CN109997842B - 细胞保存液及其制备方法和其在流式和抗体测试中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法和其在流式和抗体测试中的应用。本发明提供了一种细胞保存液组合物，其包括Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl、封闭剂及防腐抗菌剂。本发明还提供了一种细胞保存液，其是由所述的细胞保存液组合物与水配制而成的，其pH7.0～7.4。本发明还提供了所述细胞保存液的制备方法，以及其在流式抗体测试中的应用。本发明的细胞保存液可用于实验中细胞样本的长期有效保存，尤其对于流式和抗体测试的细胞样本具有长期稳定的保存效果。

Description

细胞保存液及其制备方法和其在流式和抗体测试中的应用

技术领域

本发明是关于一种细胞保存液及其制备方法与应用，具体地说，是关于一种可以长期有效保存细胞特异性蛋白组分的细胞保存液，所述细胞保存液的制备方法，以及其在流式抗体测试中的应用，属于生物制剂技术领域。

背景技术

21世纪以来，生物医学逐渐发展，其在各大疾病治疗及科研领域发挥越来越重要的作用。生物医学是生物医学信息、医学影像技术、基因芯片、纳米技术、新材料等技术的学术研究和创新的基地，随着社会-心理-生物医学模式的提出、系统生物学的发展，形成了现代系统生物医学，其是与21世纪生物技术产业的形成和发展密切相关领域，是关系到提高医疗诊断水平和人类自身健康的重要工程领域。其中科研检测和临床诊断已逐渐上升至细胞与基因水平，细胞诊断及基因检测对细胞的要求也随之增高，具有固有细胞形态和结构的细胞标本对临床医学诊断等更有多方面的应用价值。众所周知，细胞一旦脱离原有的生存环境，细胞的形态结构及其表面特征将会发生改变，故只有通过正确的细胞保存方法才能确保不改变原有细胞的特征，也才能排除某些重要实验中细胞不稳定这一变量，大大提高细胞相关实验的稳定性和可重复性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种细胞保存液组合物，其所配制的细胞保存液，能较好地保存细胞形态结构的完整性。

本发明的另一目的是提供所述细胞保存液的制备方法。

本发明的另一目的是提供所述细胞保存液在流式和抗体测试中的应用。

一方面，本发明提供了一种细胞保存液组合物，其包括Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl、封闭剂及防腐抗菌剂。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液组合物中，所述封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液组合物中，所述防腐抗菌剂为ProClin300和NaN₃。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液组合物，其由Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl、BSA、ProClin300和NaN₃组成。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液组合物中，Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl的用量比例为：

Na₂HPO₄ 0.035～0.045mol

NaH₂PO₄ 0.028～0.032mol

NaCl 0.148～0.153mol

KCl 1.0～1.1mmol。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液组合物中，所述封闭剂及防腐抗菌剂的用量可以根据实际情况确定。

另一方面，本发明提供了一种细胞保存液，其是由本发明所述的细胞保存液组合物与水配制而成的。具体地，其pH7.0～7.4。

根据本发明的具体实施方案，本发明的细胞保存液，其中具有以下组分及含量：

Na₂HPO₄ 0.035～0.045mol/L；

NaH₂PO₄ 0.028～0.032mol/L；

NaCl 0.148～0.153mol/L；

KCl 1.0～1.1mmol/L。

根据本发明的具体实施方案，本发明的上述细胞保存液中，封闭剂(BSA)的含量优选为5％(m/v)。

优选地，防腐抗菌剂为ProClin300和NaN₃，ProClin300的含量为0.5‰(v/v)NaN₃的含量为1‰(m/v)。

本发明的细胞保存液，利用磷酸盐缓冲液内Na⁺、K⁺浓度以稳定细胞固定时细胞内外的渗透压，固定细胞的形态和大小；BSA是稳定剂，减少细胞表面蛋白变性；提高固定细胞的完整性和稳定性，同时保存液中的ProClin300和NaN₃作为防腐抗菌剂，能够有效防止细菌增生，提高细胞样本的保存期限，该细胞保存液可用于实验中细胞样本的长期有效保存，尤其对于流式和抗体测试的细胞样本，具有长期稳定的保存效果。

另一方面，本发明还提供了所述的细胞保存液的制备方法，其包括将Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·12H₂O、NaCl、KCl、封闭剂、防腐抗菌剂与水混合的步骤。

另一方面，本发明的细胞保存液的制备方法，还包括对混合后的液体进行过滤和/或分装的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的细胞保存液的制备方法包括：

依据用量取配方量的Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl和KCl加入到无菌蒸馏水中，待其溶解混匀后，称取配方量的BSA加入其中进行摇晃溶解，待溶解完全后加入配方量的ProClin300和NaN₃，待两者完全溶解后进行过滤除菌，将细胞保存液用0.22μm的滤器进行过滤除菌。

