WO2018220835A1 - 血液試料中の希少細胞を分離する方法及び該細胞の遺伝子を解析する方法 - Google Patents

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清太 中村
勝也 遠藤
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日立化成株式会社
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating rare cells in a blood sample and a method for analyzing genes of the cells.
  • the blood may contain a small amount of cells other than these blood cells, as well as red blood cells, white blood cells, and platelets.
  • CTC Circulating Tumor Cell
  • the primary cancer cells circulate in the body as a CTC in the flow of blood or lymph and metastasize to other organ tissues. Therefore, cancer metastasis can be detected early by detecting CTC in the blood sample.
  • Circulating endothelial cells are present in the peripheral blood.
  • CEC is an endothelial cell (mature cell) that has been detached from the blood vessel wall due to metabolism, and the number of CEC is known to increase due to many diseases such as cardiovascular disease, infectious disease, immune disease, and cancer. .
  • a technique for separating and analyzing these rare cells is required.
  • a method of separating rare cells in blood there is a method of separating rare cells using a filter based on differences in cell size and deformability (for example, Patent Document 1).
  • a blood sample is filtered.
  • rare cells are trapped on the filter while blood cells pass through the pores of the filter and are removed along with the filtrate.
  • RNA analysis of cells can be performed by extracting RNA from cells, reverse transcription, and then amplifying (reverse transcription PCR).
  • many RNAs derived from impurities remaining without separation or transcription products thereof are derived from the gene to be analyzed.
  • the RNA or its transcription product is buried, or the presence of a component that prevents gene amplification in the contaminant does not sufficiently amplify the transcription product, so that gene analysis cannot be performed.
  • efficiency was poor. Accordingly, an object of the present invention is to separate rare cells from a blood sample and to analyze the genes of the separated rare cells so that efficient gene analysis of rare cells can be performed.
  • the method for separating rare cells in a blood sample according to the present invention includes a step of filtering a blood sample with a filter to capture the cells on the filter, a step of bringing a hemolytic agent into contact with the cells captured on the filter, And the hemolytic agent comprises ammonium chloride or cyclic amine.
  • the method for analyzing a gene of a rare cell in a blood sample according to the present invention includes a step of analyzing the gene of a rare cell isolated by the above method.
  • the rare cell may be a circulating cancer cell in the blood.
  • the rare cells and erythrocytes are separated using a specific hemolytic agent, the rare cells are separated from the blood sample so that efficient gene analysis of the rare cells is possible. Can do.
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line II-II in FIG. It is a schematic diagram which shows the structure of a CTC acquisition apparatus.
  • the method of separating rare cells in a blood sample according to the present invention includes a step of filtering a blood sample with a filter and capturing the cells on the filter (filtration step), and contacting a hemolyzing agent with the cells captured on the filter A process (hemolysis process).
  • blood collected from a subject may be used as it is, or blood diluted with a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or other suitable medium may be used.
  • a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or other suitable medium
  • CTAD phosphate buffered saline
  • additives usually added to the blood sample such as CTAD (citrate, theophylline, adenosine, dipyridamole) may be added within a range not impairing the effects of the present invention.
  • CTAD cetylline
  • “Rare cells” are specific types of cells contained in the blood, and usually the number of cells is extremely small relative to the total number of all cells in the blood. Rare cells are, for example, cancer cells such as CTC or cancer stem cells, endothelial cells such as CEC, and stem cells such as hematopoietic stem cells.
  • cells in the blood sample are captured on the filter by filtering the blood sample with a filter.
  • “capturing” means that a blood sample is filtered through a filter, and cells in the blood sample remain on the filter.
  • rare cells are captured on the filter, while many of the blood cells pass through the pores of the filter and are removed along with the filtrate.
  • the number of blood cells in the blood sample is much larger than the number of rare cells, some blood cells also remain on the filter together with the rare cells.
  • the filter is not particularly limited as long as it can capture rare cells present in the blood sample, and a conventionally known filter can be used.
  • the filter may be a metal filter, for example, and includes a through-hole having a pore size corresponding to the diameter of a rare cell.
  • the hole diameter of the through hole refers to the maximum value of the diameter of a sphere that can pass through the through hole.
