JPH08233820A - 化学発光測定法 - Google Patents
化学発光測定法Info
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- JPH08233820A JPH08233820A JP6206795A JP6206795A JPH08233820A JP H08233820 A JPH08233820 A JP H08233820A JP 6206795 A JP6206795 A JP 6206795A JP 6206795 A JP6206795 A JP 6206795A JP H08233820 A JPH08233820 A JP H08233820A
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- Japan
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- acridinium ester
- antigen
- washing
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 アクリジニウムエステルを用いた化学発光測
定法で、煩雑な操作をすることなく、迅速に精度よく測
定することを目的とする。 【構成】 アクリジニウムエステルを用いた化学発光測
定法でＢ／Ｆ分離をする際に使用する洗浄液が、緩衝剤
によって抗原と抗体の結合を解離せずに、アクリジニウ
ムエステルを非発光型から発光型に充分変化させること
が可能になったｐＨに調整されている。
定法で、煩雑な操作をすることなく、迅速に精度よく測
定することを目的とする。 【構成】 アクリジニウムエステルを用いた化学発光測
定法でＢ／Ｆ分離をする際に使用する洗浄液が、緩衝剤
によって抗原と抗体の結合を解離せずに、アクリジニウ
ムエステルを非発光型から発光型に充分変化させること
が可能になったｐＨに調整されている。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は化学発光物質を標識とす
るヘテロジニアス法化学発光免疫測定方法に係り、詳し
くは測定方法に供する液状処理剤の適正化による操作の
簡略化、および測定精度の改良を目的とするアクリジニ
ウムエステル標識化学発光免疫測定方法に関するもので
ある。
るヘテロジニアス法化学発光免疫測定方法に係り、詳し
くは測定方法に供する液状処理剤の適正化による操作の
簡略化、および測定精度の改良を目的とするアクリジニ
ウムエステル標識化学発光免疫測定方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】免疫学的測定法は、ホモジニアス法とヘ
テロジニアス法とに大別される。そのうち、腫瘍マーカ
ー、ホルモン等の微量成分を測定するためには、高感度
に測定が可能であるヘテロジニアス法が採用される。ヘ
テロジニアス法では、一般的には抗原を特異的に認識し
固相上に予め固定化された生理活性物質（例えば、抗
体、酵素、阻害物質等）と、抗原と、抗原を特異的に認
識し検出可能に標識された抗体を容器中で混合し一定条
件下で保持することで、生理活性物質と抗原と標識され
た抗体との複合物を形成させる。この複合物が固相に結
合していることを利用して洗浄作業を行うことで、反応
に関与しなかった抗原を特異的に認識し検出可能な標識
を行った抗体を分離する。この後に検出可能な標識の量
を測定することで測定の目的の抗原の量を検出する。
テロジニアス法とに大別される。そのうち、腫瘍マーカ
ー、ホルモン等の微量成分を測定するためには、高感度
に測定が可能であるヘテロジニアス法が採用される。ヘ
テロジニアス法では、一般的には抗原を特異的に認識し
固相上に予め固定化された生理活性物質（例えば、抗
体、酵素、阻害物質等）と、抗原と、抗原を特異的に認
識し検出可能に標識された抗体を容器中で混合し一定条
件下で保持することで、生理活性物質と抗原と標識され
た抗体との複合物を形成させる。この複合物が固相に結
合していることを利用して洗浄作業を行うことで、反応
に関与しなかった抗原を特異的に認識し検出可能な標識
を行った抗体を分離する。この後に検出可能な標識の量
を測定することで測定の目的の抗原の量を検出する。
【０００３】検出可能な標識物質として、酵素、蛍光物
質、発光物質、放射性同位体等が挙げられる。なかでも
取扱いが安全であるという長所から、酵素、蛍光物質ま
たは発光物質が用いられることが多い。しかし、酵素を
用いる方法では酵素と基質とが反応する時間が相当量必
要であり、測定時間が短縮できないという短所がある。
蛍光物質を用いる方法では、感度に限界があり高感度測
定はできないという短所がある。これに対して発光物質
を用いる方法は、短時間で測定ができ、また高感度での
測定が可能であるので、よく使用される。
質、発光物質、放射性同位体等が挙げられる。なかでも
取扱いが安全であるという長所から、酵素、蛍光物質ま
たは発光物質が用いられることが多い。しかし、酵素を
用いる方法では酵素と基質とが反応する時間が相当量必
要であり、測定時間が短縮できないという短所がある。
蛍光物質を用いる方法では、感度に限界があり高感度測
定はできないという短所がある。これに対して発光物質
を用いる方法は、短時間で測定ができ、また高感度での
測定が可能であるので、よく使用される。
【０００４】発光物質の中でも、一般的に取扱いの容易
さから化学発光物質が用いられる。化学発光物質として
はアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノー
ル、シュウ酸エステル等が一般的に知られている。これ
らの発光物質は一般的に過酸化水素を含むアルカリ性の
溶液中で発光が起きる。
さから化学発光物質が用いられる。化学発光物質として
はアクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノー
ル、シュウ酸エステル等が一般的に知られている。これ
らの発光物質は一般的に過酸化水素を含むアルカリ性の
溶液中で発光が起きる。
【０００５】化学発光物質としてアクリジニウムエステ
ルを用いることは有効な方法である。アクリジニウムエ
ステルの使用に関してはクリニカル・ケミストリー（Ｃ
ＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）２９／８， １
４７４−１４７９（１９８３）に記載されており、放射
性同位体の標識物質である Ｉ125 と同等あるいはそ
れ以上の感度の高さである。アクリジニウムエステルを
発光させるためには、一般的に次の手順を行う必要があ
る。まず、アクリジニウムエステルを含む溶液に酸性化
緩衝溶液を加えて酸性状態とし、そしてこの状態で一定
時間保持した後に、過酸化水素を含むアルカリ性の溶液
を加えることで発光が生じる。酸性条件にすることでア
クリジニウムエステルは非発光型から発光型に変化し、
ｐＨが低いほど発光型への変化量が増大することが知ら
れている。このために、高感度の測定を行うためには充
分な酸性条件下にする必要がある。一方、抗原と抗体の
結合は酸性にすることで解離しやすくなることは一般的
に知られている。
ルを用いることは有効な方法である。アクリジニウムエ
ステルの使用に関してはクリニカル・ケミストリー（Ｃ
ＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）２９／８， １
４７４−１４７９（１９８３）に記載されており、放射
性同位体の標識物質である Ｉ125 と同等あるいはそ
れ以上の感度の高さである。アクリジニウムエステルを
発光させるためには、一般的に次の手順を行う必要があ
る。まず、アクリジニウムエステルを含む溶液に酸性化
緩衝溶液を加えて酸性状態とし、そしてこの状態で一定
時間保持した後に、過酸化水素を含むアルカリ性の溶液
を加えることで発光が生じる。酸性条件にすることでア
クリジニウムエステルは非発光型から発光型に変化し、
ｐＨが低いほど発光型への変化量が増大することが知ら
れている。このために、高感度の測定を行うためには充
分な酸性条件下にする必要がある。一方、抗原と抗体の
結合は酸性にすることで解離しやすくなることは一般的
に知られている。
【０００６】この様な条件のために、免疫学的測定法に
アクリジニウムエステルを用いる場合には、一般的には
次のような測定手順で測定されている。まず、抗原を特
異的に認識し固相上に予め固定化された生理活性物質
と、抗原と、抗原を特異的に認識しアクリジニウムエス
テルで標識された抗体とを、容器中で混合し一定条件下
で保持することで、生理活性物質と、抗原と、標識され
た抗体との複合物を形成させる。次に、この複合物が固
相に結合していることを利用して、洗浄を行うことで反
応に関与しなかったアクリジニウムエステルで標識され
た抗体を分離する。さらに、ｐＨ４以下の酸性化緩衝溶
液を加えて一定時間保持することでアクリジニウムエス
テルを発光型にする。さらにここへ、過酸化水素を含む
アルカリ性の溶液を加えて発光させる。この発光量を測
定することで抗原の濃度を知ることができる。
アクリジニウムエステルを用いる場合には、一般的には
次のような測定手順で測定されている。まず、抗原を特
異的に認識し固相上に予め固定化された生理活性物質
と、抗原と、抗原を特異的に認識しアクリジニウムエス
テルで標識された抗体とを、容器中で混合し一定条件下
で保持することで、生理活性物質と、抗原と、標識され
た抗体との複合物を形成させる。次に、この複合物が固
相に結合していることを利用して、洗浄を行うことで反
応に関与しなかったアクリジニウムエステルで標識され
た抗体を分離する。さらに、ｐＨ４以下の酸性化緩衝溶
液を加えて一定時間保持することでアクリジニウムエス
テルを発光型にする。さらにここへ、過酸化水素を含む
アルカリ性の溶液を加えて発光させる。この発光量を測
定することで抗原の濃度を知ることができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のような
従来の測定手順で測定することは、以下のようないくつ
かの問題を含んでいる。 酸性化緩衝溶液を加えることで抗原と抗体の結合が解
離するために、抗原と抗体の結合が解離しないような工
夫をする。 酸性化緩衝溶液を単に加えただけでは該溶液が特に繊
維集合体を固相担体とする場合固定化反応体内に充分に
浸透しないために、アクリジニウムエステルを非発光型
から発光型に変化させるのに時間がかかる。 ｐＨの低い酸性化緩衝溶液により、投入するアルカリ
性の溶液が急速に中和されるために充分な発光が生じな
い状態が生じる。 本願発明は、従来の測定法が持つこれらの問題を解消し
た洗浄液を提供することを目的とする。
従来の測定手順で測定することは、以下のようないくつ
かの問題を含んでいる。 酸性化緩衝溶液を加えることで抗原と抗体の結合が解
離するために、抗原と抗体の結合が解離しないような工
夫をする。 酸性化緩衝溶液を単に加えただけでは該溶液が特に繊
維集合体を固相担体とする場合固定化反応体内に充分に
浸透しないために、アクリジニウムエステルを非発光型
から発光型に変化させるのに時間がかかる。 ｐＨの低い酸性化緩衝溶液により、投入するアルカリ
性の溶液が急速に中和されるために充分な発光が生じな
い状態が生じる。 本願発明は、従来の測定法が持つこれらの問題を解消し
た洗浄液を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】これらの課題を解決する
ために鋭意研究を重ねた結果、以下の工程すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
