R2，37℃反应5min，测吸光度2；计算吸光度变化。结果如表3、表4(R1置于37℃5天)所示。
表3(1,5-AG浓度为150μmol/L，浓度单位μmol/L)
Figure BDA0002524346860000101
表4(1,5-AG浓度为150μmol/L，37℃5天，浓度单位μmol/L)
Figure BDA0002524346860000102
从表3、表4可以看出，相比单独的HK+PK法，现有专利增加6-磷酸-葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶催化的方法在去葡萄糖干扰性能上有提升；而本发明对现有专利再进行改良，引入肌酸激酶催化循环ATP体系，可更稳定、高效地去除样本中30mmol/L葡萄糖对测试的干扰，干扰偏差可控制在10％以内，热稳定性显著提高。
实施例3：本发明所述试剂对内源性葡萄糖的抗干扰试验
按表5配制配方1-6，研究不同丙酮酸(钠)和NADP的添加比例的影响。
表5
Figure BDA0002524346860000103
Figure BDA0002524346860000111
各组均采用实施例1中的R2试剂进行检测；对各组进行去葡萄糖干扰试验及热稳定性试验。将各组试剂分别放在4℃和37℃环境下贮存5天，5天后测试含有0、20、30mM葡萄糖的1,5-AG样本，以不含葡萄糖的样本作为对照，其中1,5-AG的浓度为40、150μmol/L。结果见表6和表7。
表6(1,5-AG浓度为40μmol/L，单位：μmol/L)
Figure BDA0002524346860000112
Figure BDA0002524346860000121
表7(1,5-AG浓度为150μmol/L，单位：μmol/L)
Figure BDA0002524346860000122
从表6、表7可以看出，各组结果表明丙酮酸钠、NADP的浓度对试剂去葡萄糖干扰的稳定性有重要的影响，NADP优选浓度在1.5～8mM，更优选2mM，丙酮酸钠优选浓度在8～20mM，更优选12mM，当NADP浓度过高或丙酮酸钠浓度过低均可能导致不同程度的1,5-AG检测反应负反馈抑制。在所有配方中，配方4提供的试剂可更稳定而有效地消除1-30mM内源性葡萄糖干扰，提高了检测的准确性，适用范围更广。
实施例4：对本发明的试剂盒进行性能评估
选择实施例1的试剂盒进行各方面的性能评估
将1,5-AG溶于类似人血清基质的溶液(见实施例2，再添加10mM葡萄糖)中，配制成6个0-300μM间不同浓度的校准品，采用九强对照1,5-AG检测试剂盒对以上校准品进行定值。用定值校准品按实施例2中的检测方法在全自动生化分析仪上对实施例1的1,5-AG检测试剂定标。以测试反应度为横坐标xi，对应校准品的浓度为纵坐标yi，得到浓度标准曲线方程y(浓度)＝0.183x(反应度)-9.1157。
(1)线性范围检测
先配制1,5-AG高值血清样品(298.0μM)，按照1，4/5，3/5，2/5，1/5，1/20的稀释比稀释得到6个不同浓度，每个样本均含10mM葡萄糖。以1,5-AG理论值作为自变量Xi，以测试值作为因变量Yi求出线性回归方程，计算线性回归系数r，结果见表8。对空白样本连续测试20次，计算检测限，见表9。
表8
Figure BDA0002524346860000131
表9
Figure BDA0002524346860000132
Figure BDA0002524346860000141
由表8和表9可知，本发明的检测试剂盒在接近6-300μM浓度范围内，线性良好，检测限满足要求。
(2)精密度检测
取高、低值两个水平1,5-AG浓度的血清样本(含10mM葡萄糖)，各重复检测10次，计算变异系数，结果见表10。
表10
测试序号 样本1(μmol/L) 测试序号 样本2(μmol/L)
1 42.0 1 152.9
2 41.8 2 151.8
3 41.2 3 153.8
4 40.8 4 150.0
5 42.9 5 147.9
6 41.9 6 152.0
7 41.4 7 148.2
8 39.7 8 149.5
9 40.9 9 148.1
10 41.4 10 148.7
均值 41.4 均值 150.29
SD 0.85 SD 2.17
CV 2.1％ CV 1.4％
(3)稳定性
对本发明实施例1的试剂盒进行稳定性测试。取本发明试剂盒分别在4℃和37℃环境下贮存5天后对含不同浓度葡萄糖的1,5-AG样本进行稳定性测试，计算偏差，结果见表11。
表11(单位μmol/L)
Figure BDA0002524346860000142
Figure BDA0002524346860000151
(4)临床相关性
以本发明实施例1的试剂盒为实验组，分别选用市面上已有的吡喃糖氧化酶法(国产-九强)、以及脱氢酶法(进口-KYOWAMEDEX)1,5-AG测定试剂盒作为对照组，测定20例1,5-AG浓度在6-300μmol/L的临床血清，考察本发明的试剂盒检测准确性。结果如表12、图1、图2所示。
表12(单位μmol/L)
样本序号 国产对照 进口对照 自配试剂 偏差(自配vs国产) 偏差(自配vs进口)
1 7.5 7.6 8.5 13.3％ 11.8％
2 8.2 7.8 8.8 7.3％ 12.8％
3 8.7 8.5 9 3.4％ 5.9％
4 10.5 11.6 11.2 6.7％ -3.4％
5 23.7 22.5 24.4 3.0％ 8.4％
6 28 30.5 30.4 8.6％ -0.3％
