CN111665352B - 一种储存剂及由其制备的抗体溶液制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种储存剂及由其制备的含人抗c‑Myc免疫球蛋白1的抗体溶液制剂及其应用。所述储存剂的配方包含蛋白保护剂、表面活性剂、稳定剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂和缓冲剂中的至少一种，其中所述的表面活性剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407或聚乙二醇400中的至少一种，所述表面活性剂的浓度为0.005～0.05％(W/V)。所述含人抗c‑Myc免疫球蛋白1的抗体溶液制剂包含人抗c‑Myc免疫球蛋白1抗体和上述储存剂；其中所述人抗c‑Myc免疫球蛋白1抗体的浓度为0.3‑300μg/mL。本发明储存剂配方可提高人抗c‑Myc免疫球蛋白1在常温液态保存的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种储存剂及由其制备的抗体溶液制剂及其应用，具体地，涉及一种优化的能稳定保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的储存剂及由其制备的含人抗c-Myc免疫球蛋白1(9E10-IgG1)的抗体溶液制剂、及其用途。
背景技术
抗体是一种免疫球蛋白，因其可以稳定结合特异性抗原，所以被广泛用于临床诊断或治疗研究。与此同时，抗体又是一种生物活性蛋白类物质，其生物学活性不可避免地受到温度等条件的影响。抗体在体外诊断试剂中的长期稳定保存，是影响产品性能和有效期的关键因素。
目前保存抗体方法主要有-20℃及以下低温保存，2-8℃低温保存，或者采用冷冻干燥的方式保存抗体。-20℃及以下低温冷冻保存极大地保证了抗体的储存和活性；但-20℃及以下低温冷冻保存产品在使用过程中需要解冻，抗体的冻融可能会导致蛋白变性或聚体的形成，从而影响其活性。另外产品在需要-20℃及以下低温运输条件，从而增加了运输成本。
抗体采用冷冻干燥制成的冻干粉保存方式能实现长期稳定的保存要求，但冻干保存需要购置昂贵的冻干设备，配备专业的技术人员，冻干工艺复杂，冻干周期长，使用受到限制。抗体采用2～8℃冷藏保存，该保存方式可以保证绝大多数抗体的保存要求，但在大多数溶液状态下，抗体仅能保存1到6个月的时间，另外储存运输也需要低温冷藏条件，增加了成本。因此急需一种能长期保存抗体的抗体制剂。
在对相关蛋白进行定量或定性检测的诊断试剂盒中，标准品通常为各类抗体，标准品保存的稳定性，是影响试剂盒和定量结果的重要因素。Anti-myc tag antibody[9e10]具有较好的特异性，已广泛用于WB杂交、免疫沉淀、流式细胞术、ELISA等各类免疫检测，在某些抗原的定量或半定量检测中，由于待测物质没有国家标准品，而天然产物又提取困难，人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体可作为校准品，对待测物质(含Myc标签)进行定量或半定量检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为克服现有技术的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂保存时间较短、成本高昂、工艺复杂、保存稳定性较差的缺陷，提供一种优化的储存剂及由其制备的抗体溶液制剂及其应用。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案之一为：一种用于液态保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的储存剂，所述储存剂包含蛋白保护剂、表面活性剂、稳定剂、抗氧化剂、螯合剂、防腐剂和缓冲剂中的至少一种，其中所述的表面活性剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407或聚乙二醇400中的至少一种，所述表面活性剂的浓度为0.005～0.05％(W/V)。
W/V是指该组分占所述溶液的质量体积百分比。
较佳地，所述表面活性剂中，所述泊洛沙姆188和聚乙二醇400的质量比例为3:1；所述泊洛沙姆188的浓度为0.0075％(W/V)，所述聚乙二醇400的浓度为0.0025％(W/V)。
较佳地，所述蛋白保护剂为驴血清和鱼皮胶原中的至少一种，所述蛋白保护剂的浓度为2～10％(V/V)，优选为5％(V/V)的驴血清；和/或，所述稳定剂选自乳糖酸、干酪素钠和海藻糖中的至少一种，所述稳定剂的浓度为0.1～10％(W/V)。优选地，所述稳定剂的浓度为0.25～4％(W/V)。更优选地，所述稳定剂为海藻糖，所述海藻糖的浓度为3％(W/V)。