抗体とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗原と抗原
抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成する工程 （ｃ）免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を、洗浄液を用いて分離
すると同時にアクリジニウムエステルを非発光型から発
光型に変化させる工程 （ｅ）アルカリ性の溶液を加えて発光させ、発光量を測
定する工程 の各工程を順に持つ測定方法において、（ａ）の工程で
使用する希釈液、（ｂ）の工程で使用する試薬、（ｄ）
の工程で使用する洗浄液のうち、少なくとも洗浄液のｐ
Ｈが５〜６であることを特徴とする、アクリジニウムエ
ステルを標識物質とする化学発光測定法を発明するに至
った。
ために鋭意研究を重ねた結果、以下の工程すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
抗体とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗原と抗原
抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成する工程 （ｃ）免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を、洗浄液を用いて分離
すると同時にアクリジニウムエステルを非発光型から発
光型に変化させる工程 （ｅ）アルカリ性の溶液を加えて発光させ、発光量を測
定する工程 の各工程を順に持つ測定方法において、（ａ）の工程で
使用する希釈液、（ｂ）の工程で使用する試薬、（ｄ）
の工程で使用する洗浄液のうち、少なくとも洗浄液のｐ
Ｈが５〜６であることを特徴とする、アクリジニウムエ
ステルを標識物質とする化学発光測定法を発明するに至
った。
【０００９】測定試料の検体濃度が非常に低い場合に
は、希釈を必要とせず、（ａ）の工程を省略することも
できる。本発明は、従来の測定手順における洗浄液と酸
性化緩衝溶液とを、一つにまとめたものである。しか
し、単純にまとめただけでは、上述したような酸性化条
件下では免疫複合体は解離してしまうので、発光量の低
下および測定値のバラツキ増大を招く。
は、希釈を必要とせず、（ａ）の工程を省略することも
できる。本発明は、従来の測定手順における洗浄液と酸
性化緩衝溶液とを、一つにまとめたものである。しか
し、単純にまとめただけでは、上述したような酸性化条
件下では免疫複合体は解離してしまうので、発光量の低
下および測定値のバラツキ増大を招く。
【００１０】そこで、実質的に抗原と抗体の結合を解離
させずにアクリジニウムエステルを非発光型から発光型
に充分変化させることが可能で、そのｐＨで緩衝能力を
持つ緩衝剤を含有できる単一の洗浄液のｐＨを探索し
た。具体的には、抗原と抗体の結合が解離しないｐＨの
範囲で、アクリジニウムエステルが非発光型から発光型
へ変化することが可能なｐＨを探究することであり、研
究を重ねた結果遂にｐＨ５．０〜６．０の洗浄液が本発
明の目的に適合することを見出すに至った。緩衝剤とし
ては、使用するｐＨで緩衝能力を持つものであればなん
でもよい。例えばクエン酸、マレイン酸、酢酸、リン
酸、ほう酸、炭酸等の水溶性有機酸ないし無機酸、それ
らの水素酸またはそれらの水溶性塩等を単独または併用
して用いることができる。その濃度は、緩衝能力を維持
することができる濃度であればよい。
させずにアクリジニウムエステルを非発光型から発光型
に充分変化させることが可能で、そのｐＨで緩衝能力を
持つ緩衝剤を含有できる単一の洗浄液のｐＨを探索し
た。具体的には、抗原と抗体の結合が解離しないｐＨの
範囲で、アクリジニウムエステルが非発光型から発光型
へ変化することが可能なｐＨを探究することであり、研
究を重ねた結果遂にｐＨ５．０〜６．０の洗浄液が本発
明の目的に適合することを見出すに至った。緩衝剤とし
ては、使用するｐＨで緩衝能力を持つものであればなん
でもよい。例えばクエン酸、マレイン酸、酢酸、リン
酸、ほう酸、炭酸等の水溶性有機酸ないし無機酸、それ
らの水素酸またはそれらの水溶性塩等を単独または併用
して用いることができる。その濃度は、緩衝能力を維持
することができる濃度であればよい。
【００１１】洗浄方法は、抗原と抗体の結合が解離しな
いｐＨの範囲で洗浄を行うことで、通常の洗浄方法と全
く同じ様に行うことができる。洗浄後の残量は特に規定
しないが、固相の表面にアクリジニウムエステルが固定
化された形で存在することから、洗浄後は固相の表面に
薄い膜状に残ることが望ましい。化学発光開始剤である
酸化性物質（例えば、過酸化水素）を加える時点は、洗
浄液および／あるいはアルカリ溶液と混合させることが
望ましい。その量は、アクリジニウムエステルを発光さ
せることができるだけの量を含有させればよい。その量
は、洗浄後に残ったアクリジニウムエステルの量に対し
て１０倍以上の量であることが望ましい。測定に用いる
アクリジニウムエステルは、公知のアクリジニウムエス
テルが使用できる。この種の化合物の例示としては、ア
クリジニウムＩ（化学名；４−（２−サクシニミジルオ
キシカルボニル）フェニル−１０−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレート フルオロサルホネート、同
仁化学（株）製品）があげられる。
いｐＨの範囲で洗浄を行うことで、通常の洗浄方法と全
く同じ様に行うことができる。洗浄後の残量は特に規定
しないが、固相の表面にアクリジニウムエステルが固定
化された形で存在することから、洗浄後は固相の表面に
薄い膜状に残ることが望ましい。化学発光開始剤である
酸化性物質（例えば、過酸化水素）を加える時点は、洗
浄液および／あるいはアルカリ溶液と混合させることが
