CN104721138A - 一种光甘草定冻干脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光甘草定冻干脂质体及其制备方法，光甘草定冻干脂质体的构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、磷酸盐缓冲液70～120份；其制备方法为⑴称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中并使用无水乙醇使其溶解；⑵将茄形瓶减压蒸发溶剂；⑶制得光甘草定溶液；⑷形成光甘草定磷酸盐溶液；⑸制备光甘草定冻干脂质体混悬液；⑹采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体；⑺通过冷冻干燥仪抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。本发明设计合理，制备出的光甘草定冻干脂质体具有非常强的体外透皮吸收性能，为光甘草定冻干脂质体技术应用于生物医药行业提供实验依据。

Description

一种光甘草定冻干脂质体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是一种透皮性能优良的光甘草定冻干脂质体的制备方法。 

背景技术

随着科学技术、仪器和方法学的迅速发展，人们对于自身的认识越来越深刻，对于皮肤生理病理的研究已经深入到基因和分子生物学水平，对相关生物医药产业的发展产生了巨大的推动作用，许多具有生物活性的动植物成分和生物高分子成分已经应用到生物医药行业，取得了巨大的社会和经济效益。

但是，如何将这些具有生物活性的成分应用到生物医药领域中，面临着许多难题，主要表现在以下方面：1、这些生物活性物质的稳定性问题，除了由其自身的结构和空间构象决定外，外界环境因素的影响也不容小视，例如表皮活性因子溶液，在外界环境中的活性持续时间有短短的数小时，在其被皮肤吸收发挥作用之前就基本失活了，根本不能发挥其应有的作用和效果。2、高分子成分难于被人体皮肤吸收的问题，通常来说，活性物分子量越小，越容易透过皮肤，一旦分子量大于600，活性物就很难被皮肤吸收了，而近年来应用的具有特定皮肤活性功能的物质大多数是肽类等高分子物质，其分子量少则数千，多则数十万，这就决定了它们很难透过皮肤从而被有效吸收。3、生物活性物质的可溶性问题，大部分有效成分不能溶于水被皮肤表层吸收，很难发挥其作用。

光甘草定能够加速血液流动，促使排汗，带走体内多余的热量，具有排毒、养颜、减肥的作用，但是由于上述原因，很难被皮肤吸收，难以发挥其应有的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种设计合理、透皮性能优良的光甘草定冻干脂质体的制备方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种光甘草定冻干脂质体，其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、磷酸盐缓冲液70～120份。

而且，所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.5。

一种光甘草定冻干脂质体的制备方法，包括以下步骤：

⑴称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解；

⑵将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥使溶剂除尽；

⑶将光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用；

⑷将磷酸盐缓冲液加入到光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液；

⑸将占0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到步骤⑵含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液；

⑹采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状；

⑺将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。

一种光甘草定冻干脂质体，其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、冻干保护剂0.5～3份，磷酸盐缓冲液70～120份。

而且，所述的冻干保护剂为低浓度甘氨酸。

一种光甘草定冻干脂质体的制备方法，包括以下步骤：

⑴称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解；

⑵将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥使溶剂除尽；

⑶将光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用；

⑷将磷酸盐缓冲液及冻干保护剂加入到光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液；

⑸将占0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到上述含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液；

⑹采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状；

⑺将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。

本发明的优点和积极效果是：

本发明以光甘草定为模型成分，并以大豆磷脂、胆固醇作为脂质体原料，采用挤出-冻干法制备出透皮性能优良的光甘草定冻干脂质体，通过光甘草定冻干脂质体的外观、pH、粒径、表面电荷等基本数据，以及包封率和载药量检测、体外释放和透皮吸收试验表明，本发明的光甘草定冻干脂质体具有非常强的体外透皮吸收性能，为光甘草定冻干脂质体技术应用于生物医药行业提供实验依据。

具体实施方式

以下结合实例对本发明做进一步描述。

一种光甘草定冻干脂质体，其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、PBS缓冲盐（pH 7.2～7.5）70～120份。

一种光甘草定冻干脂质体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按比例精密称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解。

（2）将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥过夜，使溶剂除尽。

（3）按光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用。

（4）将磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2～7.5）加入到步骤（3）制得的光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液，磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2～7.5）与光甘草定溶液的体积比为7～8：0.3～0.8。

