JP2008224696A - 赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】白血球の細胞数測定のために使用されることができる溶解試薬の提供。
【解決手段】本願発明に係る溶解試薬は、４〜９のpHにおいて使用されるイミダゾリジン及びイミダゾリン、モルフォリン、ピペリジン及びピロリジンから成る群から選ばれる飽和窒素含有複素環化合物である。
【選択図】なし
【解決手段】本願発明に係る溶解試薬は、４〜９のpHにおいて使用されるイミダゾリジン及びイミダゾリン、モルフォリン、ピペリジン及びピロリジンから成る群から選ばれる飽和窒素含有複素環化合物である。
【選択図】なし
Description
本発明は、白血球にとって非毒性であり、かつ脂肪族アルデヒド型の固定化剤の使用に適合する、赤血球の溶解のための新規の試薬及び方法に関する。
正常な血液中には、赤血球は、白血球よりも約１，０００倍多くあり、そして白血球の試験又は分析の障害となる。それ故、サイトメトリーの如き白血球分析、又は血液構成成分の遠心分離に関すサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）の方法は、ほとんどの場合、白血球から赤血球を分離するための工程に先行される（ＵＳ−Ａ−４ ２８４ ４１２，ＥＰ−Ａ−０ ０２２ ６７０）。
血液からリンパ球及び顆粒状を単離するためのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用した遠心分離による１の上記のような分離は、Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 1967-68, Suppl. 94-101. 305. 293中にBoyem により、そしてJournal of Immunological Methods: 1980, 33: 221-229 中Pertoff により記載されている。
血液からリンパ球及び顆粒状を単離するためのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）を使用した遠心分離による１の上記のような分離は、Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 1967-68, Suppl. 94-101. 305. 293中にBoyem により、そしてJournal of Immunological Methods: 1980, 33: 221-229 中Pertoff により記載されている。
これらの方法は、細胞の損失を、そしてそれ故、不履行のアッセイを導くことができる、いくつかの洗浄及び遠心分離をそれらが必要とするために、使用することが比較的困難である。しかしながら、上記方法は、最近、参照方法であると考えられている。なぜなら、白血球の形態学及び生存能力が、分離後に保存されているからである。
白血球分析に関する血液の溶解は、死骸の状態への赤血球の（ｒｅｄ ｃｏｒｐｕｓｃｌｅｓ）の破壊を含む。一方において、この溶解方法は、細胞数測定の白血球分析を許容し、そして赤血球の死骸から白血球を明確に区別するために、白血球の形態の最適な保存を目的とする。
赤血球の溶解は、赤血球の外側からの膜を通しての一定量の材料の通過という一般原理に基づく。この通過の間、その膜の状態は、細胞の膨潤に因り、又は通過材料中の膜の溶解に因り、悪化する。
赤血球の溶解は、赤血球の外側からの膜を通しての一定量の材料の通過という一般原理に基づく。この通過の間、その膜の状態は、細胞の膨潤に因り、又は通過材料中の膜の溶解に因り、悪化する。
溶解の間の、白血球の形態の保存は、その膜の付近のよりタンパク質に富む環境：外側及び内側の、トランスメンブラン・タンパク質、及び内側の、発達した細胞骨格に基づく。
この白血球膜の支持の利点は、固定化剤、例えば、その膜に浸透し、そして外側と内側を架橋することによりそのタンパク質構造を固定するホルムアルデヒドの使用により、最大限利用される。
赤血球の膜を通過するために使用される材料は、一般には、小さな中性分子、第１に低張性溶解において使用される水自体、又はChang et al.（米国特許第４ ９０２ ６１３号）中に記載されたようなジエチレン・グリコール、ホルムアルデヒド及びクエン酸の存在下の水である。ときどき、固定及び低張溶解が、Quintana(WO-89/0509)及びVan Agthoven (EP-A-0625706）により記載されたように、異なる段階において行われる。