V/V是指该组分占所述溶剂的体积百分比。
较佳地，所述抗氧化剂为硫代硫酸钠，所述硫代硫酸钠的浓度为0.01～0.1％(W/V)。优选地，所述硫代硫酸钠的浓度为0.03％(W/V)；和/或，所述螯合剂为EDTA二钠，所述EDTA二钠的浓度为0.1mM～10mM。优选地，所述EDTA二钠的浓度为1mM；和/或，所述防腐剂为选自叠氮钠、硫柳汞、Proclin、Krovin和抗生素中的至少一种，所述防腐剂的浓度为0.01～0.1％。优选地，所述防腐剂为Proclin300，所述Proclin300的浓度为0.03％(V/V)；和/或，优选地，所述防腐剂为叠氮钠，所述叠氮钠的浓度为0.05％(V/V)。
较佳地，所述缓冲剂选自磷酸盐、柠檬酸盐、Tris盐和HEPES缓冲液中的一种，所述缓冲剂的浓度为8mM～100mM，pH为6.2-7.8。优选地，所述缓冲剂为8-12mM磷酸盐缓冲液，pH值7.4～7.8。更优选地，所述缓冲剂为10mM磷酸盐缓冲液，pH值7.55～7.65，其中所述10mM磷酸盐缓冲液包含：磷酸二氢钠：0.02％(W/V)，十二水合磷酸氢二钠：0.29％(W/V)，氯化钾：0.02％(W/V)，氯化钠：0.8％(W/V)。
较佳地，所述储存剂包含5％的驴血清或鱼皮胶原、0.0075％的泊洛沙姆188和0.0025％的聚乙二醇400的混合物、3％的海藻糖、0.03％硫代硫酸钠、1mM的EDTA二钠、0.03％的Proclin300、10mM的磷酸盐。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种如上所述的储存剂在制备人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种含人抗c-Myc免疫球蛋白1的抗体溶液制剂，所述溶液制剂包含人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体和如上任一所述的储存剂；其中所述人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的浓度为0.3-300μg/mL。
较佳地，所述人抗c-Myc免疫球蛋白1的浓度为1-5μg/ml；
所述表面活性剂为泊洛沙姆188和聚乙二醇400的混合物，所述泊洛沙姆188的浓度为0.0075％(W/V)，所述聚乙二醇400的浓度为0.0025％(W/V)；
所述蛋白保护剂为驴血清，浓度为5％(V/V)；
所述稳定剂为海藻糖，所述海藻糖的浓度为3％(W/V)；
所述抗氧化剂为硫代硫酸钠，所述硫代硫酸钠的浓度为0.03％(W/V)；
所述螯合剂为EDTA二钠，所述EDTA二钠的浓度为1mM；
所述防腐剂为Proclin300，其中所述Proclin300的浓度为0.03％(V/V)；
所述缓冲剂为10mM磷酸盐缓冲液，pH为7.55～7.65。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：提供一种所述抗体溶液制剂在制备体外检测人抗c-Myc免疫球蛋白的试剂盒中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明与现有技术相比具有以下积极效果：
本发明所述的用于液态保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的储存剂及抗体溶液制剂产品，其无需低温保存抗体或蛋白，其在常温下即可保存人抗c-Myc免疫球蛋白1及人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体，且保存时间长，其可大大提高蛋白或抗体的稳定性。与solarbio公司的抗体稀释液(货号A1800)相比较，本发明所述的抗体储存剂和抗体溶液制剂均能够常温下保存人抗c-Myc免疫球蛋白1超过8个月，与-80℃保存8个月的样品基本一致(差异＜10％)，表明使用本发明提供的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体液态保存的储存剂及人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂，其保存效果显著优于1％BSA配方及A1800配方保存，以一种经济、节能、便捷的方式，大幅延长抗体的保存期限，同时保证抗体活性。
附图说明
图1为本发明不同配方测定的荧光值活性比较；
图2为本发明抗体溶液制剂与其他抗体液态保存储存剂的保存效果对比；
图3为本发明不同浓度的抗体储存剂室温8个月与-80℃保存的效果比较。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：用于抗体液态保存的储存剂最佳组份的筛选
