CN114167051B - 一种化学发光免疫微球冻干制剂及其制备方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学发光免疫微球冻干制剂及其制备方法以及应用，该制剂为一个或多个组成成分相同的圆球状固体颗粒，均匀光滑，稳定性好，制备时将磁微粒包被原料和吖啶酯标记原料及试剂储存剂冻干形成一个微球，使其可以常温运输和保存；本发明制得的微球颗粒便于分装，可实现单人份包装，卫生、简单明了、取用方便，提高了安全性和便利性。本发明提供的制剂及其制备的试剂盒可用于非以疾病诊断和治疗为直接目的下的免疫学检测，检测项目例如为血清或血浆中，氨基末端脑利钠肽前体含量，或总前列腺特异抗原含量，或促甲状腺激素含量，或心肌肌钙蛋白I含量，或降钙素原含量，灵敏度高、特异性好、线性范围广，能够满足临床检测的需要。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种化学发光免疫微球冻干制剂及其制备方法以及应用。
背景技术
化学发光免疫测定(CLIA)亦称化学发光标记免疫测定，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体(化学发光剂标记物)，与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。
但是发光免疫检测分析用试剂对保存和运输条件的要求苛刻，一般需要保存在2～8℃，冷链运输。这些条件如果得不到满足，会对发光免疫试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。
发明内容
本发明的目的是提供一种化学发光免疫微球冻干制剂及其制备方法以及应用。
本发明要解决的是发光免疫检测分析用试剂不能常温保存与运输的问题。
为实现本发明的目的，本发明采用以下的技术方案：
一种化学发光免疫微球冻干制剂，所述微球冻干制剂为一个或多个组成成分相同的圆球状固体颗粒，所述制剂的组成成分包括试剂储存剂、磁微粒包被原料及吖啶酯标记原料；所述磁微粒包被原料为磁性微粒偶联抗体或抗原，所述吖啶酯标记原料为吖啶酯标记抗体或抗原。
进一步地，所述试剂储存剂包括冻干保护剂、PEG20000及抗氧化剂，所述冻干保护剂包括甘露醇、海藻糖、酪蛋白、表面活性剂、明胶、防腐剂及缓冲液TBS。
其中，PEG20000一方面起低温保护剂和脱水保护剂的作用，另一方面在免疫反应中可起到加速反应，提高制剂检测灵敏度的作用(因为为了保护制剂的稳定性，配制/使用的制剂储存剂成分复杂，易降低制剂反应信号值，所以增加PEG20000，加速免疫反应，提高试剂灵敏度)；抗氧化剂可采用硫代硫酸钠和EDTA-2Na：防止试剂在冻干过程及贮藏过程中发生氧化变质。
冻干保护剂中，甘露醇：作为冻干填充剂，无吸湿性，冻干快，冻干过程可防止有效组分随水蒸气一起升华，并使有效组分成形；海藻糖：冻结过程，起到低温保护的作用，干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用；酪蛋白：蛋白保护的作用，脱水干燥过程中填充剂的作用，同时在免疫试剂中可以起到控制本底，消除假阳的作用；表面活性剂可以为吐温20、吐温80或triton x 100：冻干过程降低冰水界面张力所引起的冻结和脱水变形，复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用，同时降低免疫反应过程中非特异性反应；明胶：冻干填充剂，同时免疫反应中可以封闭点位，增强蛋白质的稳定性，消除非特异性反应；防腐剂可采用Proclin 300：广泛抑菌，生物相容性好。
更进一步地，所述冻干保护剂按质量百分数之和为100％计，各组分占质量百分数为：甘露醇2％～10％，海藻糖5％～20％，酪蛋白0.5％～2％，表面活性剂0.05％～0.5％、明胶0.05％～1％，防腐剂0.1％～1％及缓冲液TBS65.5％～92.3％。
进一步地，所述缓冲液TBS由10～50mm TRIS-HCl和0.85％NaCl制成，使缓冲液的pH处于7.0～7.4的中性环境下；所述抗氧化剂为硫代硫酸钠与EDTA-2Na按1：1混合使用。
本发明还提供了上述化学发光免疫微球冻干制剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1、获得试剂储存剂，所述试剂储存剂包括冻干保护剂、PEG20000及抗氧化剂；