  • the pore diameter of the through hole is preferably 5 ⁇ m to 15 ⁇ m, more preferably 6 ⁇ m to 12 ⁇ m, and even more preferably 7 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the cells may be washed after the filtration step (washing step).
  • the washing step is performed, for example, by bringing a washing solution containing a known buffer solution such as PBS into contact with the cells.
  • the washing solution may contain additives such as bovine serum albumin (BSA) or EDTA. Washing is not limited to after the filtration step, but can be appropriately performed before the filtration step and after the hemolysis step.
  • BSA bovine serum albumin
  • EDTA EDTA
  • the hemolyzing agent is brought into contact with the cells captured on the filter.
  • This can be done, for example, by filtering the hemolytic agent through a filter in which the cells are captured.
  • the hemolytic agent including the hemolyzed red blood cells is removed through the filter's through-holes, so that the freshly collected hemolytic agent is continuously contacted with the cells captured on the filter.
  • red blood cells can be efficiently hemolyzed with a small amount of hemolytic agent.
  • the flow rate for filtering the hemolytic agent is preferably 10 ⁇ L / min to 3000 ⁇ L / min, more preferably 20 ⁇ L / min to 1000 ⁇ L / min from the viewpoint of minimizing damage to rare cells and from the viewpoint of efficiently lysing red blood cells.
  • the hemolytic agent contains ammonium chloride or cyclic amine as a component (haemolytic component) having an action of hemolyzing red blood cells.
  • cyclic amines include pyrrolidine, heterocyclic N-alkylamine oxide, and lipogramistin A.
  • the hemolysis component may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the hemolytic component in the hemolytic agent is, for example, 0.1% by mass to 10% by mass, 0.5% by mass to 5% by mass, or 0 based on the total amount of the hemolytic agent. It may be from 8% to 3% by weight.
  • the hemolytic agent is a component that is usually added to the hemolytic agent, such as hydrochloric acid, sodium chloride, potassium chloride, disodium hydrogen phosphate, and potassium dihydrogen phosphate, as long as the effects of the present invention are not impaired. May be added.
  • the cartridge shown in FIGS. 1 and 2 can be used.
  • a method for separating rare cells in a blood sample using a cartridge according to an embodiment of the present invention will be described.
  • a cell capture cartridge (cartridge) 100 shown in FIGS. 1 and 2 has a housing having an inlet 130 to which an inflow pipe 125 into which a liquid flows is connected, and an outlet 140 to which an outflow pipe 135 from which a liquid flows out is connected.
  • a body 120 and a filter 105 are provided.
  • the filter 105 is fixed by a casing 120 including an upper member 110 and a lower member 115.
  • a blood sample, a hemolyzing agent, a washing solution, and other reaction solutions are introduced into the housing 120 through the inflow pipe 125, and are discharged to the outside through the filter 105 through the outflow pipe 135.
  • Such a liquid flow can be created, for example, by connecting a pump upstream of the inflow pipe 125 or downstream of the outflow pipe 135.
  • a cock may be provided upstream of the inflow pipe 125 and / or downstream of the outflow pipe 135 to control the flow of the liquid.
  • a blood sample is introduced into the cartridge 100 from the inflow tube 125, and the blood sample is filtered by the filter 105 (filtration process). Rare cells in the blood sample cannot pass through the through hole 106 of the filter 105 and remain on the surface of the filter 105. Most components in the blood sample including red blood cells pass through the through-hole 106 and are discharged out of the cartridge 100, but some red blood cells remain on the surface of the filter 105 together with rare cells.
  • the filter 105 may be cleaned by passing a cleaning solution through the filter 105.
  • a hemolytic agent is introduced into the cartridge 100, and the hemolytic agent is filtered through the filter 105 (hemolysis step).
  • the flow rate of the hemolytic agent is adjusted so that the cells on the filter 105 are in contact with the hemolytic agent for a predetermined time.
  • Red blood cells hemolyzed by the hemolytic agent pass through the through-hole 106 together with the hemolytic agent, and are discharged out of the cartridge 100.
  • the filter 105 may be cleaned by passing a cleaning solution through the filter 105.
  • the present invention provides, as one aspect thereof, a method for preparing a rare cell sample for gene analysis from a blood sample.