この白血球膜の支持の利点は、固定化剤、例えば、その膜に浸透し、そして外側と内側を架橋することによりそのタンパク質構造を固定するホルムアルデヒドの使用により、最大限利用される。
赤血球の膜を通過するために使用される材料は、一般には、小さな中性分子、第１に低張性溶解において使用される水自体、又はChang et al.（米国特許第４ ９０２ ６１３号）中に記載されたようなジエチレン・グリコール、ホルムアルデヒド及びクエン酸の存在下の水である。ときどき、固定及び低張溶解が、Quintana(WO-89/0509)及びVan Agthoven (EP-A-0625706）により記載されたように、異なる段階において行われる。
ＥＰ−Ａ−６２５ ７０７中に記載されたような等張溶解の場合には、通過される材料は、ホルムアルデヒド、グリセロール、ブタノール、及びクエン酸の混合物から成る。
等張溶解の他の方法は、サポニン、ＷＯ８５／０５６４０中に記載されたような洗剤特性をもつ小さな分子を使用する。
溶解の一般原理が直ちには明らかでないような溶解の方法が存在する。これは、塩化アンモニウムを用いた溶解である。この溶解操作は、上記膜を通してのＮＨ3 とＣＯ3 の通過に依存する。ＮＨ3 とＣＯ2 は、上記混合物中ＮＨ4 + とＨＣＯ3 - と平衡状態にある。細胞内でのＮＨ3 からＮＨ4 + への、そして赤血球内に多量に存在する炭酸アンヒドラーゼによるＣＯ2 からＨＣＯ3 - への自発的再変換は、細胞に侵入するＮＨ3 とＣＯ2 の連続流の後の力であることができるであろう。
等張溶解の他の方法は、サポニン、ＷＯ８５／０５６４０中に記載されたような洗剤特性をもつ小さな分子を使用する。
溶解の一般原理が直ちには明らかでないような溶解の方法が存在する。これは、塩化アンモニウムを用いた溶解である。この溶解操作は、上記膜を通してのＮＨ3 とＣＯ3 の通過に依存する。ＮＨ3 とＣＯ2 は、上記混合物中ＮＨ4 + とＨＣＯ3 - と平衡状態にある。細胞内でのＮＨ3 からＮＨ4 + への、そして赤血球内に多量に存在する炭酸アンヒドラーゼによるＣＯ2 からＨＣＯ3 - への自発的再変換は、細胞に侵入するＮＨ3 とＣＯ2 の連続流の後の力であることができるであろう。
塩化アンモニウムによる溶解は、固定化剤の非存在下で行われることができる最も有効な溶解であり、そしてそれ故、多くの研究実験室の好ましい方法である。この方法の制限は、その溶解プロセスの間に白血球がそれらの生存能力をひじょうに速く失うということである。明らかに、細胞の内部は、上記２反応の生成物により、最初にアルカリ性にされる；ＮＨ5 ＣＯ3 ）。その後、溶解及び赤血球からの炭酸アンヒドラーゼの放出後の反応において、その溶解バッファー中に存在する重炭酸塩からの反応ＨＣＯ3 →ＣＯ2 ＋ＯＨ- は、その混合物全体をアルカリ性にし、これは、白血球の分解を引き起こす。これらの毒性状態により、ひじょうに速く、通常、調製を行ってから１〜２時間後に、読みを記録しなければならない。
この方法の他の制限は、以下の反応：
６ＨＣＨＯ＋４ＮＨ3 →Ｃ6 Ｈ12Ｎ4 ＋６Ｈ2 Ｏ
に因り、塩化アンモニウムの使用とホルムアルデヒドの使用を組み合せることができないという事実である。
形成されたヘキサメチレン・テトラミンは安定であり、そしてそれ故、その混合物は、その反応の間、白血球に有害な程に酸性となる。なぜなら、培地中のＮＨ3 の除去はその平衡をシフトさせ、そしてそのＨ+ イオンがもはや補償されないからである。
要するに、塩化アンモニウムは、脂肪族アルデヒドに不適合であることが証明されており、そしてそれ故、両者が共に使用されるとき、溶解は速やかに停止する。
６ＨＣＨＯ＋４ＮＨ3 →Ｃ6 Ｈ12Ｎ4 ＋６Ｈ2 Ｏ
に因り、塩化アンモニウムの使用とホルムアルデヒドの使用を組み合せることができないという事実である。
形成されたヘキサメチレン・テトラミンは安定であり、そしてそれ故、その混合物は、その反応の間、白血球に有害な程に酸性となる。なぜなら、培地中のＮＨ3 の除去はその平衡をシフトさせ、そしてそのＨ+ イオンがもはや補償されないからである。
要するに、塩化アンモニウムは、脂肪族アルデヒドに不適合であることが証明されており、そしてそれ故、両者が共に使用されるとき、溶解は速やかに停止する。
