JPH11352125A - 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 - Google Patents
赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法Info
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- JPH11352125A JPH11352125A JP11127385A JP12738599A JPH11352125A JP H11352125 A JPH11352125 A JP H11352125A JP 11127385 A JP11127385 A JP 11127385A JP 12738599 A JP12738599 A JP 12738599A JP H11352125 A JPH11352125 A JP H11352125A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 白血球の細胞数測定のために使用されること
ができる溶解試薬の提供。 【解決手段】 本願発明に係る溶解試薬は、４〜９のpH
において使用される窒素含有複素環化合物である。
ができる溶解試薬の提供。 【解決手段】 本願発明に係る溶解試薬は、４〜９のpH
において使用される窒素含有複素環化合物である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血球にとって非
毒性であり、かつ、脂肪族アルデヒド型の固定剤の使用
に適合する試薬に関する。
毒性であり、かつ、脂肪族アルデヒド型の固定剤の使用
に適合する試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】正常な血液中には、赤血球は、白血球よ
りも約１，０００倍多くあり、そして白血球の試験又は
分析の障害となる。それ故、サイトメトリーの如き白血
球分析、又は血液構成成分の遠心分離に関すサイトスピ
ン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）の方法は、ほとんどの場合、白
血球から赤血球を分離するための工程に先行される（Ｕ
Ｓ−Ａ−４ ２８４ ４１２，ＥＰ−Ａ−０ ０２２
６７０）。血液からリンパ球及び顆粒状を単離するため
のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用した遠心分離によ
る１の上記のような分離は、Scandinavian Journal of
Clinical and Laboratory Investigation 1967-68, Sup
pl. 94-101. 305. 293中にBoyem により、そしてJourna
l of Immunological Methods: 1980, 33: 221-229中Per
toff により記載されている。
りも約１，０００倍多くあり、そして白血球の試験又は
分析の障害となる。それ故、サイトメトリーの如き白血
球分析、又は血液構成成分の遠心分離に関すサイトスピ
ン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）の方法は、ほとんどの場合、白
血球から赤血球を分離するための工程に先行される（Ｕ
Ｓ−Ａ−４ ２８４ ４１２，ＥＰ−Ａ−０ ０２２
６７０）。血液からリンパ球及び顆粒状を単離するため
のフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用した遠心分離によ
る１の上記のような分離は、Scandinavian Journal of
Clinical and Laboratory Investigation 1967-68, Sup
pl. 94-101. 305. 293中にBoyem により、そしてJourna
l of Immunological Methods: 1980, 33: 221-229中Per
toff により記載されている。
【０００３】これらの方法は、細胞の損失を、そしてそ
れ故、不履行のアッセイを導くことができる、いくつか
の洗浄及び遠心分離をそれらが必要とするために、使用
することが比較的困難である。しかしながら、上記方法
は、最近、参照方法であると考えられている。なぜな
ら、白血球の形態学及び生存能力が、分離後に保存され
ているからである。
れ故、不履行のアッセイを導くことができる、いくつか
の洗浄及び遠心分離をそれらが必要とするために、使用
することが比較的困難である。しかしながら、上記方法
は、最近、参照方法であると考えられている。なぜな
ら、白血球の形態学及び生存能力が、分離後に保存され
ているからである。
【０００４】白血球分析に関する血液の溶解は、死骸の
状態への赤血球の（ｒｅｄ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）の
破壊を含む。一方において、この溶解方法は、細胞数測
定の白血球分析を許容し、そして赤血球の死骸から白血
球を明確に区別するために、白血球の形態の最適な保存
を目的とする。赤血球の溶解は、赤血球の外側からの膜
を通しての一定量の材料の通過という一般原理に基づ
く。この通過の間、その膜の状態は、細胞の膨潤に因
り、又は通過材料中の膜の溶解に因り、悪化する。
状態への赤血球の（ｒｅｄ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）の
破壊を含む。一方において、この溶解方法は、細胞数測
定の白血球分析を許容し、そして赤血球の死骸から白血
球を明確に区別するために、白血球の形態の最適な保存
を目的とする。赤血球の溶解は、赤血球の外側からの膜
を通しての一定量の材料の通過という一般原理に基づ
く。この通過の間、その膜の状態は、細胞の膨潤に因
り、又は通過材料中の膜の溶解に因り、悪化する。
【０００５】溶解の間の、白血球の形態の保存は、その
膜の付近のよりタンパク質に富む環境：外側及び内側
の、トランスメンブラン・タンパク質、及び内側の、発
達した細胞骨格に基づく。この白血球膜の支持の利点
は、固定化剤、例えば、その膜に浸透し、そして外側と
内側を架橋することによりそのタンパク質構造を固定す
るホルムアルデヒドの使用により、最大限利用される。
赤血球の膜を通過するために使用される材料は、一般に
は、小さな中性分子、第１に低張性溶解において使用さ
れる水自体、又はChang et al.（米国特許第４９０２