S2、获得磁微粒包被原料和吖啶酯标记原料，所述磁微粒包被原料为磁微粒偶联抗体或抗原，所述吖啶酯标记原料为吖啶酯标记抗体或抗原；将所述磁微粒包被原料与步骤S1的试剂储存剂混合形成磁微粒包被原料试剂，将所述吖啶酯标记原料与步骤S1的试剂储存剂混合形成吖啶酯标记原料试剂；
S3、将步骤S2获得的磁微粒包被原料试剂和吖啶酯标记原料试剂等比例混合形成混合液，通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后即得圆球状固体颗粒的微球冻干制剂。
进一步地，本发明提供的上述化学发光免疫微球冻干制剂的制备方法还包括以下步骤：
S4、将步骤S3得到的圆球状固体颗粒的微球冻干制剂充保护气体分装保存，以实现单人份包装测试模式。
本发明还提供了上述的化学发光免疫微球冻干制剂在制备免疫检测试剂盒上的应用。
本发明还提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒包含上述的化学发光免疫微球冻干制剂。
进一步地，该试剂盒还包括用于崩解所述化学发光免疫微球冻干制剂的去离子水。
本发明还提供了上述化学发光免疫微球冻干制剂或上述的化学发光免疫检测试剂盒的应用，该应用为非疾病诊断和治疗目的下的免疫学检测，检测项目为血清或血浆中，氨基末端脑利钠肽前体含量，或总前列腺特异抗原含量，或促甲状腺激素含量，或心肌肌钙蛋白I含量，或降钙素原含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的化学发光免疫微球冻干制剂为一个或多个组成成分相同的圆球状固体颗粒，均匀光滑，稳定性好，有效解决了发光免疫试剂不能常温保存与运输的问题，使用时只需将该制剂加纯化水，微球即迅速崩解复溶成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠(磁微粒)不团聚，液体除磁珠粉末外无未溶解物；
2、本发明提供的化学发光免疫微球冻干制剂包含特定成分及比例组成的试剂储存剂，对磁微粒包被原料和吖啶酯标记原料进行温度、湿度、pH值环境等保护，避免或减轻原料在冻干过程中受到多种应力损伤，保护试剂不易变性和失活，保护试剂的稳定性；
3、本发明提供的化学发光免疫微球冻干制剂制备方法简便，将磁微粒包被原料和吖啶酯标记原料及试剂储存剂冻干形成一个微球，使其可以常温运输和保存，磁微粒包被原料中磁微粒为固相载体，吖啶酯标记原料为液相，固相载体与液相在同一个微球上冻干，整体在冻干过程中会受到多种应力损伤，添加本发明特定的冻干保护剂可以避免固相载体导致冻干微球表面孔隙不均一，减少化学发光免疫试剂的吸湿性，避免影响制剂的结构，从而保护制剂的稳定性；本发明制得的微球颗粒便于分装，可实现单人份包装，卫生、简单明了、取用方便，避免了混装取用时需要配对，容易混淆的问题；避免了运输和使用中其他物质的干扰和影响，提高了安全性和便利性，更受使用者欢迎，利于市场推广；
4、本发明提供的化学发光免疫微球冻干制剂可用于非以疾病诊断和治疗为直接目的下的免疫学检测，检测项目例如为血清或血浆中，氨基末端脑利钠肽前体含量，或总前列腺特异抗原含量，或促甲状腺激素含量，或心肌肌钙蛋白I含量，或降钙素原含量，灵敏度高、特异性好、线性范围广，能够满足临床检测的需要。
附图说明
图1：本发明实施例1提供的制剂外观参考示意图；
图2：本发明实施例1提供的制剂测定人血清NT-proBNP的标准曲线图；
图3：本发明实施例1提供的制剂检测结果与罗氏电化学测定结果相关性图。
具体实施方式
现有技术中存在发光免疫检测分析用试剂不能常温保存与运输的技术问题。
所以本发明提出新的方案，提供一种可以常温保存与运输的化学发光免疫微球冻干制剂及其制备方法以及应用。
为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1
本实施例提供了一种可用于定量检测人血清中氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)含量的化学发光免疫微球冻干制剂及试剂盒及其制备方法和检测方法及结果。
