BR102018015288A2 - Método para comprovar uma ativação de basófilos - Google Patents

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Abstract

método para comprovar uma ativação de basófilos. a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de uma alergia, que compreende as etapas contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa na presença do sangue inteiro com uma proporção volumétrica do sangue inteiro na solução aquosa de pelo menos 20 % em volume, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio, enriquecimento dos basófilos de a) e comprovação dos basófilos ativados, sendo que a comprovação é obtida pelo fato de que a expressão de um marcador característico para basófilos ativados é comprovada por meio de quimioluminescência; e um kit, que compreende um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio, sendo que no caso do recipiente trata-se preferivelmente de uma placa de microtitulação, opcionalmente um alergênio, um agente para a detecção de um marcador característico para os basófilos ativados, quimioluminescência, sendo que no caso do ligante trata-se preferivelmente de um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo e opcionalmente um agente para lisar e/ou remover eritrócitos.

Description

MÉTODO PARA COMPROVAR UMA ATIVAÇÃO DE BASÓFILOS
[0001] A presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de uma alergia, que compreende as etapas contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa na presença do sangue inteiro com uma proporção volumétrica do sangue inteiro na solução aquosa de pelo menos 20 % em volume, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio, enriquecimento dos basófilos de a) e comprovação dos basófilos ativados, sendo que a comprovação é obtida pelo fato de que um marcador característico para basófilos ativados é comprovado por meio de quimioluminescência; e um kit, que compreende um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio, sendo que no caso do recipiente trata-se preferivelmente de uma placa de microtitulação, opcionalmente um alergênio, um agente para a detecção de um marcador característico para os basófilos ativados por meio de quimioluminescência, sendo que preferivelmente trata-se de um ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência contra o marcador e o ligante de modo ainda mais preferido, é um anticorpo monoclonal, opcionalmente um agente para interromper a ativação dos basófilos, um ligante opcionalmente imobilizável, que se liga a um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos independente de seu estado de ativação, sendo que no caso do ligante trata-se preferivelmente de um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo e opcionalmente um agente para lisar e/ou remover eritrócitos.
[0002] Para o diagnóstico de alergias do tipo imediato, designadas também como alergias do tipo I, que se baseiam em uma resposta imunológica intermediada pela IgE, depois de uma anamnese detalhada, são realizados principalmente testes cutâneos, tais como testes Skin-Prick (testes alérgicos cutâneos) ou testes de provocação, que são para o diagnóstico de alergia do padrão ouro. Como complementação são usados testes in vitro, com os quais é comprovada a presença de anticorpos IgE específicos contra um ou mais de um alergênio definido.
[0003] Para uma tal comprovação, os alergênios são ligados a matrizes, tais como esponjinhas, membranas ou grânulos e contatadas com soros de pacientes. Em seguida, a quantidade de IgE ligado é determinada com auxílio de um anticorpo IgE anti-humano marcado.
[0004] As vantagens da determinação específica de IgE in vitro compreendem sua fácil viabilidade, capacidade de padronização e capacidade de aumento de escala. Todavia, frequentemente não se pode distinguir entre uma alergia clinicamente relevante e uma grave sensibilização.
[0005] Outras desvantagens são a baixa disponibilidade de alguns antígenos e uma possível alteração da conformação do alergênio através de seu acoplamento a uma matriz, o que pode alterar a afinidade para o anticorpo IgE a ser comprovado. Em muitos casos, os extratos de alergênios só podem ser padronizados com dificuldades ou não ser padronizados. Alergênios menores, além disso, devem ser ligados a moléculas veículo, tais como, por exemplo, albumina do soro. Além disso, a especificidade para alergênios de anticorpos IgE em anticorpos IgE ligados no soro e membrana não precisa coincidir com células efetoras, tais como basófilos e mastócitos, visto que se realiza apenas uma troca lenta de IgE ligado e dissolvido. Finalmente, certos fatores adicionais, que não podem ser exibidos em um teste in vitro para comprovar anticorpos IgE específicos, determinam se uma reação alérgica celular é realmente desencadeada, por exemplo, a relação total de IgE total para IgE específico no sangue ou a afinidade dos anticorpos.
[0006] Especialmente, quando os testes com IgE e cutâneos fornecem resultados inconclusivos, é recomendável, por conseguinte, aplicar um sistema de teste celular como complementação, tal como os testes de desgranulação de basófilos ou o teste de ativação de basófilos (BAT). Geralmente, o termo “BAT” é usado com referência aos testes de citometria de fluxo.
[0007] A vantagem particular dos testes celulares em relação à determinação específica do anticorpo IgE, que determina apenas a proporção de IgE dissolvido, biologicamente não ativo no soro, consiste em que esses abrangem a reação biológica celular real, que é provocada através da ligação do alergênio ao anticorpo IgE ligado ao receptor na superfície celular dos basófilos e sua reticulação transversal. Os testes celulares permitem, além disso, determinar o limiar da capacidade de desgranulação. Para esse fim, há, em particular, a necessidade de uma imunoterapia para monitorar o êxito da terapia do paciente.