６１３号）中に記載されたようなジエチレン・グリコー
ル、ホルムアルデヒド及びクエン酸の存在下の水であ
る。ときどき、固定及び低張溶解が、Quintana(WO-89/0
509)及びVan Agthoven (EP-A-0625706）により記載され
たように、異なる段階において行われる。
膜の付近のよりタンパク質に富む環境：外側及び内側
の、トランスメンブラン・タンパク質、及び内側の、発
達した細胞骨格に基づく。この白血球膜の支持の利点
は、固定化剤、例えば、その膜に浸透し、そして外側と
内側を架橋することによりそのタンパク質構造を固定す
るホルムアルデヒドの使用により、最大限利用される。
赤血球の膜を通過するために使用される材料は、一般に
は、小さな中性分子、第１に低張性溶解において使用さ
れる水自体、又はChang et al.（米国特許第４９０２
６１３号）中に記載されたようなジエチレン・グリコー
ル、ホルムアルデヒド及びクエン酸の存在下の水であ
る。ときどき、固定及び低張溶解が、Quintana(WO-89/0
509)及びVan Agthoven (EP-A-0625706）により記載され
たように、異なる段階において行われる。
【０００６】ＥＰ−Ａ−６２５ ７０７中に記載された
ような等張溶解の場合には、通過される材料は、ホルム
アルデヒド、グリセロール、ブタノール、及びクエン酸
の混合物から成る。等張溶解の他の方法は、サポニン、
ＷＯ８５／０５６４０中に記載されたような洗剤特性を
もつ小さな分子を使用する。溶解の一般原理が直ちには
明らかでないような溶解の方法が存在する。これは、塩
化アンモニウムを用いた溶解である。この溶解操作は、
上記膜を通してのＮＨ3 とＣＯ3 の通過に依存する。Ｎ
Ｈ3 とＣＯ2 は、上記混合物中ＮＨ4 + とＨＣＯ3 - と
平衡状態にある。細胞内でのＮＨ3 からＮＨ4 + への、
そして赤血球内に多量に存在する炭酸アンヒドラーゼに
よるＣＯ2 からＨＣＯ3 - への自発的再変換は、細胞に
侵入するＮＨ3 とＣＯ2 の連続流の後の力であることが
できるであろう。
ような等張溶解の場合には、通過される材料は、ホルム
アルデヒド、グリセロール、ブタノール、及びクエン酸
の混合物から成る。等張溶解の他の方法は、サポニン、
ＷＯ８５／０５６４０中に記載されたような洗剤特性を
もつ小さな分子を使用する。溶解の一般原理が直ちには
明らかでないような溶解の方法が存在する。これは、塩
化アンモニウムを用いた溶解である。この溶解操作は、
上記膜を通してのＮＨ3 とＣＯ3 の通過に依存する。Ｎ
Ｈ3 とＣＯ2 は、上記混合物中ＮＨ4 + とＨＣＯ3 - と
平衡状態にある。細胞内でのＮＨ3 からＮＨ4 + への、
そして赤血球内に多量に存在する炭酸アンヒドラーゼに
よるＣＯ2 からＨＣＯ3 - への自発的再変換は、細胞に
侵入するＮＨ3 とＣＯ2 の連続流の後の力であることが
できるであろう。
【０００７】塩化アンモニウムによる溶解は、固定化剤
の非存在下で行われることができる最も有効な溶解であ
り、そしてそれ故、多くの研究実験室の好ましい方法で
ある。この方法の制限は、その溶解プロセスの間に白血
球がそれらの生存能力をひじょうに速く失うということ
である。明らかに、細胞の内部は、上記２反応の生成物
により、最初にアルカリ性にされる；ＮＨ5 ＣＯ3 ）。
その後、溶解及び赤血球からの炭酸アンヒドラーゼの放
出後の反応において、その溶解バッファー中に存在する
重炭酸塩からの反応ＨＣＯ3 →ＣＯ2 ＋ＯＨ- は、その
混合物全体をアルカリ性にし、これは、白血球の分解を
引き起こす。これらの毒性状態により、ひじょうに速
く、通常、調製を行ってから１〜２時間後に、読みを記
録しなければならない。
の非存在下で行われることができる最も有効な溶解であ
り、そしてそれ故、多くの研究実験室の好ましい方法で
ある。この方法の制限は、その溶解プロセスの間に白血
球がそれらの生存能力をひじょうに速く失うということ
である。明らかに、細胞の内部は、上記２反応の生成物
により、最初にアルカリ性にされる；ＮＨ5 ＣＯ3 ）。
その後、溶解及び赤血球からの炭酸アンヒドラーゼの放
出後の反応において、その溶解バッファー中に存在する
重炭酸塩からの反応ＨＣＯ3 →ＣＯ2 ＋ＯＨ- は、その
混合物全体をアルカリ性にし、これは、白血球の分解を
引き起こす。これらの毒性状態により、ひじょうに速
く、通常、調製を行ってから１〜２時間後に、読みを記
録しなければならない。
【０００８】この方法の他の制限は、以下の反応： ６ＨＣＨＯ＋４ＮＨ3 →Ｃ6 Ｈ12Ｎ4 ＋６Ｈ2 Ｏ に因り、塩化アンモニウムの使用とホルムアルデヒドの
使用を組み合せることができないという事実である。形
成されたヘキサメチレン・テトラミンは安定であり、そ
してそれ故、その混合物は、その反応の間、白血球に有
害な程に酸性となる。なぜなら、培地中のＮＨ3 の除去
はその平衡をシフトさせ、そしてそのＨ+ イオンがもは
や補償されないからである。要するに、塩化アンモニウ
ムは、脂肪族アルデヒドに不適合であることが証明され
ており、そしてそれ故、両者が共に使用されるとき、溶
解は速やかに停止する。
使用を組み合せることができないという事実である。形
成されたヘキサメチレン・テトラミンは安定であり、そ
してそれ故、その混合物は、その反応の間、白血球に有
害な程に酸性となる。なぜなら、培地中のＮＨ3 の除去
はその平衡をシフトさせ、そしてそのＨ+ イオンがもは
や補償されないからである。要するに、塩化アンモニウ
ムは、脂肪族アルデヒドに不適合であることが証明され
ており、そしてそれ故、両者が共に使用されるとき、溶
解は速やかに停止する。
【０００９】それ故、できるだけ白血球の細胞生存能力
を保持する、赤血球のための溶解試薬及び溶解方法をも
つことが望ましいであろう。上記調製を実施してから長
い時間後に、例えば、上記生成物の反応から１日以上た
った後に、細胞数測定の読みが行われることを可能にす
る、赤血球の溶解試薬及び溶解方法をもつことも望まし
いであろう。ホルムアルデヒドの使用も適用性である赤
血球の溶解試薬と溶解方法も望ましいであろう。長い間
の研究の後、本出願人は、上記問題を溶解剤として窒素
含有複素環化合物を使用することにより解決した。
を保持する、赤血球のための溶解試薬及び溶解方法をも
つことが望ましいであろう。上記調製を実施してから長
い時間後に、例えば、上記生成物の反応から１日以上た
った後に、細胞数測定の読みが行われることを可能にす
る、赤血球の溶解試薬及び溶解方法をもつことも望まし
いであろう。ホルムアルデヒドの使用も適用性である赤