望ましい。その量は、アクリジニウムエステルを発光さ
せることができるだけの量を含有させればよい。その量
は、洗浄後に残ったアクリジニウムエステルの量に対し
て１０倍以上の量であることが望ましい。測定に用いる
アクリジニウムエステルは、公知のアクリジニウムエス
テルが使用できる。この種の化合物の例示としては、ア
クリジニウムＩ（化学名；４−（２−サクシニミジルオ
キシカルボニル）フェニル−１０−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボキシレート フルオロサルホネート、同
仁化学（株）製品）があげられる。
【００１２】本発明に使用する固相用担体としては、ビ
ーズ、試験管、マイクロプレート、マイクロパーティク
ル、ガラス繊維集合体（例えばガラス繊維ろ紙）、セル
ロース繊維集合体等があるが、とりわけガラス繊維集合
体が好適である。これはガラスが測定対象物質や試薬に
対して活性を持たないこと、繊維集合体は同体積のガラ
ス固体と比較して表面積が大きく、測定対象や試薬の保
持性に優れていること、さらに発光および蛍光検出にお
いての光の透過性が良いためである。
ーズ、試験管、マイクロプレート、マイクロパーティク
ル、ガラス繊維集合体（例えばガラス繊維ろ紙）、セル
ロース繊維集合体等があるが、とりわけガラス繊維集合
体が好適である。これはガラスが測定対象物質や試薬に
対して活性を持たないこと、繊維集合体は同体積のガラ
ス固体と比較して表面積が大きく、測定対象や試薬の保
持性に優れていること、さらに発光および蛍光検出にお
いての光の透過性が良いためである。
【００１３】
【発明の効果】洗浄の際のｐＨが、抗原と抗体の結合が
解離しないｐＨとすることで、アクリジニウムエステル
で標識を行った抗体が固相から脱離することによる測定
値の変化が起こることを防止することができる。洗浄と
同時に、アクリジニウムエステルを非発光型から発光型
に変化させることで、一回溶液を添加しただけでは充分
に溶液が浸透しない部分に存在するアクリジニウムエス
テルに対しても効率よく非発光型から発光型に変化させ
ることが可能となる。
解離しないｐＨとすることで、アクリジニウムエステル
で標識を行った抗体が固相から脱離することによる測定
値の変化が起こることを防止することができる。洗浄と
同時に、アクリジニウムエステルを非発光型から発光型
に変化させることで、一回溶液を添加しただけでは充分
に溶液が浸透しない部分に存在するアクリジニウムエス
テルに対しても効率よく非発光型から発光型に変化させ
ることが可能となる。
【００１４】また、洗浄と酸性化処理の二つの工程を一
つの工程とすることで、実験操作を行う手間が少なくな
り、さらに処理の時間を短縮することができる。また、
洗浄液は、使用後減圧吸引により強制脱液させるため
に、アルカリ溶液添加時は極少量しか存在しないので、
アルカリ溶液の発光開始剤としての力価は殆ど低下しな
い。従ってアクリジニウムエステルがより効率良く発光
反応を生じる。以下に本発明の態様を実施例により説明
するが、本発明の技術思想はこれら例示に限定されるも
のではない。
つの工程とすることで、実験操作を行う手間が少なくな
り、さらに処理の時間を短縮することができる。また、
洗浄液は、使用後減圧吸引により強制脱液させるため
に、アルカリ溶液添加時は極少量しか存在しないので、
アルカリ溶液の発光開始剤としての力価は殆ど低下しな
い。従ってアクリジニウムエステルがより効率良く発光
反応を生じる。以下に本発明の態様を実施例により説明
するが、本発明の技術思想はこれら例示に限定されるも
のではない。
【００１５】実施例１ 特開平４−２０３９６８号公報に記載のガラス繊維の集
合体を用いる測定法に準じてαフェトプロテイン（以
下、ＡＦＰとする）の測定を行った。 １）アビジン結合ガラス繊維ろ紙の作製 ガラス繊維ろ紙（ワットマン製Ｆ１４５−０３ 厚さ
１．３ｍｍ）を３−アミノプロピルトリエトキシシラン
の２％アセトン溶液中に、室温で３０分間浸漬してガラ
スと３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応さ
せ、アミノ化ガラス繊維ろ紙を得た。アミノ化ガラス繊
維ろ紙を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（同仁化学製）０．
０１２５ｍｇ／ｍｌ を含む０．１ｍｏｌ／ｌ リン酸
ナトリウム緩衝液（以下、ＮａＰＢとする）（ｐＨ８．
０）中に、室温で３０分間浸漬し、反応させた。蒸留水
で洗浄した後、ビオチンを導入したガラス繊維ろ紙をア
ビジン０．１ｍｇ／ｍｌ を含む０．１ｍｏｌ／ｌ Ｎ
ａＰＢ（ｐＨ７．０）中に、室温で３０分間浸漬した。
蒸留水で洗浄した後、アビジンを導入したガラス繊維ろ
紙を溶液状ブロックエース（雪印製）に室温で３０分間
浸漬することで、アビジン結合ガラス繊維ろ紙を得た。
合体を用いる測定法に準じてαフェトプロテイン（以
下、ＡＦＰとする）の測定を行った。 １）アビジン結合ガラス繊維ろ紙の作製 ガラス繊維ろ紙（ワットマン製Ｆ１４５−０３ 厚さ
１．３ｍｍ）を３−アミノプロピルトリエトキシシラン
の２％アセトン溶液中に、室温で３０分間浸漬してガラ
スと３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応さ
せ、アミノ化ガラス繊維ろ紙を得た。アミノ化ガラス繊
維ろ紙を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（同仁化学製）０．
０１２５ｍｇ／ｍｌ を含む０．１ｍｏｌ／ｌ リン酸
ナトリウム緩衝液（以下、ＮａＰＢとする）（ｐＨ８．
０）中に、室温で３０分間浸漬し、反応させた。蒸留水
で洗浄した後、ビオチンを導入したガラス繊維ろ紙をア
ビジン０．１ｍｇ／ｍｌ を含む０．１ｍｏｌ／ｌ Ｎ