それ故、できるだけ白血球の細胞生存能力を保持する、赤血球のための溶解試薬及び溶解方法をもつことが望ましいであろう。上記調製を実施してから長い時間後に、例えば、上記生成物の反応から１日以上たった後に、細胞数測定の読みが行われることを可能にする、赤血球の溶解試薬及び溶解方法をもつことも望ましいであろう。
ホルムアルデヒドの使用も適用性である赤血球の溶解試薬と溶解方法も望ましいであろう。
長い間の研究の後、本出願人は、上記問題を溶解剤として窒素含有複素環化合物を使用することにより解決した。
ホルムアルデヒドの使用も適用性である赤血球の溶解試薬と溶解方法も望ましいであろう。
長い間の研究の後、本出願人は、上記問題を溶解剤として窒素含有複素環化合物を使用することにより解決した。
上記の理由により、本願は、白血球の細胞測定分析のために使用されることができる溶解試薬であって、この溶解剤が、４〜９のpH、好ましくは５〜８のpH、特に６〜７．５のpH、より特に６．８〜７．２のpHにおいて使用される窒素含有複素環化合物であることを特徴とする。
用語“溶解剤”は、前記窒素含有複素環化合物が、使用される基本的な溶解剤であるということを意味する。
本願出願人は、実際、溶解剤としての窒素含有複素環化合物の使用が、白血球を保護するためにホルムアルデヒドの使用と適合しながら、ＮＨ4 Ｃｌを適用する結果を与えるということが発見された。上記脂肪族アルデヒドは上記窒素含有複素環化合物と反応するが、上記溶解培地中での反応が完全ではなく、そして上記生成物は一般に、安定な反応生成物を形成せずに平衡状態において残存するようであろう。
用語“溶解剤”は、前記窒素含有複素環化合物が、使用される基本的な溶解剤であるということを意味する。
本願出願人は、実際、溶解剤としての窒素含有複素環化合物の使用が、白血球を保護するためにホルムアルデヒドの使用と適合しながら、ＮＨ4 Ｃｌを適用する結果を与えるということが発見された。上記脂肪族アルデヒドは上記窒素含有複素環化合物と反応するが、上記溶解培地中での反応が完全ではなく、そして上記生成物は一般に、安定な反応生成物を形成せずに平衡状態において残存するようであろう。
上記窒素含有複素環化合物は、例えば、２環、そして好ましくは単環であることができる。それは不飽和であることができ、その場合、それは、例えば５、そして好ましくは４、顕著には３、特に２の２重結合を含み、そしてそれは、好ましくは飽和である。それは、例えば、３〜８、顕著には３〜６、そして特に３〜５、そしてより特に４又は５の炭素原子を含む。それは、２の、顕著には、１の単一の窒素原子をもつ。
飽和の窒素含有複素環化合物の例は、ピラゾリジン、イミダゾリジン及びイミダゾリン、ピペラジン、顕著にはモルフォリン、及び特にピペリジン又はピロリジンを含む。
飽和の窒素含有複素環化合物の例は、ピラゾリジン、イミダゾリジン及びイミダゾリン、ピペラジン、顕著にはモルフォリン、及び特にピペリジン又はピロリジンを含む。
本発明に係る溶解試薬においては、上記窒素含有複素環化合物は、０．０１〜０．２Ｍ、特に０．０５〜０．１９Ｍ、そしてより特に０．１〜０．１８Ｍのモル濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の使用の全体として優先的な条件下では、０．１５Ｍの濃度が使用される。
上記濃度は、赤血球溶解の間の、関係する化合物の量に関して与えられる。
本発明の使用の他の優先的な条件下では、上記の溶解試薬について所望のpHを付与するために本発明に従って使用される化合物は、アニオンとして、例えば、ＨＣｌの形態で塩素を使用する。
上記濃度は、赤血球溶解の間の、関係する化合物の量に関して与えられる。
本発明の使用の他の優先的な条件下では、上記の溶解試薬について所望のpHを付与するために本発明に従って使用される化合物は、アニオンとして、例えば、ＨＣｌの形態で塩素を使用する。
さらに他の優先的な使用条件下、本発明の溶解試薬は、上記溶解試薬について所望のpHを与えるために本発明に従って使用されるアニオンとは別に、炭酸イオン、炭酸水素イオンであるが好ましくはホウ素イオンである対イオンをも含む。
実際、ホウ酸イオンは重炭酸イオンのように分解を受けず、そしてそれ故、細胞の良好な安定性に寄与し、溶解が行われてからはるか後に、細胞数測定の読みを許容するということが、発見されている。その上、その使用は、安定性の溶解溶液の調製を許容し、これは、炭酸水素塩の場合にはそうではない。
実際、ホウ酸イオンは重炭酸イオンのように分解を受けず、そしてそれ故、細胞の良好な安定性に寄与し、溶解が行われてからはるか後に、細胞数測定の読みを許容するということが、発見されている。その上、その使用は、安定性の溶解溶液の調製を許容し、これは、炭酸水素塩の場合にはそうではない。