脑钠肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)实际上主要来源于心室，因其是由日本学者Sudoh1988年首次从猪脑中提取出来而得名。BNP主要由心室肌细胞合成和分泌，具有较强的舒张血管作用，是人体抵御容量负荷过重及高血压的一个主要内分泌系统，心室负荷增加能导致BNP释放。氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)是脑钠肽前体之一，是BNP激素原分裂后没有活性的N-末端片段，主要分泌存在于左心室。与BNP相比，半衰期更长，更稳定,其浓度可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放。有研究表明，血清NT-proBNP水平在高血压诊断、心力衰竭的预后判断与治疗指导方面有重要价值。
化学发光法检测NT-proBNP能做到定量检测，但常规的发光免疫试剂在保存和运输条件上要求苛刻，一般需要保存在2～8℃，需要冷链运输。这些条件如果得不到满足，会对发光免疫试剂的性能造成很大的影响，甚至导致试剂失效。本实施例提供的化学发光免疫微球冻干制剂可实现常温储存且单人份包装，本实施例通过以羧基修饰的磁性微球偶联NT-proBNP Ab1，利用吖啶磺酰胺标记NT-proBNP Ab2，各添加试剂储存剂，二者混合，利用液氮点样仪器点样，形成冷冻微球，将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后充保护气体分装保存。检测时，加入纯化水与待测样本，等到待测物中的NT-proBNP抗原与制剂混合，形成双抗体夹心复合物结合在磁珠上，清洗分离，复合物在激发液的作用下发光，相对发光强度(RLU)与样本中的NT-proBNP抗原浓度呈正相关；从而研制出直接化学发光免疫分析法定量检测氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)的冻干微球单人份包装制剂。
本实施例中，所用的试剂和材料名称及来源如下：NT-proBNP抗体配对(菲鹏生物股份有限公司)，NT-proBNP校准品(上海领潮生物科技有限公司)，人血清白蛋白，胆红素、血红素、甘油三酯(Sigma-Aldrich公司)；磁性微球(羧基，2.9μm,日本JSR株式会社)，吖啶磺酰胺(NSP-SA-NHS深圳市美凯特科技有限公司)，脱盐柱(Thermo fisher公司)，二甲基甲酰胺DMSO(Sigma-Aldrich公司)，赖氨酸(Sigma-Aldrich公司)，酪蛋白，牛血清白蛋白BSA(Sigma-Aldrich公司)，甘露醇、海藻糖、明胶、硫代硫酸钠与乙二胺四乙酸二钠(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、PEG20000(国药集团化学试剂有限公司)。
本实施例采用的仪器设备有：全自动化学发光测定仪(KEYSMILE SMART 500)，高效液相色谱(Agilent Technologies 1260InfinityⅡ)，伯托化学发光仪(Centro LB960)，TECAN磁微粒洗板机(Hydro FLEX)。
本实施例的检测样本为：定值人血清100例(福建医科大学附属协和医院提供，定值结果由罗氏电化学发光检测)。
本实施例具体的实施过程如下：
1、溶液配制
(1)试剂储存剂配制：甘露醇5％，海藻糖10％，酪蛋白1％，吐温200.05％、明胶0.5％以及防腐剂0.1％，，用缓冲液pH7.0～7.4 25mmTBS溶液83.3％溶解稀释以上组分到相应的浓度。再加硫代硫酸钠5mmol/mL；乙二胺四乙酸二钠5mmol/mL，PEG20000 0.1％，混匀以上成分。
(2)激发液配制：激发液A：0.1％的H2O2+0.1mol/L的HNO3，激发液B：0.2mol/lNaOH+1％TritonX-100。
2、试剂一：磁性微球偶联NT-proBNP-Ab1制备
取10mg羧基修饰的磁性微球混悬液于样品管中，加900uL pH5.00.1mol/mL MES溶液混匀，然后分别加100uL 10mg/mL EDC溶液和200uL 10mg/mL NHS溶液，室温反应30min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混悬液于1mL pH5.0 0.1mol/mL MES溶液；随后直接加入SCC-Ab1 100ug，37℃孵育3h；去上清，加入10mg/mL BSA50uL室温封闭1h后，用0.025mol/mLTBST缓冲液洗涤4次，除去游离抗体，加入试剂储存剂10mL，制备成试剂一，该试剂一也即前述磁微粒包被原料试剂。
3、试剂二：吖啶磺酰胺标记NT-proBNP-Ab2制备