血球の溶解試薬と溶解方法も望ましいであろう。長い間
の研究の後、本出願人は、上記問題を溶解剤として窒素
含有複素環化合物を使用することにより解決した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記の理由により、本願
は、白血球の細胞測定分析のために使用されることがで
きる溶解試薬であって、この溶解剤が、４〜９のpH、好
ましくは５〜８のpH、特に６〜７．５のpH、より特に
６．８〜７．２のpHにおいて使用される窒素含有複素環
化合物であることを特徴とする。用語“溶解剤”は、前
記窒素含有複素環化合物が、使用される基本的な溶解剤
であるということを意味する。本願出願人は、実際、溶
解剤としての窒素含有複素環化合物の使用が、白血球を
保護するためにホルムアルデヒドの使用と適合しなが
ら、ＮＨ4 Ｃｌを適用する結果を与えるということが発
見された。上記脂肪族アルデヒドは上記窒素含有複素環
化合物と反応するが、上記溶解培地中での反応が完全で
はなく、そして上記生成物は一般に、安定な反応生成物
を形成せずに平衡状態において残存するようであろう。
は、白血球の細胞測定分析のために使用されることがで
きる溶解試薬であって、この溶解剤が、４〜９のpH、好
ましくは５〜８のpH、特に６〜７．５のpH、より特に
６．８〜７．２のpHにおいて使用される窒素含有複素環
化合物であることを特徴とする。用語“溶解剤”は、前
記窒素含有複素環化合物が、使用される基本的な溶解剤
であるということを意味する。本願出願人は、実際、溶
解剤としての窒素含有複素環化合物の使用が、白血球を
保護するためにホルムアルデヒドの使用と適合しなが
ら、ＮＨ4 Ｃｌを適用する結果を与えるということが発
見された。上記脂肪族アルデヒドは上記窒素含有複素環
化合物と反応するが、上記溶解培地中での反応が完全で
はなく、そして上記生成物は一般に、安定な反応生成物
を形成せずに平衡状態において残存するようであろう。
【００１１】上記窒素含有複素環化合物は、例えば、２
環、そして好ましくは単環であることができる。それは
不飽和であることができ、その場合、それは、例えば
５、そして好ましくは４、顕著には３、特に２の２重結
合を含み、そしてそれは、好ましくは飽和である。それ
は、例えば、３〜８、顕著には３〜６、そして特に３〜
５、そしてより特に４又は５の炭素原子を含む。それ
は、２の、顕著には、１の単一の窒素原子をもつ。飽和
の窒素含有複素環化合物の例は、ピラゾリジン、イミダ
ゾリジン及びイミダゾリン、ピペラジン、顕著にはモル
フォリン、及び特にピペリジン又はピロリジンを含む。
環、そして好ましくは単環であることができる。それは
不飽和であることができ、その場合、それは、例えば
５、そして好ましくは４、顕著には３、特に２の２重結
合を含み、そしてそれは、好ましくは飽和である。それ
は、例えば、３〜８、顕著には３〜６、そして特に３〜
５、そしてより特に４又は５の炭素原子を含む。それ
は、２の、顕著には、１の単一の窒素原子をもつ。飽和
の窒素含有複素環化合物の例は、ピラゾリジン、イミダ
ゾリジン及びイミダゾリン、ピペラジン、顕著にはモル
フォリン、及び特にピペリジン又はピロリジンを含む。
【００１２】本発明に係る溶解試薬においては、上記窒
素含有複素環化合物は、０．０１〜０．２Ｍ、特に０．
０５〜０．１９Ｍ、そしてより特に０．１〜０．１８Ｍ
のモル濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の
使用の全体として優先的な条件下では、０．１５Ｍの濃
度が使用される。上記濃度は、赤血球溶解の間の、関係
する化合物の量に関して与えられる。本発明の使用の他
の優先的な条件下では、上記の溶解試薬について所望の
pHを付与するために本発明に従って使用される化合物
は、アニオンとして、例えば、ＨＣｌの形態で塩素を使
用する。
素含有複素環化合物は、０．０１〜０．２Ｍ、特に０．
０５〜０．１９Ｍ、そしてより特に０．１〜０．１８Ｍ
のモル濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の
使用の全体として優先的な条件下では、０．１５Ｍの濃
度が使用される。上記濃度は、赤血球溶解の間の、関係
する化合物の量に関して与えられる。本発明の使用の他
の優先的な条件下では、上記の溶解試薬について所望の
pHを付与するために本発明に従って使用される化合物
は、アニオンとして、例えば、ＨＣｌの形態で塩素を使
用する。
【００１３】さらに他の優先的な使用条件下、本発明の
溶解試薬は、上記溶解試薬について所望のpHを与えるた
めに本発明に従って使用されるアニオンとは別に、炭酸
イオン、炭酸水素イオン又はカーバメートであるが好ま
しくはホウ素イオンである対イオンをも含む。実際、ホ
ウ酸イオンは重炭酸イオンのように分解を受けず、そし
てそれ故、細胞の良好な安定性に寄与し、溶解が行われ
てからはるか後に、細胞数測定の読みを許容するという
ことが、発見されている。その上、その使用は、安定性
の溶解溶液の調製を許容し、これは、炭酸水素塩の場合
にはそうではない。
溶解試薬は、上記溶解試薬について所望のpHを与えるた
めに本発明に従って使用されるアニオンとは別に、炭酸
イオン、炭酸水素イオン又はカーバメートであるが好ま
しくはホウ素イオンである対イオンをも含む。実際、ホ
ウ酸イオンは重炭酸イオンのように分解を受けず、そし
てそれ故、細胞の良好な安定性に寄与し、溶解が行われ
てからはるか後に、細胞数測定の読みを許容するという
ことが、発見されている。その上、その使用は、安定性
の溶解溶液の調製を許容し、これは、炭酸水素塩の場合
にはそうではない。
【００１４】本発明に係る溶解試薬においては、上記対
イオンは、０．００１〜０．２Ｍ、特に０．００５〜
０．１Ｍ、そしてより特に０．０１〜０．０５Ｍのモル
濃度で存在することができる。本発明に従えば、上記ホ
ウ酸塩は、上記炭酸塩よりも高い濃度で使用される。例
えば、０．０４Ｍのホウ酸塩の濃度が、０．０１Ｍの炭
酸塩又は炭酸水素塩の濃度の代わりに使用される。本発
明の使用の他の優先的な条件下、本発明の溶解試薬は、
特にpH６．５〜７．５の有効量の緩衝剤をも含む。緩衝
剤の例は、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタン・
スルホン酸）、顕著にはＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォ
リノ）プロペン・スルホン酸）、そして特にＨＥＰＥＳ