  • the gene of rare cells can be analyzed by a known method, for example, by the following method. First, RNA is extracted from the cells separated by the above method, isolated and purified, and then the cDNA of the desired gene is amplified by reverse transcription PCR.
  • the gene to be analyzed is not limited and may be the entire genome or a specific gene. For example, when the rare cell is CTC, the HER2 gene known to be overexpressed in cancer cells may be analyzed.
  • the expression of the target gene in rare cells can be analyzed using the results of reverse transcription PCR, and further analysis of the target gene can be performed using the amplification product.
  • the rare cell sample isolated by the method of the present invention or the rare cell sample prepared by the method of the present invention can sufficiently amplify the cDNA of the gene of the rare cell, the gene analysis as described above is efficient. Can be done automatically.
  • a CTC capturing device 60 shown in FIG. 3 is a device that captures CTC contained in a sample by filtering a sample such as a blood sample with a filter.
  • the CTC capturing device 60 includes a filter unit 1 having a cell capturing cartridge 100 shown in FIG. 2 therein, a processing liquid channel 3 for supplying a processing liquid to the filter unit 1, and a sample channel 4 for supplying a sample to the filter unit 1. Is provided.
  • a plurality of processing liquid storage containers 5 containing different processing liquids are provided on the upstream side of the processing liquid flow path 3.
  • Examples of the processing liquid that is put into the processing liquid storage container 5 include a cleaning liquid for cleaning the hemolytic agent and the rare cells captured by the filter 105.
  • a soft tube is inserted into each processing liquid storage container 5 to form individual processing liquid flow paths 6. These flow paths are connected to the selection valve 8, and the processing liquid connected to the processing liquid flow path 3 is selected by rotating the selection valve 8.
  • a reservoir 10 is connected to the sample flow path 4, and the sample is supplied to the reservoir 10.
  • the filter unit 1 is configured to supply either the processing liquid or the sample, and control of which liquid of the processing liquid and the sample is supplied is attached to each of the flow paths 3 and 4.
  • the pinch valves 12 and 13 are used for switching.
  • the treatment liquid and the sample are supplied by being sucked by a peristaltic pump 14 provided downstream of the filter unit 1.
  • the sample or the processing liquid flows through the processing liquid channel 3 or the sample channel 4 and is supplied to the filter unit 1, and then flows into the waste liquid tank 16.
  • Rare cells in the sample are captured by the filter 105 provided in the cell capturing cartridge 100 in the filter unit 1.
  • the above units are controlled by the control unit 48.
  • the selection valve 8 is controlled by the selection valve driver 49 based on an instruction from the control unit 48.
  • the pinch valves 12 and 13 are controlled by two valve drivers 50 connected to each other.
  • the driving of the peristaltic pump 14 is controlled by a pump driver 51.
  • SKBR3 HER2 positive
  • a cell line derived from human breast cancer contained in a culture flask was cultured at 37 ° C. in a carbon dioxide incubator. Trypsin-EDTA with a concentration of 0.25% was added to the culture flask, and the cultured cells attached to the flask were detached from the flask. After the detached cells were counted using a hemocytometer and a phase contrast microscope, a sample containing 100 cells was prepared. Cells were lysed by adding the sample to 0.7 mL of RNA extraction reagent and incubating for 5 minutes.
  • RNA was isolated from the cell lysate, and cDNAs of the HER2 gene and GAPDH gene were obtained from the purified RNA by reverse transcription. These cDNAs were amplified by pre-amplification, and real-time PCR was performed on the by-product to analyze the expression levels of the HER2 gene and the GAPDH gene.
  • the GAPDH gene is a housekeeping gene and was used as a reference gene for real-time PCR.
  • Reference Example 2 Samples were prepared by adding 100 cultured cells of Reference Example 1 to 1 mL of healthy human blood collected in a “BD Vacutainer (registered trademark) blood collection tube” containing CTAD solvent from Becton Dickinson and Company (BD) did. The expression levels of the HER2 gene and GAPDH gene were analyzed by the same method as in Reference Example 1.