7 55.5 48.1 51.8 -6.7％ 7.7％
8 56 51.2 53.4 -4.6％ 4.3％
9 56.9 50.6 53.8 -5.4％ 6.3％
10 68.8 69.4 71.4 3.8％ 2.9％
11 88.7 85.3 85.2 -3.9％ -0.1％
12 98.8 96.9 102.1 3.3％ 5.4％
13 107.6 101.1 102.4 -4.8％ 1.3％
14 117.8 121.8 124.9 6.0％ 2.5％
15 131.1 125.5 127.3 -2.9％ 1.4％
16 149 149.3 152.2 2.1％ 1.9％
17 165.8 162.3 163.4 -1.4％ 0.7％
18 185.6 181.5 186.7 0.6％ 2.9％
19 211 208.5 213.6 1.2％ 2.4％
20 239.6 233.6 235.1 -1.9％ 0.6％
由表12、图1、图2可看出，本发明的1,5-AG检测试剂盒在线性范围内测试临床与国产(九强)、进口(KYOWAMEDEX)两种对照试剂盒的偏差小。特别地，在临床上高血糖或糖尿病患者的1,5-AG水平(通常<85.29μmol/L)低于健康人群，本发明对低值样本的测试偏差基本在10％以内，准确度测试良好。
将实施例2、实施例3中本发明其他试剂(配方3-6)与实施例1中R2试剂组成的试剂盒进行线性范围、精密度和准确度相关性验证，结果与实施例1的试剂盒效果相同或接近，无显著差异。
综上所述，使用本发明提供的检测试剂测定血液中的1,5-AG水平，操作简单、空白背景信号低、结果可靠，通过改进试剂组成在降低试剂成本的同时，可有效清除血液中的葡萄糖干扰。
以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (10)

1.一种消除内源性葡萄糖干扰的试剂，其特征在于，包括缓冲液、己糖/葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、ATP、NADP、丙酮酸或丙酮酸钠和磷酸肌酸或磷酸肌酸钠。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，包括20-100 mmol/L缓冲液、1-10KU/L己糖/葡萄糖激酶、5-30KU/L6-磷酸葡萄糖脱氢酶、50-100 KU/L乳酸脱氢酶、1-10KU/L肌酸激酶、0.5-10 mmol/L ATP、1.5-8mmol/L NADP、8-20 mmol/L丙酮酸或丙酮酸钠和5-30 mmol/L磷酸肌酸或磷酸肌酸钠。
3.根据权利要求1或2所述试剂，其特征在于，还包括酶保护剂、酶促进剂、防腐剂和抗VC干扰剂中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述试剂，其特征在于，所述酶保护剂选自蔗糖、甘氨酸、牛血清白蛋白和表面活性剂中的一种或两种以上；所述酶促进剂选自氯化镁、硫酸镁、氯化钾中的一种或两种以上；所述抗VC干扰剂为抗坏血酸氧化酶；所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、庆大霉素、Proclin系列、苯甲酸钠中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1或2所述试剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸-硼酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液或双甘氨肽缓冲液。
6.权利要求1-5任意一项所述试剂在制备检测1,5-AG的试剂盒中的应用或在消除内源性葡萄糖干扰中的应用。
7.一种检测1,5-AG的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5任意一项所述试剂，以及利用氧化酶法或脱氢酶法检测1,5-AG的试剂。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述利用氧化酶法检测1,5-AG的试剂包括缓冲液、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林和能够与4-氨基安替比林发生Trinder反应的色原物质。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述能够与4-氨基安替比林发生Trinder反应的色原物质为TOOS。
10.一种消除内源性葡萄糖干扰的方法，其特征在于，包括：
步骤1、葡萄糖和ATP在己糖/葡萄糖激酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸和ADP；
步骤2、磷酸肌酸或磷酸肌酸钠与步骤1生成的ADP在肌酸激酶的作用下生成肌酸和ATP；生成的ATP循环用于步骤1；
葡萄糖-6-磷酸和NADP在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下生成6-磷酸葡萄糖酸内酯和NADPH；丙酮酸或丙酮酸钠和NADPH在乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸和NADP；生成的NADP循环使用。
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