（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−
（２−エタン・スルホン酸）を含む。
イオンは、０．００１〜０．２Ｍ、特に０．００５〜
０．１Ｍ、そしてより特に０．０１〜０．０５Ｍのモル
濃度で存在することができる。本発明に従えば、上記ホ
ウ酸塩は、上記炭酸塩よりも高い濃度で使用される。例
えば、０．０４Ｍのホウ酸塩の濃度が、０．０１Ｍの炭
酸塩又は炭酸水素塩の濃度の代わりに使用される。本発
明の使用の他の優先的な条件下、本発明の溶解試薬は、
特にpH６．５〜７．５の有効量の緩衝剤をも含む。緩衝
剤の例は、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタン・
スルホン酸）、顕著にはＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォ
リノ）プロペン・スルホン酸）、そして特にＨＥＰＥＳ
（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−
（２−エタン・スルホン酸）を含む。
【００１５】本発明に係る溶解試薬においては、上記緩
衝剤は、０．０００１〜０．０５Ｍ、特に０．０００５
〜０．０３Ｍ、そしてより特に０．００２〜０．００８
Ｍのモル濃度で存在することができる。本発明のさらに
他の優先的な条件下では、本発明の溶解試薬は、有効量
の抗凝血剤をも含む。抗凝血剤の例は、ヘパリン、顕著
には、クエン酸イオン、そして特にＥＤＴＡを含む。本
発明の使用の全体として優先的な条件下では、０．１５
Ｍの塩化ピロリドン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００
１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混合
物が、７．０付近のpHで使用される。
衝剤は、０．０００１〜０．０５Ｍ、特に０．０００５
〜０．０３Ｍ、そしてより特に０．００２〜０．００８
Ｍのモル濃度で存在することができる。本発明のさらに
他の優先的な条件下では、本発明の溶解試薬は、有効量
の抗凝血剤をも含む。抗凝血剤の例は、ヘパリン、顕著
には、クエン酸イオン、そして特にＥＤＴＡを含む。本
発明の使用の全体として優先的な条件下では、０．１５
Ｍの塩化ピロリドン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００
１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混合
物が、７．０付近のpHで使用される。
【００１６】上記溶解試薬の使用のさらに他の優先的な
条件下では、さらに固定化剤、顕著には、脂肪族アルデ
ヒド、例えば、Ｃ1 〜Ｃ5 を含むもの、例えば、パラホ
ルムアルデヒド、そして特にホルムアルデヒドが使用さ
れる。上記脂肪族アルデヒドは、０．０１％〜５％、特
に０．１４％〜１％、そしてより特に０．１％〜０．５
％の濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の使
用の優先的な条件下では、固定剤と共に、０．１５Ｍの
塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１Ｍ
のＥＤＴＡ、０．００５ＭのＨＥＰＥＳ、及び０．３％
のホルムアルデヒドが使用される。本発明は、抗凝血
剤、例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで
処理された全血のサンプルが上記の溶解試薬の作用を受
けるような、赤血球の溶解方法をも提供する。
条件下では、さらに固定化剤、顕著には、脂肪族アルデ
ヒド、例えば、Ｃ1 〜Ｃ5 を含むもの、例えば、パラホ
ルムアルデヒド、そして特にホルムアルデヒドが使用さ
れる。上記脂肪族アルデヒドは、０．０１％〜５％、特
に０．１４％〜１％、そしてより特に０．１％〜０．５
％の濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の使
用の優先的な条件下では、固定剤と共に、０．１５Ｍの
塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１Ｍ
のＥＤＴＡ、０．００５ＭのＨＥＰＥＳ、及び０．３％
のホルムアルデヒドが使用される。本発明は、抗凝血
剤、例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで
処理された全血のサンプルが上記の溶解試薬の作用を受
けるような、赤血球の溶解方法をも提供する。
【００１７】白血球細胞を標識付けするためにモノクロ
ーナル抗体の非存在下又は存在下で操作することができ
る。これらの抗体は、蛍光性化合物、例えば下記のよう
なものに結合されても、されなくてもよい。好ましい使
用条件下では、これらの抗体は、蛍光性化合物に結合さ
れる。
ーナル抗体の非存在下又は存在下で操作することができ
る。これらの抗体は、蛍光性化合物、例えば下記のよう
なものに結合されても、されなくてもよい。好ましい使
用条件下では、これらの抗体は、蛍光性化合物に結合さ
れる。
【００１８】上記溶解試薬は、以下のように使用される
ことができる：抗凝血剤で処理され、そして前もって、
モノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合され
たモノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合さ
れたモノクローナル抗体混合物と共にインキュベートさ
れた、０．１mlの血液のサンプルを、３７℃の温度まで
事前に加熱された上述の溶解試薬２mlと接触させ、そし
て１０分間にわたり放置して冷却し、その間に溶解を完
結させる。このようなマーカーは、例えば、ＣＤ４５−
ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソシアネートと組み合さ
れたＣＤ４５）又はフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒ
ｙｔｈｒｉｎ）と組み合されたＣＤ１４であり、そして
例えば、DAKO, BECTON and DICKINSON又はIMMUNOTECHの
ような企業により購売されている。次に、溶解直後又は
３日後までに、例えば、BECTON and DICKINSON Facscan
