CN106868096A

CN106868096A - 一种稳定性强且成本低的己糖激酶法葡萄糖检测试剂

Info

Publication number: CN106868096A
Application number: CN201510919960.2A
Authority: CN
Inventors: 包兴艳; 罗维晓; 谭柏清; 李志明
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2035-12-14
Also published as: CN106868096B

Abstract

本发明涉及一种己糖激酶法检测血液GLU检测技术领域，特别涉及一种稳定性强且成本低的液态己糖激酶法血液GLU检测试剂。本发明为液体的双试剂，试剂1中的主要含量为缓冲液、Mg2+、离子平衡剂、防腐剂、NAD(氧化型性辅酶I)、保护剂、表面活性剂，试剂2的组成成分有缓冲液、保护剂、表面活性剂、防腐剂、己糖激酶（HK）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）、ATP.NA2等。本发明为了保障试剂中酶类的稳定性，在试剂中有针对性的添加了聚乙烯二醇2万、吐温-80、FAD等多种保护剂，为了降低成本，尤其是降低酶类的使用，在试剂中添加了多种表面活性剂，增加对酶类的乳化以及提高酶的使用效率，从而大大降低了试剂的成本，非常方便于临床中的使用和推广。

Description

一种稳定性强且成本低的己糖激酶法葡萄糖检测试剂

技术领域

本发明涉及一种稳定性强的己糖激酶法检测试剂，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

血清中的糖称为血糖，绝大多数情况下都是葡萄糖。体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要。正常人在清晨空腹血糖浓度为80～120毫克%。空腹血糖浓度超过130毫克%称为高血糖。如果血糖浓度超过160～180毫克%，就有一部分葡萄糖随尿排出，这就是糖尿。血糖浓度低于70毫克%称为低血糖。葡萄糖存在于人体的血浆和淋巴液中，是生命活动中不可缺少的物质，它在人体内能直接参与新陈代谢过程。在消化道中，葡萄糖比任何其它单糖都容易被吸收，而且被吸收后能直接被人体组织利用。人体摄取的低聚糖(如蔗糖)和多糖(如淀粉)也都必须先转化为葡萄糖之后，才能被人体组织吸收和利用。由于血糖浓度是许多疾病的病症诊断、鉴别诊断、病情观察、治疗监控和疾病预防等必不可少的首选指标，因此，对其准确测定具有重要意义。

血清葡萄糖检测方法众多，检测方法主要有氧化酶偶联，比色法，微电流法，氧速率法，已糖激酶法，邻甲苯胺法，葡萄糖脱氢酶法，气相、色谱、同位素稀释质谱法，微创测定法等，其中在医学中最常用的使用方法为氧化酶法和己糖激酶法，其他方法多数准确度差，成本较高，操作复杂，对仪器和操作人员要求较高等因素，真正使用的较少，而现在使用较多的为氧化酶法，由于检测过程中尿酸、维生素C、胆红素等可与色原性物质竞争过氧化氢而抑制反应，引起结果偏低，且此法线性范围较窄，给临床中的应用带来很大的不变，而己糖激酶法测定血清中葡萄糖，针对于具有轻度溶血、脂血、黄疸，维生素C、氟化钠、肝素、EDTA和草酸盐等不易干扰本法测定，适用于自动分析仪，是目前国际上公认的参考方法，可以非常好的弥补氧化酶法检测血液葡萄糖的缺陷，但是本检测方法中涉及到己糖激酶（HK）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）以及ATP等原材料，这些原材料多半需要以干粉的状态储存在-20℃环境下，一旦配置成试剂则容易衰减，现有的一些产品多为制作成干粉状或者增加试剂中的主要成分的含量来减缓液态试剂中主要成分的衰减，干粉的试剂则需要在使用前复溶，给操作带来不便，且一旦复溶则需要尽快使用完，不然会在短期内失效，而增加主要原材料的量则会大大增加成本，但是也无法从根本上保护试剂中的有效成分，因此发明一种稳定的低成本的液态己糖激酶法检测血清葡萄糖检测试剂具有很大的前景。

本发明以现有的己糖激酶法检测血液葡萄糖（GLU）的方法，发明了一种稳定性强且成本低的己糖激酶法葡萄糖（GLU）检测试剂。

发明内容

本发明涉及一种稳定性强的且成本低的己糖激酶法葡萄糖（GLU）检测试剂，以及检测方法。

基本原理：

己糖激酶在ATP存在时能催化葡萄糖变成6-磷酸葡萄糖和ADP，6-磷酸葡萄糖在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态，NADP）存在的情况下，由6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化生成6-磷酸葡萄糖酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态，NADPH），后者在340nm波长处有吸收峰，其峰值的高低与葡萄糖含量成正比：

HK

第一步：葡萄糖+ATP葡萄糖-6-磷酸+ADP；

G6P-DH

第二步：葡萄糖-6-磷酸+NAD+6-磷酸葡萄糖酸+NADH+H+。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种稳定性强的且成本低的己糖激酶法葡萄糖（GLU）检测试剂组成成分如下：