  • Comparative Example 1 To a sample prepared by the same method as in Reference Example 2, 10 mL of a hemolytic agent having a formaldehyde concentration of 1% was added and incubated for 10 minutes. Thereafter, this was centrifuged at 400 g for 3 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was suspended in a PBS solution containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (hereinafter referred to as “washing solution”). In the same manner as in Reference Example 1, RNA was isolated from the suspension, and the expression levels of the HER2 gene and GAPDH gene were analyzed.
  • the washing liquid was sent to the cell capture cartridge 100 to wash the filter 105.
  • the cell capture cartridge 100 was removed from the filter unit 1, and 0.7 mL of RNA extraction reagent was introduced into the cell capture cartridge 100 and incubated for 5 minutes to lyse the cells.
  • the cell lysate was collected, RNA was isolated by the same method as in Reference Example 1, and the expression levels of the HER2 gene and GAPDH gene were analyzed.
  • Example 1 Samples were prepared and analyzed for the expression levels of the HER2 gene and the GAPDH gene by the same method as in Comparative Example 2 except that a hemolytic agent having a cyclic amine pyrrolidine concentration of 2% by mass was used. .
  • Ct (Threshold Cycle) in Table 1 indicates the number of cycles of real-time PCR required until a signal having a constant intensity is detected.
  • Ct equivalent to Ct of the positive control (Reference Example 1) was obtained, and thus it was found that the cDNA of the HER2 gene was normally amplified.
  • Ct of Comparative Example 1 in which the sample was not filtered with a filter is equivalent to Ct of the negative control (Reference Example 2), so that it can be seen that the HER2 gene cDNA was not significantly amplified.

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Abstract

本発明の、血液試料中の希少細胞を分離する方法は、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、フィルター上に捕捉された細胞に溶血剤を接触させる工程と、を備え、溶血剤は、塩化アンモニウム又はサイクリックアミンを含む。かかる発明により分離された希少細胞であれば、効率的に遺伝子解析を行うことができる。

Description

血液試料中の希少細胞を分離する方法及び該細胞の遺伝子を解析する方法
　本発明は、血液試料中の希少細胞を分離する方法及び該細胞の遺伝子を解析する方法に関する。