タイプの、サイトメーター内で読みを実行する。
ことができる：抗凝血剤で処理され、そして前もって、
モノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合され
たモノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合さ
れたモノクローナル抗体混合物と共にインキュベートさ
れた、０．１mlの血液のサンプルを、３７℃の温度まで
事前に加熱された上述の溶解試薬２mlと接触させ、そし
て１０分間にわたり放置して冷却し、その間に溶解を完
結させる。このようなマーカーは、例えば、ＣＤ４５−
ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソシアネートと組み合さ
れたＣＤ４５）又はフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒ
ｙｔｈｒｉｎ）と組み合されたＣＤ１４であり、そして
例えば、DAKO, BECTON and DICKINSON又はIMMUNOTECHの
ような企業により購売されている。次に、溶解直後又は
３日後までに、例えば、BECTON and DICKINSON Facscan
タイプの、サイトメーター内で読みを実行する。
【００１９】本発明に従う使用の優先的な条件下では、
上記の優先的な条件が、溶解試薬及び溶解方法のために
選ばれる。図１〜図１３は、溶解直後（０時間）、及び
２４時間、４８時間、及び７２時間後における：大きな
角度と小さな角度における拡散を比較することによるBE
CTON and DICKINSONからのFacscan を使用したサイトメ
トリーにより得られた結果を表す。
上記の優先的な条件が、溶解試薬及び溶解方法のために
選ばれる。図１〜図１３は、溶解直後（０時間）、及び
２４時間、４８時間、及び７２時間後における：大きな
角度と小さな角度における拡散を比較することによるBE
CTON and DICKINSONからのFacscan を使用したサイトメ
トリーにより得られた結果を表す。
【００２０】以下の例は本発明を説明する。 参照調製物 ＮＨ4 Ｃｌ（Ortho Diagnostics 参照）に基づく溶解試
薬を使用した。 実施例１：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ 実施例２：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ ０．１Ｍ ホルムアルデヒド pH７．０
薬を使用した。 実施例１：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ 実施例２：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ ０．１Ｍ ホルムアルデヒド pH７．０
【００２１】実施例３：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ pH：７．０ 実施例４：溶解試薬の調製 以下の配合に一致する溶解試薬を調製した： ０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ ０．０４Ｍ ホウ酸 ０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ ０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ ０．１Ｍ ホルムアルデヒド
【００２２】薬理学的研究実験１：赤血球の溶解の証明 ＥＤＴＡを含む血液から出発して、サンプリングから２
時間後、１００μｌのサンプルを、参照ＩＭ１２０１の
下、IMMUNOTECHにより購売された、２０μｌの単球マー
カー（ＣＤ１４−フィコエリスリン）及び白血球マーカ
ー（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）の存在下、１５分間インキュ
ベートした。次にこれらのサンプルを、異なる温度で、
異なる溶解調製物、顕著には上記のものと混合し、周囲
温度で１０分間、溶解に供し、次にこれらのサンプルの
一部を、遠心分離（５分間、３００ｇ）後にホスフェー
ト・バッファー（ＰＢＳ）中に溶解させた。これらのサ
ンプルを４℃で保存する。
時間後、１００μｌのサンプルを、参照ＩＭ１２０１の
下、IMMUNOTECHにより購売された、２０μｌの単球マー
カー（ＣＤ１４−フィコエリスリン）及び白血球マーカ
ー（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）の存在下、１５分間インキュ
ベートした。次にこれらのサンプルを、異なる温度で、
異なる溶解調製物、顕著には上記のものと混合し、周囲
温度で１０分間、溶解に供し、次にこれらのサンプルの
一部を、遠心分離（５分間、３００ｇ）後にホスフェー
ト・バッファー（ＰＢＳ）中に溶解させた。これらのサ
ンプルを４℃で保存する。
【００２３】上記サンプルを、直後に又は３mlのホスフ
ェート・バッファーで洗浄した後にＦＡＣＳＣＡＮサイ
トメーター（BECTON & DICKINSON）上に分析し、そして
その後、保存の間、２４時間の間隔で分析した。図１〜
１３は、Ｓｉｍｕｌｓｅｔプログラム（BECTON & DICKI
NSON）を使用して分析された溶解された血液調製物の散
乱図（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍｓ）を示す。白血球配合
物中のリンパ球、単球、及び顆粒球のパーセンテージを
大きな角度と小さな角度及びＣＤ４５／ＣＤ１４蛍光に
おける拡散ダイアグラムに基づいて推定した。
ェート・バッファーで洗浄した後にＦＡＣＳＣＡＮサイ
トメーター（BECTON & DICKINSON）上に分析し、そして
その後、保存の間、２４時間の間隔で分析した。図１〜
１３は、Ｓｉｍｕｌｓｅｔプログラム（BECTON & DICKI
NSON）を使用して分析された溶解された血液調製物の散
乱図（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍｓ）を示す。白血球配合
物中のリンパ球、単球、及び顆粒球のパーセンテージを
大きな角度と小さな角度及びＣＤ４５／ＣＤ１４蛍光に
おける拡散ダイアグラムに基づいて推定した。
【００２４】対照として、ＣＤ４５−フィコエリスリン
で標識された血液（溶解を伴わずにＰＢＳ中で５００倍