试剂1(R1)的组成成分：

缓冲液_{··········································}100mmol/L

Mg2+_{··········································}..2mmol/L-4 mmol/L

离子平衡剂_{······································}2g/L-5g/L

防腐剂_{··········································}0.1g/L-1g/L

NAD(氧化型性辅酶I)_{······························}0.5mmol/L-1 mmol/L

保护剂_{··········································}5g/L-10g/L

表面活性剂1_{·····································}1ml/L-5ml/L

表面活性剂2_{·····································}1ml/L-5ml/L

试剂2(R2)的组成成分：

缓冲液_{··········································}10mmol/L

保护剂1_{·········································}10g/L-20 g/L

保护剂2_{········································}.2ml-5ml/L

保护剂3_{·········································}1mg/L-3mg/L

表面活性剂_{·········}._{····························}1ml/L-3ml/L

防腐剂_{···············}._{··························}0.1g/L-1g/L

己糖激酶（HK）_{····································}100U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）_{·····················}80U/L

ATP.NA2_{·········································}4mmol/L。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1中缓冲液为25℃，PH=7.4的浓度为100mmol/L的TRIS（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2中缓冲液为25℃，PH=8.6的浓度为50mmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1中所述离子平衡剂为硫酸钠。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1所述防腐剂为叠氮钠。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2所述防腐剂为MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3酮盐酸盐)。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1所述保护剂为海藻糖。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1所述的表面活性剂1为Pluorinic F68（上海西宝）。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R1所述的表面活性剂2为Tetronic 1307（上海西宝）。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2中所述的保护剂1为聚糖2万。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2中所述的保护剂2为吐温-80。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2中所述的保护剂3为FAD。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，试剂R2中所述的表面活性剂为曲拉通-100。

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340nm。

所述的试剂为液态双试剂，试剂比例为4:1。

本发明的创新处：

1）本发明在试剂R2缓冲体系的建立中，优先选择了PH为8.6弱碱性的甘氨酸-NaOH缓冲液作为缓冲液，在起到基本的缓冲能力之外，弱碱性的缓冲液有利于ATP.NA2的保存，并且甘氨酸缓冲液能够对蛋白类酶有较好的保护作用；

2本发明在试剂R2中优先选择了MIT（2-甲基-4-异噻唑啉-3酮盐酸盐）作为防腐剂，在保证良好的除菌防腐的同时，不会对酶类的活性产生抑制作用；

3）在试剂R1中优先选择了硫酸钠作为离子平衡剂，能够对体系产生良好的平衡作用，有效的平衡大分子的带电物质对反应的干扰；

4）在试剂R1中依次加入了Pluorinic F68，Tetronic 1307能够起到良好的增溶作用，并且非溶血性，溶剂兼容，抗静电，良好的消泡剂和分散剂，能够在反应中能够促进和放大HK(己糖激酶)和G6PD（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）的活性，使反应中使用非常少的量就可以达到非常好的催化效果；

5）本发明在试剂R2中添加了吐温-80、聚乙烯2万和NADH2三种保护剂，吐温-80能够较好保护ATP.NA2不衰减，聚乙烯二醇2万和FAD的配合则能够非常好的保护试剂中的两种酶；

6)本发明中的R2检测试剂中己糖激酶(HK)只有100U/L，而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）只有80U/L，而试剂的比例为4:1，最终参加反应的酶分别为HK为20U/L和G6PD为16U/L，有效的降低了试剂的成本。

附图说明

图1实施例1和实施例2检测结果相关性图，

图2实施例1和实施例3检测结果相关性图，

图3 为15天开瓶稳定性实验验证结果曲线变化图，

图4 为37℃ 7天热稳定性实验验证结果曲线变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一种现有的干粉的己糖激酶法葡萄糖检测试剂：

试剂1(R1)：

Tris 80mmol/L

硫酸镁 4mmol/L

腺苷三磷酸（ATP） 1.7mmol/L

NAD+ 1.7mmol/L

试剂2(R2)：

己糖激酶（HK） ≥3500U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH） ≥4000U/L。

实施例2

所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂组成如下：

PH=7.4，TRIS(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液_{··················}100mmol/L

Mg2+_{·················································}2mmol/L

硫酸镁_{···············································}2g/L

叠氮钠_{···············································}0.1g/L

NAD(氧化型性辅酶I)_{···································}0.5mmol/L

海藻糖_{···············································}5g/L

Pluorinic F68，_{·······································}1ml/L

Tetronic 1307_{········································}1ml/L

试剂2(R2)的组成成分：

PH=8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液_{····························}50mmol/L

聚糖2万_{··············································}10g/L

吐温-80；_{···································}....._·····1mg/L

FAD_{··················································}0.1g/L

曲拉通-100_{···········································}0.1ml/L

MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3酮盐酸盐)_{·····················}0.1g/L

己糖激酶（HK）_{·········································}100U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）_{··························}80U/L

ATP.NA2_{···········································}...4mmol/L。

实施例3

1)所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试中组分增加后的方案：

试剂1(R1)的组成成分：

PH=7.4，TRIS(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液_{·················}100mmol/L，