本発明に係る溶解試薬においては、上記対イオンは、０．００１〜０．２Ｍ、特に０．００５〜０．１Ｍ、そしてより特に０．０１〜０．０５Ｍのモル濃度で存在することができる。本発明に従えば、上記ホウ酸塩は、上記炭酸塩よりも高い濃度で使用される。例えば、０．０４Ｍのホウ酸塩の濃度が、０．０１Ｍの炭酸塩又は炭酸水素塩の濃度の代わりに使用される。
本発明の使用の他の優先的な条件下、本発明の溶解試薬は、特にpH６．５〜７．５の有効量の緩衝剤をも含む。緩衝剤の例は、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタン・スルホン酸）、顕著にはＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロペン・スルホン酸）、そして特にＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタン・スルホン酸）を含む。
本発明の使用の他の優先的な条件下、本発明の溶解試薬は、特にpH６．５〜７．５の有効量の緩衝剤をも含む。緩衝剤の例は、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタン・スルホン酸）、顕著にはＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロペン・スルホン酸）、そして特にＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタン・スルホン酸）を含む。
本発明に係る溶解試薬においては、上記緩衝剤は、０．０００１〜０．０５Ｍ、特に０．０００５〜０．０３Ｍ、そしてより特に０．００２〜０．００８Ｍのモル濃度で存在することができる。
本発明のさらに他の優先的な条件下では、本発明の溶解試薬は、有効量の抗凝血剤をも含む。
抗凝血剤の例は、ヘパリン、顕著には、クエン酸イオン、そして特にＥＤＴＡを含む。
本発明の使用の全体として優先的な条件下では、０．１５Ｍの塩化ピロリドン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混合物が、７．０付近のpHで使用される。
本発明のさらに他の優先的な条件下では、本発明の溶解試薬は、有効量の抗凝血剤をも含む。
抗凝血剤の例は、ヘパリン、顕著には、クエン酸イオン、そして特にＥＤＴＡを含む。
本発明の使用の全体として優先的な条件下では、０．１５Ｍの塩化ピロリドン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混合物が、７．０付近のpHで使用される。
上記溶解試薬の使用のさらに他の優先的な条件下では、さらに固定化剤、顕著には、脂肪族アルデヒド、例えば、Ｃ1 〜Ｃ5 を含むもの、例えば、パラホルムアルデヒド、そして特にホルムアルデヒドが使用される。
上記脂肪族アルデヒドは、０．０１％〜５％、特に０．１４％〜１％、そしてより特に０．１％〜０．５％の濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の使用の優先的な条件下では、固定剤と共に、０．１５Ｍの塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１ＭのＥＤＴＡ、０．００５ＭのＨＥＰＥＳ、及び０．３％のホルムアルデヒドが使用される。
本発明は、抗凝血剤、例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで処理された全血のサンプルが上記の溶解試薬の作用を受けるような、赤血球の溶解方法をも提供する。
上記脂肪族アルデヒドは、０．０１％〜５％、特に０．１４％〜１％、そしてより特に０．１％〜０．５％の濃度で存在することができる。上記の溶解試薬の使用の優先的な条件下では、固定剤と共に、０．１５Ｍの塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１ＭのＥＤＴＡ、０．００５ＭのＨＥＰＥＳ、及び０．３％のホルムアルデヒドが使用される。
本発明は、抗凝血剤、例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸イオンで処理された全血のサンプルが上記の溶解試薬の作用を受けるような、赤血球の溶解方法をも提供する。