に希釈された、０．０２mlのＣＤ４５−フィコエリスリ
ン当り０．１mlの血液）を、（４００ボルトに対応す
る）蛍光チャンネルＦＬ２内の閾値を適用することによ
り、サイトメトリーによりアッセイした。実施例１、実
施例２、及び塩化アンモニウムの溶解試薬の遂行と、溶
解を伴わない対照とを比較することにより（図１，２，
３、及び４）、よく保存された単球とリンパ球の形態学
が、そして特にＮＨ4 Ｃｌの場合、右側への、多核細胞
の位置の僅かな修飾が、見られる。保存の間、時間の関
数としての右側への多核細胞におけるシフトも観察さ
れ、これは、このシフトが多核細胞の部分的破壊に関係
しているということを示している。上記サンプルの保存
の間、死骸の領域におけるリンパ球と単球の一部のシフ
ト、明らかに溶解に依存しない効果も観察された。なぜ
なら、それは、対照のシリーズにおいても観察されるか
らである（図１）。
で標識された血液（溶解を伴わずにＰＢＳ中で５００倍
に希釈された、０．０２mlのＣＤ４５−フィコエリスリ
ン当り０．１mlの血液）を、（４００ボルトに対応す
る）蛍光チャンネルＦＬ２内の閾値を適用することによ
り、サイトメトリーによりアッセイした。実施例１、実
施例２、及び塩化アンモニウムの溶解試薬の遂行と、溶
解を伴わない対照とを比較することにより（図１，２，
３、及び４）、よく保存された単球とリンパ球の形態学
が、そして特にＮＨ4 Ｃｌの場合、右側への、多核細胞
の位置の僅かな修飾が、見られる。保存の間、時間の関
数としての右側への多核細胞におけるシフトも観察さ
れ、これは、このシフトが多核細胞の部分的破壊に関係
しているということを示している。上記サンプルの保存
の間、死骸の領域におけるリンパ球と単球の一部のシフ
ト、明らかに溶解に依存しない効果も観察された。なぜ
なら、それは、対照のシリーズにおいても観察されるか
らである（図１）。
【００２５】同じ現象が、溶解後の保存シリーズにおい
て、そして実施例１と実施例２の調製物を使用した方法
の洗浄を伴わずに、観察される（８，９）。これは、実
施例１と２の試薬中での細胞の保存が、ＰＢＳ中での保
存と異ならないということを示す。他方において、ＮＨ
4 Ｃｌ中での保存は（図１０）は、その材料の速い分解
を示す。ひじょうに良好な保存が、ＰＢＳ中での洗浄後
に（図５，６）又は洗浄を伴わずに（図１１，１２）、
ホルムアルデヒドの存在下、実施例１と２の試薬を用い
て得られた。ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデヒドが非適合性
である（両立しない）という事実にも拘らず、上記の反
応に従って使用されたＮＨ4 Ｃｌをホルムアルデヒドに
より置換することにより混合物を創出する試みを行っ
た。溶解と洗浄の後に、右側への多核細胞のシフトが観
察され、そしてリンパ球が速く破壊され、そして死骸と
共に発見された（図７）。明らかに、ホルムアルデヒド
は上記混合物中にほとんど残っていない。なぜなら、洗
浄を伴わない生成物中の分解は（図１３）、ホルムアル
デヒドによらないＮＨ4 Ｃｌによるよりも低いからであ
る（図１０）。
て、そして実施例１と実施例２の調製物を使用した方法
の洗浄を伴わずに、観察される（８，９）。これは、実
施例１と２の試薬中での細胞の保存が、ＰＢＳ中での保
存と異ならないということを示す。他方において、ＮＨ
4 Ｃｌ中での保存は（図１０）は、その材料の速い分解
を示す。ひじょうに良好な保存が、ＰＢＳ中での洗浄後
に（図５，６）又は洗浄を伴わずに（図１１，１２）、
ホルムアルデヒドの存在下、実施例１と２の試薬を用い
て得られた。ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデヒドが非適合性
である（両立しない）という事実にも拘らず、上記の反
応に従って使用されたＮＨ4 Ｃｌをホルムアルデヒドに
より置換することにより混合物を創出する試みを行っ
た。溶解と洗浄の後に、右側への多核細胞のシフトが観
察され、そしてリンパ球が速く破壊され、そして死骸と
共に発見された（図７）。明らかに、ホルムアルデヒド
は上記混合物中にほとんど残っていない。なぜなら、洗
浄を伴わない生成物中の分解は（図１３）、ホルムアル
デヒドによらないＮＨ4 Ｃｌによるよりも低いからであ
る（図１０）。
【００２６】洗浄なしでは、ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデ
ヒドの反応生成物は上記細胞にとって明らかに毒性であ
る。なぜなら、洗浄を伴う溶解においては、左側への、
そして底への顆粒状の変位を伴うかなりの分解が、保存
の間に生じたからである（図１０）。実験２：溶解後の細胞の生存能力の証明 細胞の生存能力
の推定を、ＲＰＭ１ １０％胎児子ウシ血清培地の存在
下、かつフィトヘマグルチニン１０μｇ／mlとインター
ロイキン−２（SIGMA, St-Louis, Missouri, 20 ユニッ
ト／ml）の存在下、溶解又は分離後のリンパ球又は白血
球集団の培養により得た。実施例１の方法により調製さ
れた白血球集団を、Ficoll (Histopaque（登録商標）SI
GMA, St-Louis, Missouri)上でBoyum に従って調製され
たリンパ球調製物（Scandinavian Journal of Clinical
and LaboratoryInvestigation 1967-1968, Suppl. 94-
101. 305.293)と比較した。後者は、生存能力の損失を
伴わないリンパ球調製方法の参照として認められてい
る。
ヒドの反応生成物は上記細胞にとって明らかに毒性であ
る。なぜなら、洗浄を伴う溶解においては、左側への、
そして底への顆粒状の変位を伴うかなりの分解が、保存
の間に生じたからである（図１０）。実験２：溶解後の細胞の生存能力の証明 細胞の生存能力
の推定を、ＲＰＭ１ １０％胎児子ウシ血清培地の存在
下、かつフィトヘマグルチニン１０μｇ／mlとインター
ロイキン−２（SIGMA, St-Louis, Missouri, 20 ユニッ
ト／ml）の存在下、溶解又は分離後のリンパ球又は白血
球集団の培養により得た。実施例１の方法により調製さ
れた白血球集団を、Ficoll (Histopaque（登録商標）SI
GMA, St-Louis, Missouri)上でBoyum に従って調製され
たリンパ球調製物（Scandinavian Journal of Clinical
and LaboratoryInvestigation 1967-1968, Suppl. 94-