Mg2+_{················································}4 mmol/L

硫酸镁_{··············································}5g/L

叠氮钠_{··············································}1g/L

NAD(氧化型性辅酶I)_{··································}1 mmol

海藻糖_{··············································}10g/L

Pluorinic F68，_{······································}5ml/L

Tetronic 1307_{·······································}5ml/L；

试剂2(R2)的组成成分：

PH=8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液_{···························}50mmol/L

聚糖2万_{·············································}20 g/L

吐温-80；_{············································}3ml/L

FAD_{·················································}1g/L

曲拉通-100_{········································}._·1ml/L

MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3酮盐酸盐)_{····················}1g/L

己糖激酶（HK）_{········································}100U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）_{·························}80U/L

ATP.NA2_{·············································}4mmol/L；

2）校准品和质控品:

校准品：朗道复合标准品，其中GLU(HK)的含量为6.39mmol/L

质控品：朗道复合中值质控品：靶值：7.02mmol/L，靶值范围：6.02-8.14mmol/L

朗道复合高值质控品：靶值：15.6mmol/L，靶值范围：13.3-17.9mmol/L

3)试剂稳定性验证具体操作方法：

（1）关于试剂的稳定性验证，将分为试剂的15天开平稳定性和7天37℃热稳定性验证

首先将本实施例中的检测试剂和实施例1中的检测试剂，按照配方配置好，分别取相同的两组，一组做15天开瓶稳定性，将试剂开瓶放置在仪器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作为15天开瓶稳定性检测，另一组做37℃热稳定性，封闭放置在37℃恒温水浴锅中（每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37℃水浴锅中，连续7天），作为7天37℃热稳定性验证。将试剂同时在日立7180全自动生化分析仪器上，按照如下表1方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。分别取高、低质控，各自平均分成15份，4℃储存，每天高、低值质控各取一个，并且跟踪检测结果，其跟踪监测趋势如附图1和附图2；

（2）试剂检测使用方法：

本实施例描述的所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，采用全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，将实施例1、实施例2和实施例3中的试剂利用两点终点法，按照表1中的要求进行测定，由于实施例1中的试剂为干粉状，首先要使用蒸馏水或超纯水进行溶液，溶解完全后同样按照表1中的检测方法进行检测；

表1 试剂检测方法

计算：己糖激酶法检测试剂的含量（µmol/L）＝（∆A测定÷∆A标准）×C标准

（3）通过附图1和附图2中的曲线变化明显能够发现，实施例2和实施3中的单试剂明显比实施例1中的试剂混合后要稳定很多，从而证明了本发明的对于产品的稳定性的效果；

（4）相关性实验：

利用实施例2和实施例3中的配方配制试剂，与实施例1中干粉的试剂进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表2所示。并获得了两种试剂分别与实施例1检测结果的相关性曲线（如图1和图2所示），通过检测结果显示，实施例2以及实施例3与实施例1检测己糖激酶法检测血清的GLU相关系数分别为0.9994和0.999，说明了虽然实施例2和实施例3试剂中酶类的含量非常少但是检测结果依然较好，与实施例1中的相关性非常好。

表2 实施例1试剂、实施例2试剂、实施例3试剂检测血清对比检测结果

Claims

1.1)一种稳定性强的且成本低的己糖激酶法葡萄糖（GLU）检测试剂组成成分如下：

试剂1(R1)的组成成分：

PH=7.4, TRIS(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液_{··················}100mmol/L

Mg2+_{··················································}2mmol/L-4 mmol/L

离子平衡剂_{············································}2g/L-5g/L

叠氮钠_{················································}0.1g/L-1g/L

NAD(氧化型性辅酶I)_{····································}0.5mmol/L-1 mmol/L

保护剂_{················································}5g/L-10g/L

表面活性剂1_{···········································}1ml/L-5ml/L

表面活性剂2_{···········································}1ml/L-5ml/L

试剂2(R2)的组成成分：

缓冲液_{················································}10mmol/L

保护剂1_{···············································}10g/L-20 g/L

保护剂2_{···············································}2ml-5ml/L

保护剂3_{············································}.._·1mg/L-3mg/L

表面活性剂_{············································}1ml/L-3ml/L

防腐剂_{················································}0.1g/L-1g/L

己糖激酶（HK）_{··········································}100U/L

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）_{···························}80U/L

ATP.NA2_{···············································}4mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂R2中缓冲液PH=8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂2中所述防腐剂为MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3酮盐酸盐)。

4.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂R1中所述离子平衡剂为硫酸钠。

5.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂R1所述保护剂为海藻糖。

6.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂R1中所述的表面活性剂1为Pluorinic F68（上海西宝），表面活性剂2为Tetronic 1307（上海西宝）。

7.根据权利要求1所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，其特征在于试剂R2中所述的保护剂1聚乙二醇2万，保护剂2为吐温-20，保护剂3为FAD。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的一种稳定性强且成本低的己糖激酶法血液葡萄糖（GLU）检测试剂，来检测血液GLU，,其特征在于使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为340,试剂为液态双试剂，试剂比例为4:1。