取适量抗体，用50mM pH 9.6的CB稀释至1mg/mL，脱盐柱纯化；计算抗体的摩尔数，在纯化后的抗体中加入15倍摩尔数的NSP-SA-NHS(DMSO稀释)，4℃避光反应1h；加入20倍抗体摩尔数的赖氨酸避光反应30min，用高效液相色谱(流相:pH6.5 0.1mol/L的PBS缓冲液，色谱柱：分子筛色谱柱，UV:280nm)纯化标记后的复合物，加入等体积甘油-20℃冻存，使用时用试剂储存剂稀释至抗体浓度为0.001mg/mL，制备成试剂二，该试剂二也即前述吖啶酯标记原料试剂。
4、试剂点样冻干
将试剂一与试剂二按1：1混合均匀，加入到液氮点样仪中，设置点样量每滴为20uL，点样，形成冷冻微球，将冷冻微球转入冻干机，冷冻干燥后得微球冻干制剂，充保护气体分装保存。
5、检测分析
取30uL待测样本，120μL去离子水加入到带有步骤4得到的微球冻干制剂的样品杯中；37℃条件下温育10min后，洗涤液清洗3次；最后加入激发液A 100uL，激发液B 100uL，检测相对发光强度。全自动化学发光仪器参数按上面的步骤设置。
在免疫反应中，对企业参考品采用三个平行孔测定，取其平均值，相对发光强度值(RLU)和相应浓度进行线性拟合，建立主校准曲线，扫描到仪器中。通过所保存的校准数据，检测相应样本时系统软件自动地确定病人的测试结果。结果单位以pmol/mL的形式给出。
6、实验结果
(1)制剂外观及理化性质
参照图1所示，制剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶，成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无未溶解物。
(2)线性范围
将接近线性范围上限标准品(35 000pmol/mL)的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度20pmol/mL接近线性范围下限。对每一个样本均检测3次，计算平均值，相对发光强度值做线性拟合。如图2所示，线性范围(20～35 000pmol/mL)内，线性相关系数R＞0.999，显示了良好的相关性。
(3)最低检出限
用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测度20次，得出20次检测结果的RLU值，计算其平均值和标准差(SD)，将/>所对应的RLU值带入主校准曲线中，求出对应的浓度值，不高于20pmol/mL，设定20pmol/mL即为最低检出限。
(4)精密性
批内精密性，用1000pmol/mL、10000pmol/mL 2个浓度企业参考品，每个浓度平行检测10次，检测结果见表1，分别求其平均值和标准差SD，/>结果批内变异系数(CV)<5％。检测CV:1000pmol/mL 4.8％；10000pmol/mL 3.2％。
表1批内精密性检测数据
| 检测次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1000pmol/mL | 73626 | 72913 | 74183 | 72095 | 73037 |
| 10000pmol/mL | 630022 | 667873 | 686925 | 664219 | 681297 |
| 检测次数 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 1000pmol/mL | 65973 | 74857.5 | 76473 | 74227.5 | 66450 |
| 10000pmol/mL | 638059 | 692938 | 667815 | 659324 | 646513 |
(5)回收率
将三例高值样本加入到3份正常人血清样品(内源性检测浓度均低于100pm/mL)中，所加入高值样本与正常人血清之间体积比为1:9，平均回收率95.7％。回收率检测计算数据见表2。
表2回收率检测计算数据
(6)稳定性
将本实施例制得的化学发光免疫微球冻干制剂在45℃下放置90天，检测企业参考品，相对发光强度与放置前对比，确定45℃储存90天热稳定性的变化幅度≤10％；按制剂储存条件(25±5℃)下放置5个月，检测标准品，相对发光强度与放置前对比，稳定性的变化幅度≤10％(检测数据见表3)。与常规化学发光试剂相比稳定性显著升高。常规化学发光试剂(液相)45℃储存3天热稳定性的变化幅度约20％(检测数据见表4)。