101. 305.293)と比較した。後者は、生存能力の損失を
伴わないリンパ球調製方法の参照として認められてい
る。
【００２７】ＮＨ4 Ｃｌを用いた方法(ORTHO DIAGNOSTI
C SYSTEMS Co., Raritan, New Jersey) に従ったリンパ
球の調製も含まれる。図１４中、その生存能力を、アネ
キシン−５（ａｎｎｅｘｉｎ−５）（ＷＯ−Ａ−９５／
２７９０３）による標識付けに従った、非壊死性又はア
ポトーシスの（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、Ｔ細胞（ＣＤ３
＋）の培養における数に基づき証明し、そして推定し
た。図１４は、フィトヘマグルチニン及びインターロイ
キン−２の影響下、時間にわたるＴ細胞の増殖を示して
いる。 結論：実施例１に従った溶解後の生存能力は、Ｈｉｓｔ
ｏｐａｑｕｅ（登録商標）分離後のものと実質的に同一
である。一方、塩化アンモニウムを用いた溶解後の生存
能力は大きく減少される。
C SYSTEMS Co., Raritan, New Jersey) に従ったリンパ
球の調製も含まれる。図１４中、その生存能力を、アネ
キシン−５（ａｎｎｅｘｉｎ−５）（ＷＯ−Ａ−９５／
２７９０３）による標識付けに従った、非壊死性又はア
ポトーシスの（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、Ｔ細胞（ＣＤ３
＋）の培養における数に基づき証明し、そして推定し
た。図１４は、フィトヘマグルチニン及びインターロイ
キン−２の影響下、時間にわたるＴ細胞の増殖を示して
いる。 結論：実施例１に従った溶解後の生存能力は、Ｈｉｓｔ
ｏｐａｑｕｅ（登録商標）分離後のものと実質的に同一
である。一方、塩化アンモニウムを用いた溶解後の生存
能力は大きく減少される。
【図１】図１は、対照−溶解試薬なし、について得られ
た結果を表す。
た結果を表す。
【図２】図２は、溶解から１０分後にホスフェート・バ
ッファー（ＰＢＳ）による洗浄を行うことにより、実施
例１の試薬について得られた結果を表す。
ッファー（ＰＢＳ）による洗浄を行うことにより、実施
例１の試薬について得られた結果を表す。
【図３】図３は、溶解から１０分後に洗浄を行うことに
より実施例３の試薬について得られた結果を表す。
より実施例３の試薬について得られた結果を表す。
【図４】図４は、溶解から１０分後に洗浄を行うことに
より、ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. 試薬、参照７７
０５２１−溶解剤＝ＮＨ4 Ｃｌについて得られた結果を
表す。
より、ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC. 試薬、参照７７
０５２１−溶解剤＝ＮＨ4 Ｃｌについて得られた結果を
表す。
【図５】図５は、実施例２の試薬について得られた結果
を表す。
を表す。
【図６】図６は、実施例４の試薬について得られた結果
を表す。
を表す。
【図７】図７は、０．３％のＨＣＨＯがそれに添加され
たところのORTHO DIAGNOSTICS試薬について得られた結
果を表す。
たところのORTHO DIAGNOSTICS試薬について得られた結
果を表す。
【図８】図８は、実施例１の試薬であるが洗浄を伴わな
いものについて得られた結果を表す。
いものについて得られた結果を表す。
【図９】図９は、実施例３の試薬であるが洗浄を伴わな
いものについて得られた結果を表す。
いものについて得られた結果を表す。
【図１０】図１０は、ORTHO DIAGNOSTICS 試薬であるが
洗浄を伴わないものについて得られた結果を表す。
洗浄を伴わないものについて得られた結果を表す。
【図１１】図１１は、実施例２の試薬であるが洗浄を伴
わないものについて得られた結果を表す。
わないものについて得られた結果を表す。
【図１２】図１２は、実施例４の試薬であるが洗浄を伴
わないものについて得られた結果を表す。
わないものについて得られた結果を表す。
【図１３】図１３は、０．３％ＨＣＨＯがそれに添加さ
れたところのORTHO DIAGNOSTICS試薬であるが洗浄を伴
わないものについて得られた結果を表す。
れたところのORTHO DIAGNOSTICS試薬であるが洗浄を伴
わないものについて得られた結果を表す。
【図１４】図１４は、インターロイキン−２とフィトヘ
マグルチニンを含む培養基中でのＴ細胞の増殖による溶
解後の細胞生存能力の証明を表す。培養の日数を横軸上
に表し、そして生きているＣＤ３細胞の数を縦軸上に示
す（１０6 細胞）。三角、丸、と四角は、それぞれ、Ｎ
Ｈ4 Ｃｌ、実施例１、及びＦｉｃｏｌｌを用いて得られ
た結果を表す。
マグルチニンを含む培養基中でのＴ細胞の増殖による溶
解後の細胞生存能力の証明を表す。培養の日数を横軸上
に表し、そして生きているＣＤ３細胞の数を縦軸上に示
す（１０6 細胞）。三角、丸、と四角は、それぞれ、Ｎ
Ｈ4 Ｃｌ、実施例１、及びＦｉｃｏｌｌを用いて得られ
た結果を表す。
Claims (14)
- 【請求項１】 白血球の細胞数測定の分析のために使用
されることができる溶解試薬であって、その溶解剤が４
〜９のpHにおいて使用される窒素含有複素環化合物であ
ることを特徴とする前記試薬。 - 【請求項２】 前記窒素含有複素環化合物がpH５〜８に
おいて使用されることを特徴とする、請求項１に記載の
溶解試薬。 - 【請求項３】 前記の使用される窒素含有複素環化合物
が単環であることを特徴とする、請求項１又は２に記載
の溶解試薬。 - 【請求項４】 前記の使用される窒素含有複素環化合物
が飽和であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の溶解試薬。 - 【請求項５】 前記の使用される窒素含有複素環化合物
が３〜８炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１〜
４のいずれか１項に記載の溶解試薬。 - 【請求項６】 前記の使用される窒素含有複素環が、ピ
ラゾリジン、イミダゾリジン及びイミダゾリン、ピペラ
ジン、モルフォリン、ピペリジン及びピロリジンから成
る群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の溶解試薬。 - 【請求項７】 前記窒素含有複素環化合物が、０．０１
〜０．２Ｍのモル濃度において存在することを特徴とす