　血液中には、赤血球、白血球、及び血小板とともに、これら血球細胞以外の細胞が僅かに含まれている場合がある。例えば、癌患者の血液中には、血中循環癌細（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ、ＣＴＣ）と呼ばれる癌細胞が存在する場合がある。原発巣の癌細胞は、ＣＴＣとして血液又はリンパ液の流れに乗って体内を循環し、他の臓器組織に転移する。したがって、血液試料中のＣＴＣを検出することで、癌の転移を早期に発見することができる。また、末梢血液中には循環内皮細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ、ＣＥＣ）が存在する。ＣＥＣは、代謝により血管壁から剥がれ落ちた内皮細胞（成熟細胞）であり、ＣＥＣの数は、循環器疾患、感染症、免疫疾患、癌など、多くの疾患によって増加することが知られている。以上のように、疾患に関する多くの情報が希少細胞から得られるため、これら希少細胞を分離及び解析する技術が求められている。
　血液中の希少細胞を分離する方法として、フィルターを用いて、細胞のサイズ及び変形能の違いにより希少細胞を分離する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法では、血液試料をフィルターでろ過する。ろ過により、希少細胞はフィルター上に捕捉される一方で、血球細胞はフィルターの孔を通過し、ろ液とともに除去される。
国際公開第２０１５／０１２３１５号
　一般に、細胞の遺伝子解析は、細胞からＲＮＡを抽出し、これを逆転写、次いで増幅する（逆転写ＰＣＲ）ことにより行うことができる。しかしながら、特許文献１に記載されるフィルターを用いた方法により血液試料から分離した希少細胞では、分離されずに残った夾雑物に由来する多数のＲＮＡ若しくはその転写産物に、解析対象の遺伝子に由来するＲＮＡ若しくはその転写産物が埋没してしまうことにより、又は、夾雑物中の遺伝子増幅を妨げる成分の存在により、転写産物が十分に増幅せず、よって、遺伝子解析を行うことができないか、できても効率が悪い場合があった。そこで、本発明は、希少細胞の効率的な遺伝子解析が可能となるように、血液試料から希少細胞を分離すること、及び、分離した希少細胞の遺伝子を解析することを目的とする。
　本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、特許文献１の方法では、本来は除去されているべき赤血球が希少細胞とともにフィルター上に残存しており、この赤血球の存在が、逆転写ＰＣＲにおける転写産物の増幅を妨げていることを突き止めた。血液中の赤血球の数は希少細胞の数に比べて格段に多いため、特許文献１に記載されるような方法では、フィルター上に赤血球が残存しやすいことが原因であると、本発明者らは推測した。
　本発明に係る血液試料中の希少細胞を分離する方法は、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、フィルター上に捕捉された細胞に溶血剤を接触させる工程と、を備え、溶血剤は、塩化アンモニウム又はサイクリックアミンを含む。また、本発明に係る血液試料中の希少細胞の遺伝子を解析する方法は、上記方法により分離された希少細胞の遺伝子を解析する工程を含む。希少細胞は血中循環癌細胞であってよい。
　本発明の方法によれば、特定の溶血剤を使用して希少細胞と赤血球とを分離するため、希少細胞の効率的な遺伝子解析が可能となるように、血液試料から希少細胞を分離することができる。
細胞捕捉カートリッジの一実施形態を示す斜視図である。 図１におけるＩＩ－ＩＩ線断面図である。 ＣＴＣ捕捉装置の構成を示す模式図である。
　本発明の、血液試料中の希少細胞を分離する方法は、血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程（ろ過工程）と、フィルター上に捕捉された細胞に溶血剤を接触させる工程（溶血工程）と、を備える。
　血液試料としては、被験者から採取した血液をそのまま使用してもよいし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液又はその他適当な媒体で希釈された血液を使用してもよい。血液試料には、本発明の効果を損なわない範囲で、ＣＴＡＤ（クエン酸、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール）など、血液試料に通常添加される添加剤が添加されていてもよい。一方、血液試料には、ヘパリン等、遺伝子解析を妨げる作用を有する添加剤は添加しないことが好ましい。
　「希少細胞」は、血液に含まれる特定の種類の細胞のことであり、通常、その細胞数が、血液中の全細胞の総数に対して極めて少ないものをいう。希少細胞は、例えば、ＣＴＣ又は癌幹細胞等の癌細胞、ＣＥＣ等の内皮細胞、造血幹細胞等の幹細胞である。