ａＰＢ（ｐＨ７．０）中に、室温で３０分間浸漬した。
蒸留水で洗浄した後、アビジンを導入したガラス繊維ろ
紙を溶液状ブロックエース（雪印製）に室温で３０分間
浸漬することで、アビジン結合ガラス繊維ろ紙を得た。
【００１６】２）アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体の
作製 抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
（ｐＨ８．０）に溶解し１ｍｇ／ｌ の溶液を調整し
た。アクリジニウムＩをジメチルスルホキシドに溶解し
０．５ｍｏｌ／ｌ の溶液を調整した。ＤＬ−リジンを
０．１ｍｏｌ／ｌＮａＰＢ（ｐＨ８．０）に溶解し５０
ｇ／ｌ の溶液を調整した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍ
ｌ にアクリジニウムＩ溶液０．１ｍｌを添加し、室温
で３０分間反応させる。ＤＬ−リジン溶液を０．１ｍｌ
添加し、室温で１５分反応させた。ウルトラフリーＣ
３・ＣＬ（ミリポア製）を用いて、０．１ｍｏｌ／ｌ
ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）で洗浄し、０．００１ｍｇ／ｍ
ｌ の濃度に調整することで、アクリジニウムＩ標識抗
ＡＦＰ抗体を得た。
作製 抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ
（ｐＨ８．０）に溶解し１ｍｇ／ｌ の溶液を調整し
た。アクリジニウムＩをジメチルスルホキシドに溶解し
０．５ｍｏｌ／ｌ の溶液を調整した。ＤＬ−リジンを
０．１ｍｏｌ／ｌＮａＰＢ（ｐＨ８．０）に溶解し５０
ｇ／ｌ の溶液を調整した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍ
ｌ にアクリジニウムＩ溶液０．１ｍｌを添加し、室温
で３０分間反応させる。ＤＬ−リジン溶液を０．１ｍｌ
添加し、室温で１５分反応させた。ウルトラフリーＣ
３・ＣＬ（ミリポア製）を用いて、０．１ｍｏｌ／ｌ
ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）で洗浄し、０．００１ｍｇ／ｍ
ｌ の濃度に調整することで、アクリジニウムＩ標識抗
ＡＦＰ抗体を得た。
【００１７】３）ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体の作製 抗ＡＦＰ抗体（自社製）を０．１ｍｏｌ／ｌ 炭酸水素
ナトリウム（以下、ＮａＨＣＯ3 とする。）に溶解し
１ｍｇ／ｌ の溶液を調整した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチ
ンをジメチルスルホキシドに溶解し３ｇ／ｌ の溶液を
調整した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌ にＮＨＳ−Ｌ
Ｃ−ビオチン溶液０．１ｍｌ を添加し、室温で２時間
反応させた。セロファンの透析膜に入れて、１００倍量
の０．０１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）の溶液
で透析を３回行い、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整す
ることで、ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を得た。
ナトリウム（以下、ＮａＨＣＯ3 とする。）に溶解し
１ｍｇ／ｌ の溶液を調整した。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチ
ンをジメチルスルホキシドに溶解し３ｇ／ｌ の溶液を
調整した。抗ＡＦＰ抗体溶液０．９ｍｌ にＮＨＳ−Ｌ
Ｃ−ビオチン溶液０．１ｍｌ を添加し、室温で２時間
反応させた。セロファンの透析膜に入れて、１００倍量
の０．０１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）の溶液
で透析を３回行い、０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整す
ることで、ビオチン標識抗ＡＦＰ抗体を得た。
【００１８】４）洗浄後の作製 ２．１ｇ のクエン酸１水和物（ナカライテスク製）、
１０ｍｌ の３０％過酸化水素水（ナカライテスク
製）、１ｇ のＴｗｅｅｎ２０（ナカライテスク製）を
適量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテ
スク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ５．２ に調整
し、精製水で１ｌ に調整した。 ５）ＡＦＰ溶液の作製 ＡＦＰを０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）の
溶液に溶解して０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎ
ｇ／ｍｌ の濃度のＡＦＰ溶液を作製した。
１０ｍｌ の３０％過酸化水素水（ナカライテスク
製）、１ｇ のＴｗｅｅｎ２０（ナカライテスク製）を
適量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ（ナカライテ
スク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ５．２ に調整
し、精製水で１ｌ に調整した。 ５）ＡＦＰ溶液の作製 ＡＦＰを０．１ｍｏｌ／ｌ ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）の