（5）将占 0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到上述含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液。

（6）采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于磨口圆底烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状。

（7）将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。

一种光甘草定冻干脂质体，其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、冻干保护剂0.5～3份，PBS缓冲盐（pH 7.2～7.5）70～120份。

光甘草定冻干脂质体与前述光甘草定冻干脂质体的区别在于加入了冻干保护剂，该冻干保护剂采用低浓度甘氨酸，由于氨基酸离子具有酸、碱两性，可抑制磷酸缓冲盐结晶，在冷冻干燥过程中抑制pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。

一种光甘草定冻干脂质体的制备方法，包括以下步骤：

（1）按比例精密称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解。

（2）将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥过夜，使溶剂除尽。

（3）按光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用。

（4）按比例将磷酸盐缓冲液（PBS pH 7.2～7.5）及冻干保护剂（低浓度甘氨酸）加入到步骤（3）制得的光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液。

（5）将占 0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到上述含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液。

（6）采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于磨口圆底烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状。

（7）将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。

下面对光甘草定冻干脂质体(光甘草定冻干脂质体)的理化性质说明：

（1）外观性质。

目测：光甘草定冻干脂质体混悬液为均匀淡黄色；光甘草定冻干脂质体（未加冻干保护剂）为淡黄色海绵状松散粉末或块状；光甘草定冻干脂质体(加入冻干保护剂)为流动性良好的白色粉末。

在电镜下观察：制备的脂质体为小多室脂质体；扫描电镜下，未加冻干保护剂的脂质体为白色蜡块状，加冻干保护剂的脂质体为白色球状。

（2）一般理化性质(pH、粒径和表面电荷)：光甘草定冻干脂质体的pH为7.08，粒径70.16nm，Zeta电位为-63.9mV（阳离子表面吸附的缓冲液中的阴离子的表现）。

下面通过HPLC方法对光甘草定冻干脂质体的光甘草定含量进行检测：

样品处理：精密量取样品500μl，加入100μl 10%TritonX-100，涡旋混合2min，10000rpm离心4min，取上清液20μl 进样，在色谱条件下分析，记录峰面积，用外标法计算光甘草定含量。

色谱固定相：Waters SYMMETRY C18 5μm 色谱柱（250mm×4.6mm）；流动相：甲醇-水（58:42V/V）,流速 1ml/min；检测波长205nm；柱温35℃；进样量20μl。光甘草定保留时间约为8.8min。

特异性：空白脂质体+10%TritonX-100、光甘草定对照品+10%TritonX-100分别进样，发现脂质成分和TritonX-100对光甘草定检测无干扰，本方法具有良好的特异性。

精密度：在空白脂质体中加入不同量的光甘草定配置成低、中、高（30、200、700.0μg/ml）不同浓度PBS（1-10）溶液，每个浓度各6个样品，按上述分别测定日内、日间变异，结果见表1。

表1 HPLC测定空白脂质体PBS（1-10）溶液中光甘草定的精密度

回收率：按精密度方法配成低、中、高三个浓度的空白脂质体PBS（1-10）溶液样品各6个，按同样的方法测定回收率，结果见表2。

表2 HPLC测定空白脂质体PBS（1-10）溶液光甘草定的回收率（%）

标准曲线：在空白脂质体PBS（1-10）溶液中精密加入不同量的光甘草定对照品溶液，使其浓度分别为30、50、100、200、400、800.0μg/ml。按样品处理与测定方法进行测定，以样品浓度（X）与峰面积比（Y）进行回归，得回归方程：Y=20.65X-270.16,R=0.99954,表明光甘草定在30.0～800.0μg/ml范围内呈良好线性关系。

样品稳定性：将配置的低、中、高三种浓度的光甘草定在空白脂质体PBS（1-10）溶液中样品，分别在室温、4℃放置24小时以及冻融三次后检测其含量，结果见表3。

表3光甘草定样品室温条件下放置稳定性

上述实验结果表明，采用HPLC方法测定制剂中的光甘草定方法，脂质成分和TritonX 不干扰样品峰，相对回收率均大于90.0%，日内和日间相对标准差均小于5.0%，光甘草定样品定量线性范围为30.0～800.0μg/ml，说明光甘草定的高效液相色谱分离分析方法的准确度、精密度、专属性及定量线性等均符合制剂的分析要求，可以用于制剂中光甘草定样品的检测。