表3实施例1提供的制剂稳定性检测数据
表4常规化学发光试剂稳定性检测数据
(7)比对试验
收集福建医科大学附属协和医院提供的57例临床标本，用研究试剂盒测定，并与罗氏电化学发光测定结果对比，结果如图3，回归方程y＝0.9942x+173.13,相关系数R2＝0.9764，表明两者测试血清中NT-proBNP抗原的含量具有良好的相关性。
(8)特异性
制剂检测特异性考察通过与常见的干扰因素人血清白蛋白、甘油三酯、血红素、胆红素,以及BNP对检测结果的影响，干扰物测定值均小于20pmol/mL(见表5)，表明该制剂用于检测具有良好的特异性。
表5实施例1制剂特异性检测结果
| 交叉反应物质 | 交叉反应物质浓度 | 交叉反应物质测定值 |
| 人血清白蛋白 | 12g/dL | 9.5pmol/mL |
| 甘油三酯 | 3000mg/dL | 0.5pmol/mL |
| 血红素 | 500mg/dL | 15pmol/mL |
| 胆红素 | 20mg/dL | 5pmol/mL |
| BNP | 3000ng/mL | 19.5pmol/mL |
本实施例制备的化学发光免疫微球冻干制剂可实现单人份包装常温储存，具有灵敏度高、特异性好、线性范围广，稳定性好等特点，能够满足临床检测的需要。使用其与纯化水(去离子水)或其和激发液等自制NT-proBNP试剂盒，可以检测NT-proBNP水平，辅助心衰患者的临床诊断和治疗，为患者治疗提供可靠的数据支持。
实施例2
实施例2～实施例5提供了本发明提供的化学发光免疫微球冻干制剂用于其他免免疫检测指标定量检测的实施情况，这些检测分析均是利用双抗体夹心法原理，采用直接化学发光免疫法，原理如下：
孵育：样本中的抗原和磁性微球偶联的抗体、吖啶标记的抗体结合。形成双抗体夹心免疫复合物。
清洗：在施加磁场作用下，通过洗涤将没有结合物质与免疫复合物分离。
激发和读数：免疫复合物在预激发液和激发液的作用下发光，通过相对光单位数测定化学发光反应。
待测样本的发光信号值经校准曲线计算后得出待测抗原的浓度。
制备及检测过程如下：
采用直接化学发光免疫分析法，混合预先添加好试剂储存剂的磁微粒(选用纳米磁微粒，粒径100～300nm)包被原料和吖啶酯标记原料(包被方法和标记方法为现有常规方法，包被或标记的抗体为待检测目标抗原对应的抗体)，利用液氮点样仪器点样，形成冷冻微球并转入冻干机，最后真空冷冻干燥后得圆球状固体颗粒的微球冻干制剂，用保护气体进行分装保存。检测时，加入复溶液与待测样本，等到待测物中的抗原与制剂混合，形成双抗体夹心复合物结合在磁珠上后，清洗分离。实验结果表明，复合物在激发液的作用下发光，相对发光强度(RLU)与样本中的抗原浓度呈正相关。
检测用品或试剂盒可以如表6所示，试剂盒也可以只包含其中的化学发光免疫微球冻干制剂或其和去离子水(崩解复溶制剂用)，其他用品另外准备。
表6实施例2～实施例5化学发光免疫检测分析用品
表6中，试剂储存剂包括冻干保护剂、PEG20000及抗氧化剂，所述冻干保护剂包括甘露醇、海藻糖、酪蛋白、表面活性剂、明胶、防腐剂及缓冲液TBS，所述冻干保护剂按质量百分数之和为100％计，各组分占质量百分数为：甘露醇2％～10％，海藻糖5％～20％，酪蛋白0.5％～2％，表面活性剂0.05％～0.5％、明胶0.05％～1％，防腐剂0.1％～1％及缓冲液TBS 65.5％～92.3％。试剂储存剂的具体组分配比和添加量可依照实施例1实施。
实施例2提供的是用于检测分析血清和/或血浆中总前列腺(t-PSA)特异抗原的化学发光免疫微球冻干制剂及试剂盒。通过体外定量测定人类血清、血浆中的总前列腺特异抗原，与直肠指检(DRE)一起联合可以用于50岁或50岁以上男性前列腺癌的辅助检查。这项检测还适合用于总前列腺特异抗原的连续监测，有助于前列腺癌症患者的治疗和管理。
1.制剂外观及理化性质
与实施例1相同，本实施例提供的制剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶，成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无其他未溶解物。
2.精密度检测
用低中高值企业参考品，每个浓度平行检测8次，分别求其平均值和标准差(SD)，/>
结果：批内变异系数(CV)≤5％。批内精密性检测数据见表7。计算得出，低值质控检测CV 4.4％；中值质控检测1.5％；高值质控检测CV 3.1％。
表7实施例2批内精密性检测数据