利用如下配制方法，按下表1配制不同配方的储存剂。
配制方法：称取0.2g的磷酸二氢钠、2.9g的十二水合磷酸氢二钠、0.2g的氯化钾、8g的氯化钠，加入适量纯化水，制备成10mM磷酸盐缓冲液备用。将泊洛沙姆188、海藻糖、硫代硫酸钠、EDTA二钠，加入适量的纯化水，再加入上述10mM磷酸盐缓冲液，搅拌溶解，量取驴血清、Proclin300，加入溶液中并混匀，使用3mol/L的氢氧化钠或3mol/L的盐酸，调溶液pH至7.6±0.05，使用纯化水，将配制的溶液体积定容至1L，最后，使用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤。
将人抗c-Myc免疫球蛋白1保存在下表1所述的5种配方中，于常温条件保存8个月后，分别测定荧光值，同时将-80℃保存8个月的人抗c-Myc免疫球蛋白1样品作为对照组，将各组测定的荧光值进行对比，不同配方测定的荧光值比较数据见表2所示。
表1不同配方储存剂配置方法
表2不同配方测定的荧光值比较
结果如表2和/或图1所示，配方1、配方3和配方4测定的各稀释梯度荧光值与对照组-80℃保存的样品均有降低，配方2、配方5测定的各稀释梯度荧光值与-80℃保存的样品基本一致(差异＜10％)，但是配方2相比于配方5而言，其测定的各稀释梯度荧光值与-80℃保存的样品更加接近。表明本发明筛选到的储存剂优选的各组份最佳组成为配方2所述：驴血清：5％(V/V)，泊洛沙姆188:0.0075％(W/V)，聚乙二醇400:0.0025％(W/V)，海藻糖：3％(W/V)，硫代硫酸钠：0.03％(W/V)，EDTA二钠：1mM，Proclin300:0.03％(V/V)，10mM磷酸盐缓冲液，调pH至7.6±0.05。
实施例2：本发明用于抗体液体液态保存的储存剂的配制
原料：磷酸二氢钠：0.02％(W/V)，十二水合磷酸氢二钠：0.29％(W/V)，氯化钾：0.02％(W/V)，氯化钠：0.8％(W/V)，驴血清：5％(V/V)，泊洛沙姆188:0.0075％(W/V)，聚乙二醇400:0.0025％(W/V)，海藻糖：3％(W/V)，硫代硫酸钠：0.03％(W/V)，EDTA二钠：1mM，Proclin300：0.03％(V/V)。调pH至7.6±0.05。
配制方法：称取0.2g的磷酸二氢钠、2.9g的十二水合磷酸氢二钠、0.2g的氯化钾、8g的氯化钠、0.075g的泊洛沙姆188、0.025g的聚乙二醇400、30g的海藻糖、0.03g的硫代硫酸钠、0.336g的EDTA二钠，加入800mL的纯化水中并搅拌溶解，量取50mL的驴血清、300μL的Proclin300，加入溶液中并混匀，使用3mol/L的氢氧化钠或3mol/L的盐酸，调溶液pH至7.6±0.05，使用纯化水，将配制的溶液体积定容至1L，最后，使用0.22μm的滤膜，对溶液进行过滤。
使用本发明提供的最优人抗c-Myc免疫球蛋白1储存剂，可在常温条件下稳定保存至少8个月。
实施例3：本发明抗体溶液制剂与其他抗体液态保存储存剂的保存效果对比
将本发明所述3μg/ml的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体加入上述用实施例2制得的溶液，混合均匀，即得到本发明所述的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体(9E10-IgG1)溶液制剂，在常温条件下保存此人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体(9E10-IgG1)共计8个月；与solarbio公司的抗体稀释液(货号A1800)4℃条件下保存8个月的9E10-IgG1(以下简称A1800)；含0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液常温保存8个月的9E10-IgG1，-80摄氏度保存的9E10-IgG1的抗体原液对照。各组进行抗体比活性比较。对抗体比活性用液相蛋白芯片法测定。本实施例使用液相蛋白芯片法，通过将N端含有c-Myc标签的ELAVL3融合蛋白偶联到Luminex磁性微球上作为检测磁珠，以一系列已知浓度的Anti-Myc抗体为标准品，通过剂量-反应曲线，可检测待测样品，来评价抗体液态保存的储存剂对抗体溶液的保护效果，具体操作步骤如下：1)ELAVL3融合蛋白偶联至磁性微球
采用xMAP偶联试剂盒(Luminex Antibody Coupling Kit，货号40-50016),并按照其说明书操作将ELAVL3融合蛋白(购自Genscript)偶联至磁性微球。以储存缓冲液重悬并保存制备好的磁性微球芯片并计数。