下面对光甘草定冻干脂质体中光甘草定包封率进行检测。

透析袋处理：先用50%乙醇煮沸1小时，再一次用50%乙醇、0.01mol/l碳酸氢钠和0.001mol/l EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗。洗净后的透析袋存于4℃蒸馏水中，确保透析袋始终浸没在溶液内。

透析法分离脂质体：取处理好的透析袋分别加入1.0ml空白脂质体和PBS，密闭检查无渗漏后，浸泡于50.0mlPBS（1-10）中，50r/min搅拌，透析24h，分别取接收于脂质最大吸收波长230nm处测量吸收度A值，分别为0.0535和0.0519，说明透析袋可以很好地截留脂质体。

透析条件：取脂质体1.0ml，于适当大小的透析袋中，扎紧并检查无渗漏后，置于100ml双颈圆底烧瓶中，加入50mlPBS作为接收液，50r/min搅拌，分别于0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、8h取接收液1.0ml，同时补充1.0ml新鲜CBF，检测各时间所取样品的药物含量；按同样方法进行游离光甘草定的透析操作。

游离光甘草定透析5h达到最大释放浓度，即达到透析膜内外液动态平衡，而脂质体透析6h-7h出现释药浓度剧烈升高，即在6h时，游离光甘草定达到透析膜内外动态平衡，确定透析6h为游离成分和脂质体透析分离时间。

包封率计算：取未分离游离药的脂质体1.0ml于10ml容量瓶中，加入0.2ml 10%TritonX-100，加PBS至刻度，测定总光甘草定量；冻干脂质体载药量=光甘草定的量/1mg×100%。

下面对光甘草定溶液、光甘草定冻干脂质体混悬液及冻干光甘草定冻干脂质体的加速稳定性进行说明：

取下列样品：A（全配方脂质体透析后的冻干粉末）、B（全配方脂质体透析后的脂质体混悬液）、C（1ml 未透析的脂质体原液加入5g空白乳膏基质）、D（光甘草定溶液1ml加入5g空白乳膏基质）、E（1ml透析后的脂质体原液加入5g空白乳膏基质）、F（光甘草定溶液），放置于药物稳定性孵化箱中，保存条件为：温度55℃、湿度80%条件下，于0、5、10、15天分别取样，测定其包封率、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性，结果见表4。

表4加速稳定性实验观测结果

由以上实验结果可以得到如下结论：脂质体、冻干脂质体及其配置的膏体，在温度55℃、湿度80%条件下放置15天，稳定性良好，药物泄露率<8.0%；光甘草定溶液及其配制的膏体，在上述保存条件下极不稳定；空白膏体在上述保存条件下，由半流质变为流体，但无颜色、臭味方面的改变。

下面对脂质体混悬液及脂质体膏体体外释放特性进行说明：

试验方法：分别取光甘草定冻干脂质体混悬液5ml（含光甘草定约78.5μg）、光甘草定溶液5ml（含光甘草定约80.0μg）、光甘草定冻干脂质体乳膏4g及光甘草定软膏4g，分别置于透析袋中。测定其释放特征，接收液PBS体积50ml，释放温度保持37.0℃，磁力搅拌速度为50rpm。在事先确定的时间点吸取0.5mlSBF接收液并随即补充相同体积的SBF溶液。采用前述的HPLC方法检测释放出的药物量。每个样本重复实验3次。

实验表明，脂质体、脂质体乳膏及光甘草定乳膏配方具有明显的缓释功能，可以持续释放活性成分。样品的释放主要是一个扩散过程，该过程释放速率主要受含量、粒径大小的影响；而光甘草定溶液体外释放速度是其他样品的5倍以上。