| 低值质控 | 25126 | 24185 | 26060 | 27564 | 25617 | 24960 | 27199 | 25888 |
| 中值质控 | 112027 | 111944 | 110999 | 112185 | 112605 | 110255 | 115410 | 110706 |
| 高值质控 | 2659771 | 2757514 | 2761693 | 2604084 | 2846512 | 2779399 | 2646242 | 2677880 |
3.线性范围
将接近线性范围上限标准品(100ng/mL)的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度0.02ng/mL接近线性范围下限。对每一个样本检测2次，计算平均值，相对发光强度值做直线回归。
结果：如表8所示，冻干微球试剂(即化学发光免疫微球冻干制剂)线性范围(0.02-100ng/mL)内，线性相关系数R＞0.999，显示了良好的相关性.
表8实施例2线性范围及发光值检测数据
4.制剂45℃储存稳定性
将制剂放在45℃保温箱储存，不同储存时间检测质控品，并与0天检测对比。质控品是同时间配置并放置-20℃分装于离心管冻存，每次使用时取出新的一支解冻。
结果：制剂高温储存，稳定性良好，检测质控品偏差均在8％以内。检测数据见表9。
表9实施例2提供的制剂在45℃储存稳定性检测数据
综上，本实施例提供的制剂用于检测分析血清和/或血浆中总前列腺(t-PSA)特异抗原性能分析显示，批内变异系数(CV)≤5％；线性范围0.02-100ng/mL，线性相关系数(r)≥0.999；试剂45℃储存90天稳定性变化幅度≤8％。
实施例3
实施例3提供的是用于体外定量检测人血清中促甲状腺素(TSH)的含量的化学发光免疫微球冻干制剂及试剂盒。
促甲状腺激素(TSH，thyroid stimulating honnone)是由腺垂体细胞分泌的一种糖蛋白，包括α和β自两个亚基，其中β亚基是功能亚基。TSH的分泌受到下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素的调节以及血液循环中甲状腺激素的反馈调节，具有生物节律性。
TSH是评估甲状腺功能的初筛试验。游离甲状腺浓度的微小变化就会带来TSH浓度向反方向的显著调整。因此，TSH检测是辅助评估甲状腺功能的非常敏感的特异性参数，特别适合于早期检测或排除下丘脑-垂体-甲状腺轴功能紊乱。TSH检测临床还用于辅助原发性甲状腺功能亢进、减退诊断和治疗效果评价，继发性甲状腺功能亢进或减退患者根据其原发病变部位的不同，TSH水平亦有变化。
1.制剂外观及理化性质
与实施例1和2相同，本实施例提供的制剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶，成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无其他未溶解物。
2.精密度检测
用低中高值企业参考品，每个浓度平行检测10次，分别求其平均值和标准差(SD)，/>
结果：批内变异系数(CV)≤6％。批内精密性检测数据见表10。计算得出，低值质控检测CV 5.5％；中值质控检测4.6％；高值质控检测CV 3.4％。
表10实施例3批内精密性检测数据
| 低值质控 | 1716 | 1804 | 1722 | 1903 | 1670 | 1778 | 1735 | 1843 | 1971 | 1901 |
| 中值质控 | 81609 | 82423 | 79423 | 72391 | 82955 | 81894 | 75430 | 79957 | 83744 | 82339 |
| 高值质控 | 1375719 | 1420326 | 1301410 | 1353346 | 1402974 | 1324529 | 1429669 | 1396950 | 1443193 | 1390767 |
3.线性范围
将接近线性范围上限标准品(100ng/mL)的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度0.15ng/mL。对每一个样本检测2次，计算平均值，相对发光强度值做直线回归。
结果：如表11所示，冻干微球试剂线性范围(0.15-100ng/mL)内,线性相关系数R＞0.999,显示了良好的相关性.