另一方面，本发明还提供了所述的细胞保存液组合物、或所述的细胞保存液在保存细胞中的应用。

根据本发明的具体实施方案，所保存的细胞是用于流式抗体测试实验；

根据本发明的具体实施方案，所述的细胞保存液是与含有细胞的样本液中的细胞沉淀混合，在2～8℃条件下保存。

另一方面，本发明还提供了以所述的细胞保存液保存细胞而得到的保存产物。

另一方面，本发明还提供了所述的保存产物在流式抗体测试实验中的应用，其中，所述流式抗体测试实验包括：

将所述保存产物等分，PBS混匀，离心(例如，离心条件可以为1000r/min离心5min)，清洗，之后分别与由DAPI核染料和抗EpCAM、抗CK、抗CD45抗体混合，混匀后孵育；

孵育的细胞抗体混合物，加入PBS，混匀后，离心，去上清并重悬；

流式细胞仪和/或荧光显微镜下抗体测试检测细胞悬液。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明的细胞保存液在流式、抗体测试中的应用方法，步骤如下：

1)将培养好的具有80％以上细胞融合度的样品细胞进行收集，将收集好的细胞用PBS缓冲液清洗一次，弃上清液，留取细胞沉淀，用细胞计数板进行绝对计数，通过计数结果，加入配方量的4％的多聚甲醛(PFA)进行细胞固定。

2)将固定好的细胞用PBS清洗3次，除去4％PFA，再用本发明的细胞保存液将固定好的细胞沉淀稀释至目的浓度，放入4℃条件下保存、备用即可。

3)依据使用的细胞量，直接吸取所需细胞保存液，离心去上清后，用适量的PBS清洗2次后，直接进行DAPI核染色和抗CK、抗CD45等单克隆抗体染色即可，无须进行细胞固定及封闭步骤。有效节约固定及封闭细胞的时间，提高实验效率；更为重要的是，细胞可在该保存液中稳定长期保存，绝大部分成分含量稳定，有效解决细胞实验中培养细胞状态存在批内及批间明显差异的问题。

本发明的有益效果：

本发明的技术方案，通过磷酸盐缓冲液中的Na⁺、K⁺，将固定后的样品细胞置于本发明的细胞保存液中，使细胞内外保持稳定的渗透性压，不会因渗透压使细胞吸水或脱水，导致细胞形态发生改变，保持细胞的正常形态，进一步提高细胞检测结果的可靠性。保存液中的BSA是稳定剂，减少细胞表面蛋白变性；提高固定细胞的完整性和稳定性。保存液中的防腐抗菌剂ProClin300和NaN₃可有效地抑制菌种生长，延长样品细胞的保存期限，在4℃环境中可以保存6个月，开瓶30天内亦可保持细胞的完整有效性。细胞保存液的配方更为合理，组分更为清晰明了，操作简便，应用范围广。

附图说明

图1为在常用细胞保护液中保存的SK-BR-3细胞状态图及采用本发明实施例1中保存液保存6个月前后的细胞状态对比图。

图2A～图2C为流式细胞仪检测采用本发明实施例1中保存液保存的细胞：细胞保存第一天与6个月最后一天的细胞表面蛋白表达量对比图。

图3为在常用细胞保护液保存的HL-60细胞状态图及采用本发明实施例2中保存液保存6个月前后的细胞状态对比图。

图4A～图4C为流式细胞仪检测采用本发明实施例2中保存液保存的细胞：细胞保存第一天与6个月最后一天的细胞表面蛋白表达量对比图。

具体实施方案

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的常规操作或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例的细胞保存液的各组分及含量如下：

Na₂HPO₄ 0.04mol/L

NaH₂PO₄ 0.03mol/L

NaCl 0.15mol/L

KCl 1.07mmol/L

BSA 5％(m/v)

ProClin300 0.5‰(v/v)

NaN₃ 1‰(m/v)

依据用量取上述配方量的Na₂HPO₄(根据实际情况可以是水合物)、NaH₂PO₄(根据实际情况可以是水合物)、NaCl和KCl加入到无菌蒸馏水中，待其溶解混匀后，称取配方量的BSA加入其中进行摇晃溶解，待溶解完全后加入配方量的ProClin300和NaN₃，待两者完全溶解后用0.22μm的滤器进行过滤除菌，得到本实施例的细胞保存液，测量其pH 7.2。

对比用细胞保存液组分及含量如下：

Na₂HPO₄ 0.010mol/L

KH₂PO₄ 0.002mol/L

NaCl 0.137mol/L

KCl 2.7mmol/L

BSA 5％(m/v)

NaN₃ 1‰(m/v)

pH 7.2。

选用同一批次的乳腺癌细胞SK-BR-3，将其用4％PFA固定后平均分为两份，一份放置于本发明的细胞保存液内，另一份放置于对比用细胞保存液内，调整细胞浓度均为1×10⁶/ml，按照细胞保存液不同，每6ml细胞悬液放置于1个15ml离心管内。每种细胞保存液共制作8管，1管用于细胞计数，其余7管，每个月同一日期取1管进行单克隆抗体(抗EpCAM、抗CK、抗CD45)染色后的流式细胞仪检测。