　ろ過工程では、血液試料をフィルターでろ過することにより、フィルター上に血液試料中の細胞を捕捉する。ここで、「捕捉」とは、血液試料をフィルターでろ過して、血液試料中の細胞をフィルター上に残留させることを意味する。血液試料中の細胞のうち、希少細胞はフィルター上に捕捉される一方で、血球細胞の多くは、フィルターの孔を通過し、ろ液とともに除去される。しかし、血液試料中の血球細胞の数は希少細胞の数に比べて格段に多いため、希少細胞とともに一部の血球細胞もフィルター上に残留する。
　フィルターは、血液試料中に存在する希少細胞を捕捉できるフィルターであれば特に限定されず、従来公知のフィルターを使用できる。フィルターは、例えば金属製のフィルターであってよく、希少細胞の直径に応じた孔径の貫通孔を備える。ここで、貫通孔の孔径は、貫通孔を通過できる球の直径の最大値をいう。例えば、希少細胞がＣＴＣである場合、貫通孔の孔径は、好ましくは５μｍ～１５μｍ、より好ましくは６μｍ～１２μｍ、さらに好ましくは７μｍ～１０μｍである。
　ろ過工程の後、細胞を洗浄してもよい（洗浄工程）。洗浄工程は、例えば、ＰＢＳ等の既知の緩衝液を含む洗浄液を細胞に接触させることで行う。洗浄液には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）又はＥＤＴＡ等の添加剤が含まれていてよい。洗浄は、ろ過工程の後に限らず、ろ過工程の前及び溶血工程の後にも適宜行うことができる。
　続く溶血工程では、フィルター上に捕捉された細胞に溶血剤を接触させる。これは、例えば、溶血剤を、細胞が捕捉されたフィルターでろ過することにより行うことができる。溶血剤をフィルターでろ過することにより、溶血した赤血球を含む溶血剤はフィルターの貫通孔を通って除去されるため、フィルター上に捕捉された細胞に対して、新鮮な溶血剤を連続的に接触させることができる。したがって、この方法によれば、少ない量の溶血剤で、効率良く赤血球を溶血することができる。溶血剤をろ過する際の流速は、希少細胞へのダメージを最小限に抑える観点及び赤血球を効率良く溶血する観点から、１０μＬ／分～３０００μＬ／分が好ましく、２０μＬ／分～１０００μＬ／分がより好ましく、５０μＬ／分～６００μＬ／分がさらに好ましい。
　溶血剤は、赤血球を溶血する作用を有する成分（溶血成分）として、塩化アンモニウム又はサイクリックアミンを含む。サイクリックアミンの具体例としては、ピロリジン、ヘテロサイクリックＮ－アルキルアミンオキシド、リポグラミスチンＡ等が挙げられる。溶血成分は、１種単独で使用してもよく、複数種類を併用してもよい。上記特定の溶血成分を含む溶血剤を使用することで、血液試料から分離された希少細胞の遺伝子を効率的に解析することが可能となる。
　赤血球を効率的に溶血する観点から、溶血剤中の上記溶血成分の濃度は、例えば、溶血剤全量基準で０．１質量％～１０質量％、０．５質量％～５質量％、又は０．８質量％～３質量％であってよい。溶血剤には、上記溶血成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、塩酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムなど溶血剤に通常添加される成分を添加してもよい。
　なお、フィルター上に捕捉された細胞に対して固定剤を使用して、固定処理を行うことは好ましくない。
　上記の方法により血液試料中の希少細胞を分離するときは、例えば、図１及び図２に示すカートリッジを用いることができる。以下、本発明の一実施形態であって、カートリッジを使用して血液試料中の希少細胞を分離する方法について述べる。
　図１及び図２に示す細胞捕捉カートリッジ（カートリッジ）１００は、液体が流入する流入管１２５が接続された流入口１３０と、液体が流出する流出管１３５が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、フィルター１０５とを備える。フィルター１０５は、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される筐体１２０により固定されている。血液試料、溶血剤、洗浄液及びその他の反応液は、流入管１２５を通って筐体１２０の内部に導入され、フィルター１０５を通って、流出管１３５から外部に排出される。このような液体の流れは、例えば、流入管１２５の上流又は流出管１３５の下流にポンプを接続することにより作り出すことができる。また、流入管１２５の上流及び／又は流出管１３５の下流にコックを設け、液体の流れを制御してもよい。
　まず、血液試料を流入管１２５からカートリッジ１００内に導入して、血液試料をフィルター１０５でろ過する（ろ過工程）。血液試料中の希少細胞はフィルター１０５の貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に残留する。赤血球を含む血液試料中のほとんどの成分は、貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出されるが、一部の赤血球は希少細胞とともにフィルター１０５表面に残留する。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい。