溶液に溶解して０ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎ
ｇ／ｍｌ の濃度のＡＦＰ溶液を作製した。
【００１９】６）ＡＦＰの測定 ６）−１免疫複合体の形成工程 アクリジニウムＩ標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌ と、ビ
オチン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、各濃度に調整し
たＡＦＰ溶液０．８ｍｌ を混合し、３０分間室温で反
応させた。 ６）−２固相への固定工程 この反応液の０．０６ｍｌ を、直径９ｍｍ の大きさ
に切ったアビジン結合ガラス繊維ろ紙に分注し、１０分
間室温で反応させた。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 １０ｍｌ の洗浄液でブフナーロートにろ紙を置き、こ
の上に先に反応させたアビジン結合ガラス繊維ろ紙を置
き、水流ポンプで吸引しながら１０ｍｌ の洗浄液を上
から添加して洗浄した。１５分間室温で放置した。 ６）−４発光開始および発光量測定工程 １Ｎ−ＮａＯＨを０．０４ｍｌ 加えて発光を行わせ、
その時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）を用いて
測定した。実施例１の結果を表１に示す。
オチン標識抗ＡＦＰ抗体０．１ｍｌと、各濃度に調整し
たＡＦＰ溶液０．８ｍｌ を混合し、３０分間室温で反
応させた。 ６）−２固相への固定工程 この反応液の０．０６ｍｌ を、直径９ｍｍ の大きさ
に切ったアビジン結合ガラス繊維ろ紙に分注し、１０分
間室温で反応させた。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 １０ｍｌ の洗浄液でブフナーロートにろ紙を置き、こ
の上に先に反応させたアビジン結合ガラス繊維ろ紙を置
き、水流ポンプで吸引しながら１０ｍｌ の洗浄液を上
から添加して洗浄した。１５分間室温で放置した。 ６）−４発光開始および発光量測定工程 １Ｎ−ＮａＯＨを０．０４ｍｌ 加えて発光を行わせ、
その時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）を用いて
測定した。実施例１の結果を表１に示す。
【００２０】
【表１】 表中のＳＤおよびＣＶは標準偏差および変動係数であ
る。以下の表についても同じ。
る。以下の表についても同じ。
【００２１】実施例２ 実施例１において、下記の点のみ変更し、その他は同じ
ようにして測定を行った。 ５）ＡＦＰ溶液の作製 希釈液として、ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）に代えて実施例
１の洗浄液（ｐＨ５．２）を使用した。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例１で洗浄後放置時間を設けたことに代えて、「直
ちに」発光開始および発光量測定工程へ移行させた。実
施例２の結果を表２に示す。
ようにして測定を行った。 ５）ＡＦＰ溶液の作製 希釈液として、ＮａＰＢ（ｐＨ８．０）に代えて実施例
１の洗浄液（ｐＨ５．２）を使用した。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例１で洗浄後放置時間を設けたことに代えて、「直
ちに」発光開始および発光量測定工程へ移行させた。実
施例２の結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】実施例３ 甲状腺刺激ホルモン（以下、ＴＳＨとする）の測定を行
った。 １）アビジン結合ガラス繊維ろ紙の作製 実施例１で作製したアビジン結合ガラス繊維ろ紙を用い
た。 ２）アクリジニウムＩ標識抗ＴＳＨ抗体の作製 実施例１と同じ方法で、抗ＡＦＰ抗体を抗ＴＳＨ抗体
（メディックス バイオケミカ社製）に変更して作製し
た、アクリジニウムＩ標識抗ＴＳＨ抗体を用いた。 ３）ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体の作製 実施例１と同じ方法で、抗ＡＦＰ抗体を抗ＴＳＨ抗体
（メディックス バイオケミカ社製）に変更して作製し
た、ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体を用いた。 ４）洗浄液の作製 実施例１で作製した洗浄液を用いた。 ５）ＴＳＨ溶液の作製 ＴＳＨを洗浄液に溶解して０ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ
／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ の濃度のＴＳＨ溶液を作製
した。
った。 １）アビジン結合ガラス繊維ろ紙の作製 実施例１で作製したアビジン結合ガラス繊維ろ紙を用い
た。 ２）アクリジニウムＩ標識抗ＴＳＨ抗体の作製 実施例１と同じ方法で、抗ＡＦＰ抗体を抗ＴＳＨ抗体
（メディックス バイオケミカ社製）に変更して作製し
た、アクリジニウムＩ標識抗ＴＳＨ抗体を用いた。 ３）ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体の作製 実施例１と同じ方法で、抗ＡＦＰ抗体を抗ＴＳＨ抗体
（メディックス バイオケミカ社製）に変更して作製し
た、ビオチン標識抗ＴＳＨ抗体を用いた。 ４）洗浄液の作製 実施例１で作製した洗浄液を用いた。 ５）ＴＳＨ溶液の作製 ＴＳＨを洗浄液に溶解して０ｎｇ／ｍｌ、０．０１ｎｇ
／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ の濃度のＴＳＨ溶液を作製
した。
【００２４】６）ＴＳＨの測定 ６）−１免疫複合体の形成工程 アクリジニウムＩ標識抗ＴＳＨ抗体０．１ｍｌ と、ビ
