CN104198717A - 一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法，冻干微球包含三乙醇胺缓冲液、ATP、NADP、己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、防腐剂、海藻糖、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000、TrionX-100等。其制备过程主要有以下步骤：（1）配制溶液，过滤、脱气；（2）利用精确定量的分液系统制备微滴，并将微滴滴入液氮中制备冷冻小球；（3）将冷冻小球转移至冻干机中冻干得到检测试剂冻干微球。本发明提供的葡萄糖检测试剂是一种球形颗粒状冻干试剂，可预封装与检测芯片中，同已有的液体检测试剂相比具有可实现室温稳定保存、运输等优点，同冻干粉试剂相比具有定量准确、便于封装处理等优点。

Description

一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及冻干微球及其制备领域，具体是一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法。
背景技术
血液中的糖主要是葡萄糖，它是糖在体内的运输形式。正常人在空腹血糖浓度为3.61～6.11mmol/L。空腹血糖浓度超过7.0mmol/L称为高血糖。血糖浓度低于3.61mmol/L称为低血糖。血糖量维持在一定水平恒定，对于保证人体各组织器官特别是脑组织的正常机能活动极为重要。血糖高低同人体机能密切相关，因此，检测血糖含量对临床诊断治疗具有重要意义。
随着社会的不断进步，医学检验从大医院向社区、现场等即时诊断领域发展。即时血糖检测发展迅速，即时血糖检测可用于紧急情况下血糖检测，例如在急诊室、急救车等众多条件有限、但仍然需要迅速得出检测结果的场景应用。微流控芯片技术的进步极大促进了即时诊断仪器的发展。微流控芯片技术把样品的制备、分离、反应和检测等集成于一块芯片上，由微通道形成网络，进而实现整个系统流体的精确控制。将微流控芯片技术引入到POCT设备，可使以往实验室繁复的操作在芯片上自动完成，而且仪器构造相对简单，体积小，重量轻，操作简单，适合床旁检测、战场或小型门诊的需要。
目前，在欧美市场上，即时血糖检测仪器已经逐渐成为体外诊断试剂与仪器领域的重要研究项目，并有不少产品投入市场。但这些仪器和相应的试剂耗材价格高昂，出于成本考虑，这些仪器尚未能在中国推广应用。十二五国家战略性产业发展规划中，明确提出要建立操作简单、装置便携、测量准确的即时检测仪器。现有的葡萄糖液体检测试剂不易封装和贮存，冻干粉试剂不易定量，均不适用于即时检测仪器，亟需一种可用于基于微流控技术的即时检测仪器的葡萄糖检测试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法，以解决现有技术液体和冻干粉葡萄糖检测试剂存在的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：其反应试剂和缓冲液组分及各组分重量配比为：
该试剂冻干微球的其他组分如冻干保护剂和冻干塑型剂等组成为：
所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述反应试剂为缓冲液，可选用三乙醇胺缓冲液，或者Tris缓冲液，或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述冻干保护剂为糖类、聚合物、表面活性剂中的一种或几种，其中：
糖类优选海藻糖，或者蔗糖，糖类含量约为5g/L-30g/L；
聚合物优选聚乙二醇，或者聚乙烯吡咯烷酮，或者牛血清白蛋白，或者葡聚糖，聚合物含量约为30g/L-100g/L；
表面活性剂优选吐温80，或者吐温20，或者聚氧乙烯月桂醚，或者TrionX-100，表面活性剂含量约为1-10g/L。
所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述冻干塑型剂优选甘露醇，或者聚乙二醇，或者牛血清白蛋白，或者聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇同时具有冻干塑型剂和保护剂作用。
所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：试剂中反应试剂和缓冲液组分为常规试剂反应试剂和缓冲液浓度的2-4倍。
一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、配制葡萄糖检测试剂；
(2)、添加冻干保护剂和塑型剂，充分溶解后过滤除去不溶性物质，真空脱气去除气泡；
(3)、利用可精确定量的分液系统制备微滴，将液滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球；
(4)、将冷冻试剂微球转入冻干机中冷冻干燥后制备得到检测试剂冻干微球。
所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的液滴体积大小利用分液系统精确控制，液滴大小在2-10ul，大小误差在2％内。