　フィルター１０５上に細胞が捕捉された後、溶血剤をカートリッジ１００内に導入して、溶血剤をフィルター１０５でろ過する（溶血工程）。このとき、フィルター１０５上の細胞が溶血剤と所定時間接触するように、溶血剤の流速を調節する。溶血剤により溶血した赤血球は、溶血剤とともに貫通孔１０６を通過し、カートリッジ１００の外へと排出される。次いで、洗浄液をフィルター１０５に通液してフィルター１０５を洗浄してもよい。以上の工程により、フィルター１０５表面に残留する赤血球の数を最小限に抑えて、希少細胞を分離することができる。
　上記方法により分離した希少細胞に対して、その後種々の解析を行うことができる。解析の種類を限定するわけではないが、上記の方法により分離した希少細胞は、希少細胞の遺伝子を解析する場合に特に有用である。すなわち、本発明は、その一側面として、血液試料から遺伝子解析用の希少細胞試料を調製する方法を提供するものであるともいえる。
　希少細胞の遺伝子は、公知の方法により解析をすることができ、例えば、次のような方法により解析することができる。まず、上記の方法により分離した細胞からＲＮＡを抽出し、これを単離及び精製した後、逆転写ＰＣＲにより所望の遺伝子のｃＤＮＡを増幅する。解析対象の遺伝子は限定されず、全ゲノムであってもよいし、特定の遺伝子であってもよい。例えば、希少細胞がＣＴＣである場合、癌細胞において過剰に発現することが知られているＨＥＲ２遺伝子を解析対象としてもよい。逆転写ＰＣＲの結果を利用して希少細胞における対象遺伝子の発現を解析することもできるし、増幅産物を利用して対象遺伝子のさらなる解析を行うこともできる。
　本発明の方法により分離された希少細胞又は本発明の方法により調製された希少細胞試料であれば、希少細胞の遺伝子のｃＤＮＡを十分に増幅することができるため、上記のような遺伝子解析を効率的に行うことが可能である。
（ＣＴＣ捕捉装置）
　以下、実施例で使用するＣＴＣ捕捉装置について、図２及び図３を参照しながら説明する。図３に示すＣＴＣ捕捉装置６０は、血液試料等のサンプルをフィルターによってろ過することで、サンプル中に含まれるＣＴＣを捕捉する装置である。
　ＣＴＣ捕捉装置６０には、図２に示す細胞捕捉カートリッジ１００を内部に備えるフィルターユニット１、フィルターユニット１に処理液を供給する処理液流路３、フィルターユニット１にサンプルを供給するサンプル流路４が設けられている。
　処理液流路３の上流側には、それぞれ異なる処理液が入った複数の処理液収納容器５が設けられている。処理液収納容器５に投入される処理液としては、例えば、溶血剤及びフィルター１０５に捕捉された希少細胞等を洗浄するための洗浄液が挙げられる。各処理液収納容器５にはそれぞれ軟質チューブが挿入されて個別の処理液流路６を形成している。これらの流路は選択バルブ８に接続されており、選択バルブ８を回転させることにより処理液流路３に接続する処理液が選択される。
　サンプル流路４には、リザーバー１０が接続されており、サンプルはこのリザーバー１０に供給される。フィルターユニット１には、処理液及びサンプルのいずれか一方を供給する構成となっており、処理液及びサンプルのうちいずれの液体を供給するかの制御は流路３，４のそれぞれに取り付けられたピンチバルブ１２，１３よって切り替える。
　処理液及びサンプルの供給は、フィルターユニット１の下流に設けられたペリスタルティックポンプ１４によって吸引することで行われる。サンプル又は処理液は、処理液流路３又はサンプル流路４の内部を流れてフィルターユニット１に供給され、その後廃液タンク１６に流れ込む。サンプル中の希少細胞は、フィルターユニット１内の細胞捕捉カートリッジ１００が備えるフィルター１０５に捕捉される。
　上記の各部は制御部４８により制御される。具体的には、選択バルブ８の制御は、制御部４８からの指示に基づいて選択バルブドライバ４９により行われる。ピンチバルブ１２，１３は、それぞれに接続された２つのバルブドライバ５０により制御される。ペリスタルティックポンプ１４の駆動は、ポンプドライバ５１により制御される。
（参考例１）
　培養フラスコに入ったヒト乳癌由来の細胞株であるＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性）を、二酸化炭素インキュベーター内で３７℃で培養した。培養フラスコに、濃度０．２５％のトリプシン－ＥＤＴＡを添加し、フラスコに張り付いた培養細胞をフラスコから剥離した。剥離した細胞を血球計算盤及び位相差顕微鏡を用いて計数した後、１００個の細胞を含むサンプルを調製した。０．７ｍＬのＲＮＡ抽出試薬にサンプルを添加し、５分間インキュベーションすることにより細胞を溶解した。細胞溶解液からＲＮＡを単離し、精製したＲＮＡから逆転写反応によりＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮＡをプレアンプリフィケーションにより増幅し、増副産物に対してリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を解析した。ＧＡＰＤＨ遺伝子はハウスキーピング遺伝子であり、リアルタイムＰＣＲのリファレンス遺伝子として使用した。