オチン標識抗ＴＳＨ抗体０．１ｍｌ と、各濃度に調整
したＴＳＨ溶液０．８ｍｌ を混合し、３０分間室温で
反応させた。 ６）−２固相への固定工程 この反応液の０．０６ｍｌ を、直径９ｍｍ の大きさ
に切ったアビジン結合ガラス繊維ろ紙に分注し、１０分
間室温で反応させた。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 １０ｍｌ の洗浄液でブフナーロートにろ紙を置き、こ
の上に先に反応させたアビジン結合ガラス繊維ろ紙を置
き、水流ポンプで吸引しながら１０ｍｌ の洗浄液を上
から添加して洗浄した。 ６）−４発光開始および発光量測定工程 直ちに、１Ｎ−ＮａＯＨを０．０４ｍｌ 加えて発光を
行わせ、その時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）
を用いて測定した。実施例３の結果を表３に示す。
オチン標識抗ＴＳＨ抗体０．１ｍｌ と、各濃度に調整
したＴＳＨ溶液０．８ｍｌ を混合し、３０分間室温で
反応させた。 ６）−２固相への固定工程 この反応液の０．０６ｍｌ を、直径９ｍｍ の大きさ
に切ったアビジン結合ガラス繊維ろ紙に分注し、１０分
間室温で反応させた。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 １０ｍｌ の洗浄液でブフナーロートにろ紙を置き、こ
の上に先に反応させたアビジン結合ガラス繊維ろ紙を置
き、水流ポンプで吸引しながら１０ｍｌ の洗浄液を上
から添加して洗浄した。 ６）−４発光開始および発光量測定工程 直ちに、１Ｎ−ＮａＯＨを０．０４ｍｌ 加えて発光を
行わせ、その時の発光量を極微弱光測定装置（自社製）
を用いて測定した。実施例３の結果を表３に示す。
【００２５】
【表３】
【００２６】比較例１ 実施例１に対して下記の点が異なり、その他は同じよう
にして対照させた。 ４）洗浄液の作製 実施例１の洗浄液（ｐＨ５．２）に代えて、下記の洗浄
液を作製した。リン酸水素２ナトリウム１２水和物（ナ
カライテスク製）、１ｇのＴｗｅｅｎ２０（ナカライテ
スク製）を適量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ
（ナカライテスク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ７．
４に調整し、精製水で１ｌに調整した。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例１が洗浄後、室温で１５分間放置したことに代え
て、上記洗浄液で洗浄後、下記酸性化緩衝溶液を添加
し、室温で１５分間保持した。クエン酸１水和物（ナカ
ライテスク製）、１０ｍｌの３０％過酸化水素水（ナカ
ライテスク製）を適量の精製水で溶解した。１Ｎ−Ｎａ
ＯＨ（ナカライテスク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ
４．０に調整し、精製水で１ｌに調整した。比較例１の
結果を表４に示す。
にして対照させた。 ４）洗浄液の作製 実施例１の洗浄液（ｐＨ５．２）に代えて、下記の洗浄
液を作製した。リン酸水素２ナトリウム１２水和物（ナ
カライテスク製）、１ｇのＴｗｅｅｎ２０（ナカライテ
スク製）を適量の精製水で溶解した。１Ｎ−ＮａＯＨ
（ナカライテスク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ７．
４に調整し、精製水で１ｌに調整した。 ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例１が洗浄後、室温で１５分間放置したことに代え
て、上記洗浄液で洗浄後、下記酸性化緩衝溶液を添加
し、室温で１５分間保持した。クエン酸１水和物（ナカ
ライテスク製）、１０ｍｌの３０％過酸化水素水（ナカ
ライテスク製）を適量の精製水で溶解した。１Ｎ−Ｎａ
ＯＨ（ナカライテスク製）でｐＨメーターを用いてｐＨ
４．０に調整し、精製水で１ｌに調整した。比較例１の
結果を表４に示す。
【００２７】
【表４】
【００２８】比較例２ 実施例３に対して、下記の点が異なり、その他は同じよ
うにして対照させた。 ４）洗浄液の作製 実施例３の洗浄液（ｐＨ５．２）に代えて、比較例１と
同じとした。（ｐＨ７．４） ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例３が洗浄後、「直ちに」発光開始および発光量測
定工程へ移行させたのに対して、比較例１と同じとし
た。比較例２の結果を表５に示す。
うにして対照させた。 ４）洗浄液の作製 実施例３の洗浄液（ｐＨ５．２）に代えて、比較例１と
同じとした。（ｐＨ７．４） ６）−３洗浄および発光型への変化工程 実施例３が洗浄後、「直ちに」発光開始および発光量測
定工程へ移行させたのに対して、比較例１と同じとし
た。比較例２の結果を表５に示す。
【００２９】
【表５】
【００３０】実施例ならびに比較例結果の評価 実施例１ 比較例１と対比して、低濃度の検体におけ
る測定値のバラツキが格段に改良された。 実施例２ 実施例１と対比して、測定値のバラツキは
同程度であるが、発光量の絶対値が増大した。また測定
試料の希釈液もｐＨ５〜６のものを使用すれば、発光量
への変化工程における放置時間は不要となることを示し
た。 実施例３ 比較例２と対比して、発光量が増大し、し
かも測定値のバラツキが格段に改良された。
る測定値のバラツキが格段に改良された。 実施例２ 実施例１と対比して、測定値のバラツキは
同程度であるが、発光量の絶対値が増大した。また測定
試料の希釈液もｐＨ５〜６のものを使用すれば、発光量
への変化工程における放置時間は不要となることを示し
た。 実施例３ 比較例２と対比して、発光量が増大し、し
かも測定値のバラツキが格段に改良された。