下面对光甘草定冻干脂质体和光甘草定溶液的体外透皮性能进行检测：

 分别配制光甘草定冻干脂质体和光甘草定溶液各1ml，并分别加入到同配方的1g空白膏体中；去用于透皮吸收的商品化猪皮，根据Franz扩散池的口径（0.66cm²），裁剪成适宜大小，使猪皮表面（角质层）朝上，安装于扩散池上，各涂抹约膏体0.2g；接收液为PBS溶液，温度37℃，接收液体积2.5ml，在规定的时间点将所有接收液取出，同时补充新的接收液；按前面的方法检测接收液光甘草定含量，计算光甘草定累计透皮吸收量和百分率；最后一个时间点取样后，将猪皮正反面用蒸馏水冲洗，猪皮浸泡于8mlPBS液中24小时，测定浸泡液光甘草定含量，以确定光甘草定在猪皮中的滞留量。结果见表5。

表5 不同样品在猪皮中的滞留量

从上表可以看出，两个样品都具有一定的透皮性能，累计透过百分率降低，光甘草定冻干脂质体透过程度显著高于光甘草定溶液（P<0.05）,实验证实了光甘草定冻干脂质体确实具有良好的皮肤透过性能，并能将活性成分在皮肤中的滞留量提高了3倍以上。

综上所述，采用挤出-冻干方法制备光甘草定冻干脂质体方法简便、重现性好、稳定性高。光甘草定采用脂质体包裹后，具有缓释性能，可以延长作用时间。光甘草定冻干脂质体，皮肤透过率高，并且由于其电荷特性，使之更容易与皮肤结合而滞留于皮肤，有利于活性成分光甘草定作用的充分发挥。采用光甘草定冻干脂质体技术，可以解决活性成分光甘草定的稳定性问题，还可以解决大分子成分透过皮肤吸收的问题，还因为每种成分可以分别用脂质体包裹从而解决了活性成分的相容性问题。将此技术应用于生物医药方面具有巨大的潜力和市场空间。

 需要强调的是，本发明所述的实施例是说明性的，而不是限定性的，因此本发明并不限于具体实施方式中所述的实施例，凡是由本领域技术人员根据本发明的技术方案得出的其他实施方式，同样属于本发明保护的范围。 

Claims (7)

1.一种光甘草定冻干脂质体，其特征在于：其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、磷酸盐缓冲液70～120份。

2.根据权利要求1所述的一种光甘草定冻干脂质体，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.5。

3.一种如权利要求1或2所述光甘草定冻干脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解；

⑵将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥使溶剂除尽；

⑶将光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用；

⑷将磷酸盐缓冲液加入到光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液；

⑸将占0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到步骤⑵含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液；

⑹采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状；

⑺将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。

4.一种光甘草定冻干脂质体，其特征在于：其构成组分及其组分的重量份数为：大豆磷脂65～70份、胆固醇30～35份、光甘草定0.5～30份、无水乙醇1000～1500份、冻干保护剂0.5～3份，磷酸盐缓冲液70～120份。

5.根据权利要求4所述的一种光甘草定冻干脂质体，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.5。

6.根据权利要求4所述的一种光甘草定冻干脂质体，其特征在于：所述的冻干保护剂为低浓度甘氨酸。

7.一种如权利要求4至6任一项所述光甘草定冻干脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

⑴称取大豆磷脂、胆固醇置于茄形瓶中，加入相当于大豆磷脂和胆固醇总体积6～10倍的无水乙醇使大豆磷脂和胆固醇完全溶解；

⑵将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，48～50℃减压蒸发溶剂，在茄形瓶中形成一层薄膜，然后中空干燥使溶剂除尽；

⑶将光甘草定与无水乙醇按体积比1：5混合使光甘草定完全溶解，制得光甘草定溶液备用；

⑷将磷酸盐缓冲液及冻干保护剂加入到光甘草定溶液中形成光甘草定磷酸盐溶液；

⑸将占0.05～0.14倍大豆磷脂和胆固醇总质量的光甘草定磷酸盐溶液加到上述含薄膜的茄形瓶中，35～40℃恒温震荡至薄膜脱落，然后放置2～3h水化，水化液分别经0.80μm、0.45μm、0.22μm滤膜高压挤出，制得光甘草定冻干脂质体混悬液；

⑹采用冻干法制备光甘草定冻干脂质体：取光甘草定冻干脂质体混悬液置于烧瓶中，浸入低温浴器内，缓慢旋转40～60min，直到冷冻成膜状；

⑺将烧瓶连于冷冻干燥仪上，抽真空5～10min，使水分完全升华，制备出光甘草定冻干脂质体。