表11实施例3线性范围及发光值检测数据
4.制剂45℃储存稳定性
将制剂放在45℃保温箱储存，不同储存时间检测质控品，并与0天检测对比。质控品是同时间配置并放置-20℃分装于离心管冻存，每次使用时取出新的一支解冻。
结果：制剂高温储存，稳定性良好，检测质控品偏差均在8％以内。检测数据见表12。
表12实施例3提供的制剂在45℃储存稳定性检测数据
综上，本实施例提供的制剂用于体外定量检测人血清中促甲状腺素(TSH)的含量显示，批内变异系数(CV)≤6％；线性范围0.15-100ng/ml，线性相关系数(r)≥0.999；试剂45℃储存86天稳定性变化幅度≤8％。
实施例4
实施例4提供的是用于体外定量检测人血清中心肌肌钙蛋白I(CTNI)的含量的化学发光免疫微球冻干制剂及试剂盒。
肌钙蛋白I主要储存在心肌肌肉组织当中，人体内骨骼肌、内脏平滑肌是不含有心肌肌钙蛋白I的。正常情况下，血液当中几乎是测不到肌钙蛋白I的，肌钙蛋白是心肌肌肉组织的一种调节蛋白，主要作用是参与心肌的收缩。肌钙蛋白I升高意味着心肌损伤，常见于心脏本身的原因或者其他疾病，用于急性心肌梗死的临床辅助诊断、危险分层以及患者预后评估。
1.制剂外观及理化性质
与实施例1～3相同，本实施例提供的制剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶，成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无其他未溶解物。
2.精密度检测
用低中高值企业参考品，每个浓度平行检测8次，分别求其平均值和标准差(SD)，/>
结果：批内变异系数(CV)≤6％。批内精密性检测数据见表14。计算得出，低值质控检测CV 3.9％；中值质控检测3.6％；高值质控检测CV 5.3％。
表14实施例4批内精密性检测数据
| 低值质控 | 5127 | 4911 | 5070 | 4860 | 4655 | 5035 | 5190 | 4749 | 5181 | 5173 |
| 中值质控 | 211402 | 230576 | 228395 | 236551 | 215328 | 219196 | 221059 | 213846 | 225576 | 222456 |
| 高值质控 | 3000248 | 3150949 | 2999042 | 2890001 | 2957357 | 3085279 | 2682852 | 3239993 | 3118219 | 3113297 |
3.线性范围
将接近线性范围上限标准品(100ng/mL)的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度0.1ng/mL接近线性范围下限。对每一个样本检测2次，计算平均值，相对发光强度值做直线回归。
结果：如表15所示，冻干微球试剂(即化学发光免疫微球冻干制剂)线性范围(0.10-100ng/mL)内，线性相关系数R＞0.999，显示了良好的相关性.