图1显示在常用细胞保护液中保存的SK-BR-3细胞状态及采用本实施例的保存液保存6个月前后的细胞状态对比。左：保存前SK-BR-3单细胞状态。中：本发明保存液中保存6个月时SK-BR-3细胞状态。右：常用保存液中保存6个月时SK-BR-3细胞状态。

图2A～图2C显示流式细胞仪检测采用本实施例的保存液保存的细胞，在细胞保存第一天与6个月最后一天的细胞表面蛋白表达量对比。其中，图2A，EpCAM表达量对比：保存第一天(左)和保存6个月最后一天(右)。图2B，CD45表达量对比：保存第一天(左)和保存6个月最后一天(右)。图2C，CK表达量对比：保存第一天(左)和保存6个月最后一天(右)。

经过为期六个月的跟踪检测，实验证明SK-BR-3在普通细胞保护液中较在本发明的细胞保存液中保存的完整性差；且EpCAM、CK、CD45的特异性抗原表达量降低，而在本发明的细胞保存液中的细胞完整性良好，EpCAM、CK、CD45的特异性抗原表达量基本没有改变。

实施例2

选用同一批次的人早幼急性粒细胞白血病细胞系HL-60，将其用4％PFA固定后平均分为两份，一份放置于本发明的细胞保存液(同实施例1记载的本发明的细胞保存液)内，另一份放置于对比用细胞保存液(同实施例1记载的对比用细胞保存液)内，调整细胞浓度均为1×10⁶/ml，按照细胞保存液不同，每6ml细胞悬液放置于1个15ml离心管内。每种细胞保存液共制作8管，1管用于细胞计数，其余7管，每个月同一日期取1管进行单克隆抗体(抗EpCAM、抗CK、抗CD45)染色后的流式细胞仪检测。

图3显示在常用细胞保护液保存的HL-60细胞状态及采用本实施例的保存液保存6个月前后的细胞状态对比。

图4A～图4C显示流式细胞仪检测采用本实施例的保存液保存的细胞，在保存第一天与6个月最后一天的细胞表面蛋白表达量对比。其中，图4A，EpCAM；图4B，CD45；图4C，CK。

经过为期六个月的跟踪检测，实验证明HL-60在普通细胞保护液中较在本发明的细胞保存液中保存的完整性差；且EpCAM、CK、CD45的特异性抗原表达量降低，而本发明的细胞保存液中保存的完整性良好，EpCAM、CK、CD45的特异性抗原基本没有改变。

Claims (8)

1.一种细胞保存液组合物，其由Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl、封闭剂及防腐抗菌剂组成；

所述封闭剂为牛血清白蛋白BSA；

所述防腐抗菌剂为ProClin300和NaN₃；

其中，Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl的用量比例为：

Na₂HPO₄ 0.035~0.045 mol

NaH₂PO₄ 0.028~0.032 mol

NaCl 0.148~0.153 mol

KCl 1.0~1.1 mmol。

2.一种细胞保存液，其是由权利要求1所述的组合物与水配制而成的，其pH值为7.0~7.4。

3.根据权利要求2所述的细胞保存液，其中具有以下组分及含量：

Na₂HPO₄ 0.035~0.045 mol/L；

NaH₂PO₄ 0.028~0.032 mol/L；

NaCl 0.148~0.153 mol/L；

KCl 1.0~1.1 mmol/L；

封闭剂的含量m/v为5%；

ProClin300的含量v/v为0.5‰，NaN₃的含量m/v为1‰。

4.权利要求2或3所述的细胞保存液的制备方法，其包括将Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、KCl、封闭剂、防腐抗菌剂与水混合的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，所述制备方法还包括对混合后的液体进行过滤和/或分装的步骤。

6.权利要求1所述的细胞保存液组合物或权利要求2或3所述的细胞保存液在保存细胞中的应用；

其中，所述细胞为肿瘤细胞；

所保存的细胞是用于流式抗体测试实验；

所述的细胞保存液是与含有细胞的样本液中的细胞沉淀混合，在2~8℃条件下保存。

7.以权利要求2或3所述的细胞保存液保存细胞而得到的保存产物。

8.权利要求7所述的保存产物在流式抗体测试实验中的应用，其中，所述流式抗体测试实验包括：

将所述保存产物等分，PBS混匀，离心，清洗，之后分别与由DAPI核染料和抗EpCAM、抗CK、抗CD45抗体混合，混匀后孵育；

孵育的细胞抗体混合物，加入PBS，混匀后，离心，去上清并重悬；

流式细胞仪和/或荧光显微镜下抗体测试检测细胞悬液。

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