Claims (5)
- 【請求項１】 測定試料中に含まれる抗原を定量するた
めに、アクリジニウムエステルを標識物質として用いる
免疫学的な発光測定法であり、以下の工程すなわち （ａ）希釈液を用いて測定試料を任意の濃度に希釈する
工程 （ｂ）抗原を特異的に認識しアクリジニウムエステルで
標識された抗体と、固相上に固定するために処理された
生理活性物質とを含む試薬を、測定試料中に含まれる抗
原と抗原抗体反応により結合させて、免疫複合体を形成
する工程 （ｃ）該免疫複合体を固相上に固定する工程 （ｄ）アクリジニウムエステルで標識された抗体のう
ち、反応に関与しなかった抗体を、洗浄液を用いて分離
すると同時にアクリジニウムエステルを非発光型から発
光型に変化させる工程 （ｅ）アルカリ性の溶液を加えて発光させ、発光量を測
定する工程 の各工程を順に持つ測定方法において、（ａ）の工程で
使用する希釈液、（ｂ）の工程で使用する試薬、（ｄ）
の工程で使用する洗浄液のうち、少なくとも洗浄液のｐ
Ｈが５〜６であることを特徴とする、アクリジニウムエ
ステルを標識物質とする化学発光測定法。 - 【請求項２】 （ａ）の工程で使用する希釈液、（ｂ）
の工程で使用する試薬、（ｄ）の工程で使用する洗浄液
のうち、試薬と洗浄液のｐＨが５〜６であることを特徴
とする、請求項１に記載の化学発光測定法。 - 【請求項３】 （ａ）の工程で使用する希釈液、（ｂ）
の工程で使用する試薬、（ｄ）の工程で使用する洗浄液
のうち、希釈液と洗浄液のｐＨが５〜６であることを特
徴とする、請求項１に記載の化学発光測定法。 - 【請求項４】 （ａ）の工程で使用する希釈液、（ｂ）
の工程で使用する試薬、（ｄ）の工程で使用する洗浄液
のそれぞれのｐＨが５〜６であることを特徴とする、請
求項１に記載の化学発光測定法。 - 【請求項５】 測定試料の希釈を必要としない場合に
は、（ａ）の工程を省略する、請求項１、２、３または
４に記載の化学発光測定法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6206795A JPH08233820A (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 化学発光測定法 |
| EP96301173A EP0729030A1 (en) | 1995-02-23 | 1996-02-21 | Chemiluminescence method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6206795A JPH08233820A (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 化学発光測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08233820A true JPH08233820A (ja) | 1996-09-13 |
Family
ID=13189393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6206795A Pending JPH08233820A (ja) | 1995-02-23 | 1995-02-23 | 化学発光測定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0729030A1 (ja) |
| JP (1) | JPH08233820A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105628914B (zh) * | 2016-02-04 | 2019-01-08 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种能使吖啶酯抗原抗体结合物稳定的稀释液及其制备方法 |
| CN111855996A (zh) * | 2019-09-19 | 2020-10-30 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种能提高吖啶酯抗原抗体结合物稳定性并降低本底的稀释液及其制备方法 |
| CN112684167A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-20 | 安邦（厦门）生物科技有限公司 | 一种化学发光免疫试剂、冻干微球及其及冻干微球的制备方法 |
| CN115656153B (zh) * | 2022-10-26 | 2024-07-30 | 广东优尼德生物科技有限公司 | 一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4950613A (en) * | 1988-02-26 | 1990-08-21 | Gen-Probe Incorporated | Proteted chemiluminescent labels |
| JPH0579985A (ja) * | 1991-09-24 | 1993-03-30 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | 化学発光増強剤及び増強方法 |
-
1995
- 1995-02-23 JP JP6206795A patent/JPH08233820A/ja active Pending
-
1996
- 1996-02-21 EP EP96301173A patent/EP0729030A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0729030A1 (en) | 1996-08-28 |
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