本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明的葡萄糖检测试剂冻干微球，可以实现室温的稳定保存，可以有效解决现有液体葡萄糖试剂无法室温稳定保存，不易封装于即时诊断仪器中问题。
2、本发明的葡萄糖检测试剂微球，大小形态均一，实现了试剂的精确定量，而且采用的微球性状使试剂取用更加方便，便于封装，解决了现有冻干粉末试剂不易封装定量的问题。
3、本发明的葡萄糖检测试剂微球包含反应所需的反应试剂和缓冲液，而且全部组分为正常试剂的2-3倍浓度，使用时只需加入样品溶解即可，最大限度的简化了操作步骤，特别适用于试剂预封装的即时诊断仪器。
附图说明
图1、实施例1、2葡萄糖检测试剂冻干微球，其中：图1a为实施例1图，图1b为实施例2图。
图2、实施例1、2葡萄糖检测试剂冻干微球同液体试剂测试结果对比图。
具体实施方式
一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其反应试剂和缓冲液组分及各组分重量配比为：
该试剂冻干微球的其他组分如冻干保护剂和冻干塑型剂等组成为：
反应试剂为缓冲液，可选用三乙醇胺缓冲液，或者Tris缓冲液，或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
冻干保护剂为糖类、聚合物、表面活性剂中的一种或几种，其中：
糖类优选海藻糖，或者蔗糖，糖类含量约为5g/L-30g/L；
聚合物优选聚乙二醇，或者聚乙烯吡咯烷酮，或者牛血清白蛋白，或者葡聚糖，聚合物含量约为30g/L-100g/L；
表面活性剂优选吐温80，或者吐温20，或者聚氧乙烯月桂醚，或者TrionX-100，表面活性剂含量约为1-10g/L。
冻干塑型剂优选甘露醇，或者聚乙二醇，或者牛血清白蛋白，或者聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
试剂中反应试剂和缓冲液组分为常规反应试剂和缓冲液浓度的2-4倍。
一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球制备方法，包括以下步骤：
(1)、配制葡萄糖检测试剂；
(2)、添加冻干保护剂和塑型剂，充分溶解后过滤除去不溶性物质，真空脱气去除气泡；
(3)、利用可精确定量的分液系统制备微滴，将液滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球；
(4)、将冷冻试剂微球转入冻干机中冷冻干燥后制备得到检测试剂冻干微球。
步骤(3)中的液滴体积大小利用分液系统精确控制，液滴大小在2-10ul，大小误差在2％内。
本发明可用于即时检测仪器的葡萄糖检测试剂冻干微球是按以下技术方案实现的：一种可用于即时检测仪器的葡萄糖检测试剂冻干微球，主要成分为反应试剂、缓冲液、冻干保护剂、塑型剂等，具体如下：
其制备方法如下：
将检测试剂中各组分按照配方比例加入蒸馏水后混合搅拌均匀，配制葡萄糖检测试剂，过滤器过滤去除不溶性物质，真空脱气去除溶液中的气泡。利用分液泵将溶液滴入液氮中，冷冻制备得到冷冻溶液小球，转入冻干机中，冻干制备得到检测试剂冻干微球。
本发明所述检测试剂溶液各组分，表面活性剂为TrionX-100、聚氧乙烯月桂醚、聚乙二醇、吐温80的一种或几种；防腐剂为羟甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟甲基苯甲酸丙酯等中的一种。
反应试剂中的缓冲液为三乙醇胺缓冲液、Tris缓冲液或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种。
反应试剂中的冻干保护剂为糖类、聚合物、氨基酸、多元醇类中的一种或几种，其中糖类主要为海藻糖、蔗糖等，聚合物类主要为聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白等，氨基酸类主要为甘氨酸，多元醇类主要为甘露醇、山梨醇等。
葡萄糖检测试剂各组分为常规液体葡萄糖检测试剂组分的三倍，且检测试剂中包含反应试剂和缓冲液，使用时直接加相应体积的蒸馏水溶解即可。
葡萄糖检测试剂的反应原理为：将全血样品用等渗溶液稀释后，离心去除血细胞，然后将上清移到预封装有检测试剂冻干微球的反应杯中，溶解试剂微球并同反应试剂反应。在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与ADP。前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时使NADP还原成NADPH。反应式如下：
根据反应方程式，NADPH的生成速率与葡萄糖浓度呈正比，在波长340nm监测吸光度升高速率，计算血清中葡萄糖浓度。
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
一种葡萄糖检测试剂冻干微球及其制备方法，主要由以下步骤构成：
(1)配制3倍浓缩葡萄糖检测试剂，其具体配方如下：
实施例1表1、葡萄糖检测试剂组成
成分 浓度
三乙醇胺缓冲液 150mM
ATP 6mM
NADP 6mM
己糖激酶 15KU/L
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 6KU/L
羟甲基苯甲酸甲酯 1g/L
聚乙二醇8000 20g/L
聚乙二醇20000 40g/L
海藻糖 15g/L