白血球細胞を標識付けするためにモノクローナル抗体の非存在下又は存在下で操作することができる。これらの抗体は、蛍光性化合物、例えば下記のようなものに結合されても、されなくてもよい。好ましい使用条件下では、これらの抗体は、蛍光性化合物に結合される。
上記溶解試薬は、以下のように使用されることができる：
抗凝血剤で処理され、そして前もって、モノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合されたモノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合されたモノクローナル抗体混合物と共にインキュベートされた、０．１mlの血液のサンプルを、３７℃の温度まで事前に加熱された上述の溶解試薬２mlと接触させ、そして１０分間にわたり放置して冷却し、その間に溶解を完結させる。このようなマーカーは、例えば、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソシアネートと組み合されたＣＤ４５）又はフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）と組み合されたＣＤ１４であり、そして例えば、DAKO, BECTON and DICKINSON又はIMMUNOTECHのような企業により購売されている。次に、溶解直後又は３日後までに、例えば、BECTON and DICKINSON Facscanタイプの、サイトメーター内で読みを実行する。
抗凝血剤で処理され、そして前もって、モノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合されたモノクローナル抗体と、又は蛍光マーカーと組み合されたモノクローナル抗体混合物と共にインキュベートされた、０．１mlの血液のサンプルを、３７℃の温度まで事前に加熱された上述の溶解試薬２mlと接触させ、そして１０分間にわたり放置して冷却し、その間に溶解を完結させる。このようなマーカーは、例えば、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソシアネートと組み合されたＣＤ４５）又はフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）と組み合されたＣＤ１４であり、そして例えば、DAKO, BECTON and DICKINSON又はIMMUNOTECHのような企業により購売されている。次に、溶解直後又は３日後までに、例えば、BECTON and DICKINSON Facscanタイプの、サイトメーター内で読みを実行する。
本発明に従う使用の優先的な条件下では、上記の優先的な条件が、溶解試薬及び溶解方法のために選ばれる。
図１〜図１３は、溶解直後（０時間）、及び２４時間、４８時間、及び７２時間後における：大きな角度と小さな角度における拡散を比較することによるBECTON and DICKINSONからのFacscan を使用したサイトメトリーにより得られた結果を表す。
図１〜図１３は、溶解直後（０時間）、及び２４時間、４８時間、及び７２時間後における：大きな角度と小さな角度における拡散を比較することによるBECTON and DICKINSONからのFacscan を使用したサイトメトリーにより得られた結果を表す。
以下の例は本発明を説明する。
参照調製物
ＮＨ4 Ｃｌ（Ortho Diagnostics 参照）に基づく溶解試薬を使用した。
実施例１：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
実施例２：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
０．１Ｍ ホルムアルデヒド
pH７．０
参照調製物
ＮＨ4 Ｃｌ（Ortho Diagnostics 参照）に基づく溶解試薬を使用した。
実施例１：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
実施例２：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピロリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
０．１Ｍ ホルムアルデヒド
pH７．０