表15实施例4线性范围及发光值检测数据
4.制剂45℃储存稳定性
将制剂放在45℃保温箱储存，不同储存时间检测质控品，并与0天检测对比。质控品是同时间配置并放置-20℃分装于离心管冻存，每次使用时取出新的一支解冻。
结果：制剂高温储存，稳定性良好，检测质控品偏差均在5％以内。检测数据见表16。
表16实施例4提供的制剂在45℃储存稳定性检测数据
综上，本实施例提供的制剂用于体外定量检测人血清中心肌肌钙蛋白I(CTNI)的含量显示，批内变异系数(CV)≤7％；线性范围0.13-100ng/mL，线性相关系数(r)≥0.999；试剂45℃储存86天稳定性变化幅度≤5％。
实施例5
实施例5提供的是用于体外定量检测人血清中降钙素原(PCT)的含量的化学发光免疫微球冻干制剂及试剂盒。
降钙素原(PCT)：是降钙素的前体物质。正常情况下PCT由甲状腺C细胞合成、分泌，少部分由其他神经内分泌细胞产生。健康人体血液中PCT浓度非常低，但发生全身性细菌感染时PCT浓度会升高，升高的程度与感染严重程度呈正相关。PCT检测是严重细菌感染/脓毒症早期鉴别诊断的最优观察指标，可辅助临床快速鉴别细菌感染和病毒感染，判断细菌感染严重程度，辅助临床开始或停止抗生素使用等。
1.制剂外观及理化性质
与实施例1～4相同，本实施例提供的制剂呈均匀光滑的圆球状固体，加纯化水，微球迅速崩解复溶，成均匀带有磁珠粉末的混悬液，磁珠不团聚，液体除磁珠粉末外无其他未溶解物。
2.精密度检测
用低中高值企业参考品，每个浓度平行检测10次，分别求其平均值
和标准差(SD)，/>
结果：批内变异系数(CV)≤7％。批内精密性检测数据见表17。计算得出，低值质控检测CV 6.7％；中值质控检测1.6％；高值质控检测CV 2.0％。
表17实施例5批内精密性检测数据
| 低值质控 | 9708 | 9331 | 8786 | 9275 | 10726 | 8901 | 8737 | 8909 | 9359 | 8700 |
| 中值质控 | 678348 | 677059 | 668200 | 674786 | 657789 | 649892 | 669875 | 677440 | 680303 | 681485 |
| 高值质控 | 12865474 | 13165513 | 12612679 | 12604284 | 12457846 | 12760793 | 12740510 | 12806635 | 12622764 | 12244357 |
3.线性范围
将接近线性范围上限标准品(100ng/mL)的样本用正常人血清稀释6个浓度，其中稀释的最小浓度0.13ng/mL。对每一个样本检测2次，计算平均值，相对发光强度值做直线回归。
结果：如表18所示，冻干微球试剂(即化学发光免疫微球冻干制剂)线性范围(0.13-100ng/mL)内，线性相关系数R＞0.999，显示了良好的相关性.
表18实施例5线性范围及发光值检测数据
4.制剂45℃储存稳定性
将制剂放在45℃保温箱储存，不同储存时间检测质控品，并与0天检测对比。质控品是同时间配置并放置-20℃分装于离心管冻存，每次使用时取出新的一支解冻。
结果：制剂高温储存，稳定性良好，检测质控品偏差均在8％以内。检测数据见表19。
表19实施例5提供的制剂在45℃储存稳定性检测数据
综上，本实施例提供的制剂用于体外定量检测人血清中降钙素原(PCT)的含量显示，批内变异系数(CV)≤7％；线性范围0.13-100ng/mL，线性相关系数(r)≥0.999；试剂45℃储存86天稳定性变化幅度≤5％。
本发明制备的化学发光免疫微球冻干制剂可实现单人份包装常温储存，具有灵敏度高、特异性好、线性范围广，稳定性好等特点，能够满足临床检测的需要。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
Claims (1)
1.一种化学发光免疫微球冻干制剂，其特征在于：所述微球冻干制剂为一个或多个组成成分相同的圆球状固体颗粒，
所述制剂的组成成分包括试剂储存剂、磁微粒包被原料及吖啶酯标记原料；
所述磁微粒包被原料为磁性微粒偶联抗体或抗原，所述吖啶酯标记原料为吖啶酯标记抗体或抗原；
所述试剂储存剂包括冻干保护剂、PEG20000及抗氧化剂；
所述冻干保护剂按质量百分数之和为100%计，各组分占质量百分数为：甘露醇2%～10%，海藻糖5%～20%，酪蛋白0.5%～2%，表面活性剂0.05%～0.5%、明胶0.05%～1%，防腐剂0.1%～1%，及缓冲液65.5%～92.3%；
所述缓冲液TBS由10～50mmTRIS-HCl和0.85%NaCl制成，使缓冲液的pH处于7.0～7.4的中性环境下；
所述表面活性剂为吐温20、吐温80或tritonx100；
所述抗氧化剂为硫代硫酸钠与EDTA-2Na按1：1混合使用。
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