表面活性剂Trion X-100 3g/L
实施例2表2、葡萄糖检测试剂组成
成分 浓度
三乙醇胺缓冲液 150mM
ATP 6mM
NADP 6mM
己糖激酶 15KU/L
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 6KU/L
羟甲基苯甲酸甲酯 1g/L
聚乙二醇4000 30g/L
聚乙二醇80000 30g/L
海藻糖 10g/L
表面活性剂Trion X-100 3g/L
葡萄糖检测试剂中的表面活性剂TrionX-100，可以有效控制试剂微球溶解过程中的气泡产生；试剂中的冻干保护剂可以采用蔗糖、海藻糖、聚乙二醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、葡聚糖中一种或多种，其含量可根据检测试剂冻干微球形态和溶解性而确定。
(2)将上述浓缩的葡萄糖检测试剂通过可精确计量的流体注液系统制备微滴：将配制好的溶液通过流体注液系统进行制备微滴，微滴大小可根据需求控制，例如2ul、6ul、10ul等，本实施例中优选为每滴液体体积6ul，液滴大小偏差在2％以内。
(3)将液滴滴入液氮中，液滴与液氮接触后，液氮局部快速吸热汽化，形成氮气流并使液滴浮在液氮表面。待液滴完全固化后，冷冻形成的试剂小球沉入液氮底。在液氮完全固化前，两个液滴会发生融合、粘连等情况，本发明通过利用多孔板等空间隔离方法，有效的防止了液滴粘连融合。
(4)将装有冷冻小球的多孔板转移至冻干机中冷冻干燥，具体干燥过程为0.25mbar8h，0.05mbar6h。
(5)冻干结束后，取出检测试剂冻干微球，干燥密闭封装于试剂瓶或检测芯片中。
检测制备的试剂冻干微球，其性能如下：
1、冻干微球大小均一性、外观等，如图1所示，本实施例得到的葡萄糖检测试剂冻干微球外观光滑、大小均一、溶解迅速、强度较好，复溶后得到的试剂稳定性较好。
2、线性及检测灵敏度：以不同浓度的葡萄糖检测试剂标准样品检测试剂冻干微球性能，并将其同液体葡萄糖检测试剂比较，如图2：
从上述检测结果可知，本发明葡萄糖检测试剂冻干微球大小均一、外观光滑，具有同液体葡萄糖检测试剂相近的灵敏度、线性度，可满足即时诊断等领域的要求。

Claims (7)

1.一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：其反应试剂和缓冲液组分及各组分重量配比为：
三乙醇胺缓冲液       100 mM -300mM，
ATP                  4mM-8mM，
NADP                4mM-8mM，
己糖激酶             5KU/L-30KU/L，
6-磷酸葡萄糖脱氢酶    2KU/L-10KU/L，
防腐剂                1g/L-10g/L，
该试剂冻干微球的其他组分如冻干保护剂和冻干塑型剂等组成为：
聚乙二醇8000         10g/L-40g/L，
聚乙二醇20000        20g/L-60g/L，
海藻糖                5g/L-30g/L，
Trion X-100            1g/L-5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述反应试剂为缓冲液，可选用三乙醇胺缓冲液，或者Tris缓冲液，或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述冻干保护剂为糖类、聚合物、表面活性剂中的一种或几种，其中：
糖类优选海藻糖，或者蔗糖，糖类含量约为5g/L-30g/L；
聚合物优选聚乙二醇，或者聚乙烯吡咯烷酮，或者牛血清白蛋白，或者葡聚糖，聚合物含量约为30g/L-100g/L；
表面活性剂优选吐温80，或者吐温20，或者聚氧乙烯月桂醚，或者Trion X-100，表面活性剂含量约为1-10g/L。
4.根据权利要求1所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述冻干塑型剂优选甘露醇，或者聚乙二醇，或者牛血清白蛋白，或者聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇同时具有冻干塑型剂和保护剂作用。
5.根据权利要求1所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球，其特征在于：所述试剂中反应试剂和缓冲液组分为常规试剂反应试剂和缓冲液浓度的2-4倍。
6.一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）、配制葡萄糖检测试剂；
（2）、添加冻干保护剂和塑型剂，充分溶解后过滤除去不溶性物质，真空脱气去除气泡；
（3）、利用可精确定量的分液系统制备微滴，将液滴滴入液氮中，经液氮冷却后形成冷冻试剂微球；
（4）、将冷冻试剂微球转入冻干机中冷冻干燥后制备得到检测试剂冻干微球。
7.根据权利要求6所述的一种浓缩葡萄糖检测试剂冻干微球制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的液滴体积大小利用分液系统精确控制，液滴大小在2-10ul，大小误差在2%内。
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