実施例３：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
pH：７．０
実施例４：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
０．１Ｍ ホルムアルデヒド
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
pH：７．０
実施例４：溶解試薬の調製
以下の配合に一致する溶解試薬を調製した：
０．１５Ｍ ピペリジン−ＨＣｌ
０．０４Ｍ ホウ酸
０．００５Ｍ ＨＥＰＥＳ
０．０００１Ｍ ＥＤＴＡ
０．１Ｍ ホルムアルデヒド
薬理学的研究
実験１：赤血球の溶解の証明
ＥＤＴＡを含む血液から出発して、サンプリングから２時間後、１００μｌのサンプルを、参照ＩＭ１２０１の下、IMMUNOTECHにより購売された、２０μｌの単球マーカー（ＣＤ１４−フィコエリスリン）及び白血球マーカー（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）の存在下、１５分間インキュベートした。次にこれらのサンプルを、異なる温度で、異なる溶解調製物、顕著には上記のものと混合し、周囲温度で１０分間、溶解に供し、次にこれらのサンプルの一部を、遠心分離（５分間、３００ｇ）後にホスフェート・バッファー（ＰＢＳ）中に溶解させた。これらのサンプルを４℃で保存する。
実験１：赤血球の溶解の証明
ＥＤＴＡを含む血液から出発して、サンプリングから２時間後、１００μｌのサンプルを、参照ＩＭ１２０１の下、IMMUNOTECHにより購売された、２０μｌの単球マーカー（ＣＤ１４−フィコエリスリン）及び白血球マーカー（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）の存在下、１５分間インキュベートした。次にこれらのサンプルを、異なる温度で、異なる溶解調製物、顕著には上記のものと混合し、周囲温度で１０分間、溶解に供し、次にこれらのサンプルの一部を、遠心分離（５分間、３００ｇ）後にホスフェート・バッファー（ＰＢＳ）中に溶解させた。これらのサンプルを４℃で保存する。
上記サンプルを、直後に又は３mlのホスフェート・バッファーで洗浄した後にＦＡＣＳＣＡＮサイトメーター（BECTON & DICKINSON）上に分析し、そしてその後、保存の間、２４時間の間隔で分析した。
図１〜１３は、Ｓｉｍｕｌｓｅｔプログラム（BECTON & DICKINSON）を使用して分析された溶解された血液調製物の散乱図（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍｓ）を示す。白血球配合物中のリンパ球、単球、及び顆粒球のパーセンテージを大きな角度と小さな角度及びＣＤ４５／ＣＤ１４蛍光における拡散ダイアグラムに基づいて推定した。
図１〜１３は、Ｓｉｍｕｌｓｅｔプログラム（BECTON & DICKINSON）を使用して分析された溶解された血液調製物の散乱図（ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｍｓ）を示す。白血球配合物中のリンパ球、単球、及び顆粒球のパーセンテージを大きな角度と小さな角度及びＣＤ４５／ＣＤ１４蛍光における拡散ダイアグラムに基づいて推定した。
対照として、ＣＤ４５−フィコエリスリンで標識された血液（溶解を伴わずにＰＢＳ中で５００倍に希釈された、０．０２mlのＣＤ４５−フィコエリスリン当り０．１mlの血液）を、（４００ボルトに対応する）蛍光チャンネルＦＬ２内の閾値を適用することにより、サイトメトリーによりアッセイした。
実施例１、実施例２、及び塩化アンモニウムの溶解試薬の遂行と、溶解を伴わない対照とを比較することにより（図１，２，３、及び４）、よく保存された単球とリンパ球の形態学が、そして特にＮＨ4 Ｃｌの場合、右側への、多核細胞の位置の僅かな修飾が、見られる。
保存の間、時間の関数としての右側への多核細胞におけるシフトも観察され、これは、このシフトが多核細胞の部分的破壊に関係しているということを示している。上記サンプルの保存の間、死骸の領域におけるリンパ球と単球の一部のシフト、明らかに溶解に依存しない効果も観察された。なぜなら、それは、対照のシリーズにおいても観察されるからである（図１）。
実施例１、実施例２、及び塩化アンモニウムの溶解試薬の遂行と、溶解を伴わない対照とを比較することにより（図１，２，３、及び４）、よく保存された単球とリンパ球の形態学が、そして特にＮＨ4 Ｃｌの場合、右側への、多核細胞の位置の僅かな修飾が、見られる。