る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の溶解試薬。 - 【請求項８】 前記所望のpHを与えるために使用される
前記化合物が、そのアニオンとしてクロリドを含むこと
を特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の溶
解試薬。 - 【請求項９】 それが、前記所望のpHを与えるために使
用されるアニオンとは別に、炭酸イオン、炭酸水素イオ
ン、カーバメート、又はホウ酸イオンである対イオンを
含むことを特徴とする、請求項８に記載の溶解試薬。 - 【請求項１０】 それが、有効量の緩衝液化剤を含むこ
とを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の
溶解試薬。 - 【請求項１１】 それが、有効量の抗凝血剤を含むこと
を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の
溶解試薬。 - 【請求項１２】 それが、脂肪族アルデヒドを含むこと
を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の
溶解試薬。 - 【請求項１３】 それが、約７．０のpHにおいて０．１
５Ｍの塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．００
０１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混
合物を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれ
か１項に記載の溶解試薬。 - 【請求項１４】 抗凝血剤により処理される全血のサン
プルが、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の溶解試
薬の作用を受ける、赤血球を溶解させる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9806055 | 1998-05-07 | ||
| FR9806055A FR2778413B1 (fr) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | Nouveaux reactifs et methode de lyse des erythrocytes |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008163866A Division JP4446059B2 (ja) | 1998-05-07 | 2008-06-23 | 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11352125A true JPH11352125A (ja) | 1999-12-24 |
Family
ID=9526319
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11127385A Withdrawn JPH11352125A (ja) | 1998-05-07 | 1999-05-07 | 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 |
| JP2008163866A Expired - Lifetime JP4446059B2 (ja) | 1998-05-07 | 2008-06-23 | 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008163866A Expired - Lifetime JP4446059B2 (ja) | 1998-05-07 | 2008-06-23 | 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0955543B1 (ja) |
| JP (2) | JPH11352125A (ja) |
| AT (1) | ATE237806T1 (ja) |
| AU (1) | AU747910B2 (ja) |
| DE (2) | DE69906859T2 (ja) |
| ES (1) | ES2141073T1 (ja) |
| FR (1) | FR2778413B1 (ja) |
| GR (1) | GR990300041T1 (ja) |
| NO (1) | NO992206L (ja) |
| NZ (1) | NZ335594A (ja) |
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| JP2016527917A (ja) * | 2013-08-20 | 2016-09-15 | イェディテペ・ウニヴェルシテシＹｅｄｉｔｅｐｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｓｉ | ホウ素添加細胞低温保存培地 |
| WO2018220835A1 (ja) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | 日立化成株式会社 | 血液試料中の希少細胞を分離する方法及び該細胞の遺伝子を解析する方法 |
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| ES2878451T3 (es) | 2014-11-14 | 2021-11-18 | Voyager Therapeutics Inc | Polinucleótidos moduladores |
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| EP3371591A4 (en) | 2015-11-02 | 2018-11-14 | Chiranjit Deka | Light scatter based apparatus and methods for hematology analysis using only three detectors |
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| WO2017189964A2 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
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