（参考例２）
　ベクトン・ディッキンソン　アンド　カンパニー社（ＢＤ社）のＣＴＡＤ溶剤入り「ＢＤバキュテイナ（登録商標）採血管」に採血した健常者の血液１ｍＬに、参考例１の培養細胞１００個を添加することによりサンプルを調製した。参考例１と同様の手法により、ＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を解析した。
（比較例１）
　参考例２と同様の手法により調製したサンプルに、ホルムアルデヒドの濃度が１％の溶血剤１０ｍＬを添加し、１０分間インキュベーションした。その後、これを４００ｇにて３分間遠心し、上清を除去して、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有したＰＢＳ溶液（以下、「洗浄液」という。）でペレットを懸濁した。参考例１と同様の手法により、懸濁液からＲＮＡを単離し、ＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を解析した。
（比較例２）
　参考例２と同様の手法により調製したサンプルから、ＣＴＣ捕捉装置６０を用いて、希少細胞を以下のように分離した。まず、リザーバー１０に洗浄液を入れ、フィルターユニット１内の細胞捕捉カートリッジ１００を洗浄液で満たした。続いて、サンプルをリザーバー１０に導入し、流速６００μＬ／分で細胞捕捉カートリッジ１００に送液することにより、サンプルをろ過した。処理液収納容器５から洗浄液２ｍＬを送液してフィルター１０５を洗浄した。その後、ホルムアルデヒドの濃度が１％の溶血剤を細胞捕捉カートリッジ１００に送液し、細胞が捕捉されたフィルター１０５を１０分間浸漬した。次いで、洗浄液を細胞捕捉カートリッジ１００に送液してフィルター１０５を洗浄した。細胞捕捉カートリッジ１００をフィルターユニット１から取り外し、細胞捕捉カートリッジ１００内に０．７ｍＬのＲＮＡ抽出試薬を導入して５分間インキュベーションすることにより細胞を溶解した。細胞溶解液を回収し、参考例１と同様の手法により、ＲＮＡを単離し、ＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を解析した。
（実施例１）
　溶血剤として、サイクリックアミンであるピロリジンの濃度が２質量％の溶血剤を使用した以外は比較例２と同様の手法により、サンプルを調製して、ＨＥＲ２遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量を解析した。
　結果を表１に示す。表１におけるＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ）は、一定の強度のシグナルが検出されるまでに要したリアルタイムＰＣＲのサイクル数を示す。サイクリックアミンを含有する溶血剤を使用した実施例１においては、ポジティブコントロール（参考例１）のＣｔと同等のＣｔが得られたことから、ＨＥＲ２遺伝子のｃＤＮＡが正常に増幅されたことが分かる。これに対し、サンプルをフィルターでろ過しなかった比較例１のＣｔは、ネガティブコントロール（参考例２）のＣｔと同等であることから、ＨＥＲ２遺伝子のｃＤＮＡが有意に増幅しなかったことが分かる。また、ホルムアルデヒドを含有する溶血剤を使用した比較例２のＣｔは、参考例１のＣｔよりも大幅に大きいことから、ＨＥＲ２遺伝子のｃＤＮＡの増幅が妨げられたことが分かる。比較例２のように転写産物の増幅が遅いと、効率的に遺伝子解析をすることは難しい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
１…フィルターユニット、３、６…処理液流路、４…サンプル流路、５…処理液収納容器、８…選択バルブ、１０…リザーバー、１２，１３…ピンチバルブ、１４…ペリスタルティックポンプ、１６…廃液タンク、４８…制御部、４９…選択バルブドライバ、５０…バルブドライバ、５１…ポンプドライバ、６０…ＣＴＣ捕捉装置、１００…細胞捕捉カートリッジ、１０５…フィルター、１０６…貫通孔、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体、１２５…流入管、１３０…流入口、１３５…流出管、１４０…流出口。

Claims (3)

  1. 　血液試料中の希少細胞を分離する方法であって、
    　血液試料をフィルターでろ過してフィルター上に細胞を捕捉する工程と、
    　フィルター上に捕捉された細胞に溶血剤を接触させる工程と、を備え、
    　溶血剤は、塩化アンモニウム又はサイクリックアミンを含む、
    方法。
  2. 　請求項１に記載の方法により分離された希少細胞の遺伝子を解析する工程を含む、
    血液試料中の希少細胞の遺伝子を解析する方法。
  3. 　希少細胞が血中循環癌細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
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