保存の間、時間の関数としての右側への多核細胞におけるシフトも観察され、これは、このシフトが多核細胞の部分的破壊に関係しているということを示している。上記サンプルの保存の間、死骸の領域におけるリンパ球と単球の一部のシフト、明らかに溶解に依存しない効果も観察された。なぜなら、それは、対照のシリーズにおいても観察されるからである（図１）。
同じ現象が、溶解後の保存シリーズにおいて、そして実施例１と実施例２の調製物を使用した方法の洗浄を伴わずに、観察される（８，９）。
これは、実施例１と２の試薬中での細胞の保存が、ＰＢＳ中での保存と異ならないということを示す。他方において、ＮＨ4 Ｃｌ中での保存は（図１０）は、その材料の速い分解を示す。
ひじょうに良好な保存が、ＰＢＳ中での洗浄後に（図５，６）又は洗浄を伴わずに（図１１，１２）、ホルムアルデヒドの存在下、実施例１と２の試薬を用いて得られた。
ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデヒドが非適合性である（両立しない）という事実にも拘らず、上記の反応に従って使用されたＮＨ4 Ｃｌをホルムアルデヒドにより置換することにより混合物を創出する試みを行った。溶解と洗浄の後に、右側への多核細胞のシフトが観察され、そしてリンパ球が速く破壊され、そして死骸と共に発見された（図７）。明らかに、ホルムアルデヒドは上記混合物中にほとんど残っていない。なぜなら、洗浄を伴わない生成物中の分解は（図１３）、ホルムアルデヒドによらないＮＨ4 Ｃｌによるよりも低いからである（図１０）。
これは、実施例１と２の試薬中での細胞の保存が、ＰＢＳ中での保存と異ならないということを示す。他方において、ＮＨ4 Ｃｌ中での保存は（図１０）は、その材料の速い分解を示す。
ひじょうに良好な保存が、ＰＢＳ中での洗浄後に（図５，６）又は洗浄を伴わずに（図１１，１２）、ホルムアルデヒドの存在下、実施例１と２の試薬を用いて得られた。
ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデヒドが非適合性である（両立しない）という事実にも拘らず、上記の反応に従って使用されたＮＨ4 Ｃｌをホルムアルデヒドにより置換することにより混合物を創出する試みを行った。溶解と洗浄の後に、右側への多核細胞のシフトが観察され、そしてリンパ球が速く破壊され、そして死骸と共に発見された（図７）。明らかに、ホルムアルデヒドは上記混合物中にほとんど残っていない。なぜなら、洗浄を伴わない生成物中の分解は（図１３）、ホルムアルデヒドによらないＮＨ4 Ｃｌによるよりも低いからである（図１０）。
洗浄なしでは、ＮＨ4 Ｃｌとホルムアルデヒドの反応生成物は上記細胞にとって明らかに毒性である。なぜなら、洗浄を伴う溶解においては、左側への、そして底への顆粒状の変位を伴うかなりの分解が、保存の間に生じたからである（図１０）。
実験２：溶解後の細胞の生存能力の証明
細胞の生存能力の推定を、ＲＰＭ１ １０％胎児子ウシ血清培地の存在下、かつフィトヘマグルチニン１０μｇ／mlとインターロイキン−２（SIGMA, St-Louis, Missouri, 20 ユニット／ml）の存在下、溶解又は分離後のリンパ球又は白血球集団の培養により得た。実施例１の方法により調製された白血球集団を、Ficoll (Histopaque（登録商標）SIGMA, St-Louis, Missouri)上でBoyum に従って調製されたリンパ球調製物（Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 1967-1968, Suppl. 94-101. 305.293)と比較した。後者は、生存能力の損失を伴わないリンパ球調製方法の参照として認められている。
実験２：溶解後の細胞の生存能力の証明
細胞の生存能力の推定を、ＲＰＭ１ １０％胎児子ウシ血清培地の存在下、かつフィトヘマグルチニン１０μｇ／mlとインターロイキン−２（SIGMA, St-Louis, Missouri, 20 ユニット／ml）の存在下、溶解又は分離後のリンパ球又は白血球集団の培養により得た。実施例１の方法により調製された白血球集団を、Ficoll (Histopaque（登録商標）SIGMA, St-Louis, Missouri)上でBoyum に従って調製されたリンパ球調製物（Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation 1967-1968, Suppl. 94-101. 305.293)と比較した。後者は、生存能力の損失を伴わないリンパ球調製方法の参照として認められている。