2)9E10-IgG1样品的检测
取适量上述偶联有ELAVL3融合蛋白的磁性微球，用分析缓冲液稀释磁性微球，加入96孔板检测区域，每孔微球数量含2000个；分别将9E10-IgG1标准品用分析缓冲液稀释为:6.2、18.5、55.6、166.7、500、1500U/ml制作标准曲线，将待测样品C1、C2、C3、C4、C5按100μL/孔分别加入96孔板内。利用luminex 200系统，激光扫描荧光编码识别微球。读取微球荧光中位值，数据见表3所示。
C1:将本发明所述3μg/ml的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体加入上述用实施例2制得的溶液，混合均匀制备得到的产品在常温条件保存8个月的9E10-IgG1；
C2:A1800在4℃条件下保存8个月的9E10-IgG1；
C3:1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液常温保存8个月的9E10-IgG1；
C4:空白对照(不含9E10-IgG1的抗体储存剂缓冲液)；
C5:-80摄氏度保存的9E10-IgG1的抗体原液对照。
表3各组样品测得荧光值(MFI)比较
由上述表3的各组结果及图2可知，使用C2(A1800)组、以及C3(1％BSA)保存的对照组样品，各稀释梯度的荧光值均出现大幅下降，而使用本发明C1组样品测定的各稀释梯度荧光值与-80℃保存8个月的样品基本一致(差异＜10％)，表明使用本发明提供的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂，其保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的稳定性及保存效果显著优于1％BSA组、A1800组，本发明提供的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂，可在常温条件下稳定保存至少8个月。通过本发明的实施例3的实验数据，同时也表明了使用本发明提供的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体液态保存的储存剂，其保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的稳定性及保存效果也是显著优于1％BSA组、A1800组所述的稳定性，本发明提供的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体液态保存的储存剂，可在常温条件下稳定保存至少8个月。
实施例4：本发明的抗体溶液制剂中抗体稳定保存的浓度范围
使用本发明的抗体液体保存储存剂，配制终浓度为0.3μg/mL与300μg/mL的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体，分别命名为A和B，在室温(RT)下保存8个月后，测定其比活性，并与-80℃保存的A＇、B＇进行比较，结果如下表4所示。
表4不同浓度的抗体储存剂室温8个月与-80℃保存的效果比较
由上述表4及图3的结果可知，本发明的抗体液态保护剂，对高(300μg/mL)、低(0.3μg/mL)浓度的人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体，均可在室温稳定保存8个月。
Claims (4)
1.一种用于液态保存人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的储存剂在制备人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体溶液制剂中的应用，其特征在于，所述储存剂包含5％的驴血清、0.0075％的泊洛沙姆188和0.0025％的聚乙二醇400的混合物、3％的海藻糖、0.03％硫代硫酸钠、1mM的EDTA二钠、0.03％的Proclin300和10mM的磷酸盐。
2.一种含人抗c-Myc免疫球蛋白1的抗体溶液制剂，其特征在于，所述抗体溶液制剂包含人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体和如权利要求1所述的应用中所定义的储存剂；其中所述人抗c-Myc免疫球蛋白1抗体的浓度为0.3-300μg/mL。
3.根据权利要求2所述的抗体溶液制剂，其特征在于：
所述人抗c-Myc免疫球蛋白1的浓度为1-5μg/ml。
4.根据权利要求2或3所述抗体溶液制剂在制备体外检测人抗c-Myc免疫球蛋白1的试剂盒中的应用。
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