ＮＨ4 Ｃｌを用いた方法(ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS Co., Raritan, New Jersey) に従ったリンパ球の調製も含まれる。
図１４中、その生存能力を、アネキシン−５（ａｎｎｅｘｉｎ−５）（ＷＯ−Ａ−９５／２７９０３）による標識付けに従った、非壊死性又はアポトーシスの（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）の培養における数に基づき証明し、そして推定した。図１４は、フィトヘマグルチニン及びインターロイキン−２の影響下、時間にわたるＴ細胞の増殖を示している。
結論：
実施例１に従った溶解後の生存能力は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）分離後のものと実質的に同一である。一方、塩化アンモニウムを用いた溶解後の生存能力は大きく減少される。
図１４中、その生存能力を、アネキシン−５（ａｎｎｅｘｉｎ−５）（ＷＯ−Ａ−９５／２７９０３）による標識付けに従った、非壊死性又はアポトーシスの（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）の培養における数に基づき証明し、そして推定した。図１４は、フィトヘマグルチニン及びインターロイキン−２の影響下、時間にわたるＴ細胞の増殖を示している。
結論：
実施例１に従った溶解後の生存能力は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）分離後のものと実質的に同一である。一方、塩化アンモニウムを用いた溶解後の生存能力は大きく減少される。
Claims (12)
- 白血球の細胞数測定の分析のために使用されることができる溶解試薬であって、その溶解剤が４〜９のpHにおいて使用される、イミダゾリジン及びイミダゾリン、モルフォリン、ピペリジン及びピロリジンから成る群から選ばれる飽和窒素含有複素環化合物であることを特徴とする前記試薬。
- 前記窒素含有複素環化合物がpH５〜８において使用されることを特徴とする、請求項１に記載の溶解試薬。
- 前記の使用される窒素含有複素環化合物が単環であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の溶解試薬。
- 前記の使用される窒素含有複素環化合物が３〜８炭素原子を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 前記窒素含有複素環化合物が、０．０１〜０．２Ｍのモル濃度で存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 前記所望のpHを与えるために使用される前記化合物が、そのアニオンとしてクロリドを含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 前記所望のpHを与えるために使用されるアニオンとは別に、炭酸イオン、炭酸水素イオン又はホウ酸イオンである対イオンを含むことを特徴とする、請求項６に記載の溶解試薬。
- 有効量の緩衝液化剤を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 有効量の抗凝血剤を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 脂肪族アルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- ７．０のpHにおいて０．１５Ｍの塩化ピロリジン、０．０４Ｍのホウ酸、０．０００１ＭのＥＤＴＡ、及び０．００５ＭのＨＥＰＥＳの混合物を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の溶解試薬。
- 抗凝血剤により処理される全血のサンプルが、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の溶解試薬の作用を受ける、赤血球を溶解させる方法。
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