[0008] Basicamente, os testes celulares são realizados de tal maneira, que inicialmente o sangue do paciente é posto em contato com um alergênio. Caso o paciente já tenha sido previamente sensibilizado, então ocorre a ligação do alergênio a anticorpos IgE específico do alergênio ligados ao receptor, que estão localizados na superfície celular dos basófilos. Isso leva a uma reticulação cruzada dos receptores de IgE que, por sua vez, provoca uma desgranulação dos basófilos granulócitos e, assim, a liberação de mediadores dos grânulos intercelulares. Esses mediadores, por exemplo, a histamina, leucotrienos e triptase, podem ser quantificados com auxílio de imunoensaios enzimáticos no sobrenadante. A distribuição de mediadores é realizada com uma concentração aumentada na superfície celular de marcadores, tais como CD63 ou CD203c, que anteriormente estavam localizados nas membranas dos grânulos intracelulares e, dessa maneira, mostram igualmente uma reação celular. A distribuição dos mediadores mostra, assim, uma reação celular no alergênio.
[0009] Essa maior concentração de superfície é comprovada até agora no diagnóstico de rotina usando citometria de fluxo com auxílio de anticorpos contra os marcadores de superfície celular específicos para ativação, que são acoplados a um fluoróforo. As células a serem examinadas fluem, neste caso, de forma isolada sucessivamente em um jato de líquido através de uma câmara de medição fina e passam por vários raios laser de diferentes comprimentos de onda, sendo que para cada tipo de célula é produzida uma luz difusa característica e, ao mesmo tempo, dependendo do respectivo comprimento de onda, os fluoróforos acoplados aos anticorpos são estimulados, desde que haja células ativadas. A luz emitida pelo fluoróforo estimulado e a luz difusa são registradas por detectores.
[0010] As vantagens desse sistema de teste são os altos custos de aquisição para um citômetro de fluxo, a complexidade dos resultados dos testes, que podem ser interpretados apenas por funcionários especialmente treinados, bem como a difícil capacidade de padronização. Além disso, com um aparelho pode ser medida apenas sempre uma amostra ao mesmo tempo.
[0011] Um outro problema na base da invenção refere-se à qualidade de amostras, que compreendem basófilos ativáveis. A qualidade das amostras e, assim, sua aptidão para métodos diagnósticos, depende se a obtenção, transporte e armazenamento são realizados habilmente. Por exemplo, uma exposição das amostras em relação ao calor ou tampões inadequados pode levar à morte das células.
[0012] Caso a qualidade seja insuficiente, então podem ocorrer resultados falso-negativos, isto é, um resultado negativo não é condicionado pelo fato de que o paciente não é alérgico, mas sim, pelo fato, de que a amostra dele é de qualidade insuficiente, mais precisamente que essa não contém ou contém muito poucos basófilos ativáveis.
[0013] É particularmente ineficaz, se a qualidade deficiente de uma amostra é verificada somente na execução de um método caro, tal como a citometria de fluxo.
[0014] Por conseguinte, há a necessidade de um método e para esse fim, útil, para determinar a qualidade de uma amostra de forma eficiente, isto é, em um método adequado para o alto rendimento. Um tal método, na verdade, não é realizado com um alergênio e, por conseguinte, não fornece qualquer resultado diagnosticamente útil, mas permite a previsão, se a qualidade da amostra é adequada para um método diagnóstico realizado em um preparado separado. Esse método pode ser realizado antes, depois ou paralelamente ao método diagnóstico. Esse método ou os reagentes usados neste caso podem servir para determinar o número ou a proporção dos basófilos ativáveis em uma preparação celular, preferivelmente em uma amostra.
[0015] O documento DE10235310 publica um teste, no qual a ativação de basófilos é comprovada com auxílio de um corante de cálcio fluorescente. Através de uma centrifugação por gradiente de densidade é usado sangue fracionado.
[0016] Os documentos WO2012/044756, US2009/0246805, WO98/32014 e EP2037269 publicam testes de citometria de fluxo para comprovar a ativação de basófilos.
[0017] Nesse contexto, um objeto que serve de base à presente invenção, consiste em fornecer um método e reagentes adequados para esse fim, com o qual ou com os quais as desvantagens acima mencionadas do método descrito no estado da técnica podem ser superadas, em particular, um teste de ativação de basófilos, que pode ser realizado com um outro sistema além da citometria de fluxo.
[0018] Em particular, um objeto consiste em criar um sistema, que permita o processamento simultâneo de um grande número de amostras em um método de alto rendimento. Além disso, a capacidade de reprodução e a capacidade de padronização devem ser asseguradas.
[0019] Esse e outros objetos são resolvidos pelo objetivo da presente invenção, em particular, pelo objetivo das reivindicações independentes anexas, sendo que as formas de concretização preferidas resultam das reivindicações dependentes.
[0020] Em um primeiro aspecto, o problema que serve de base à invenção é resolvido por um método para o diagnóstico de uma alergia, preferivelmente um método adequado para o alto rendimento, que compreende as etapas:
[0021] a) contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa na presença do sangue inteiro com uma proporção volumétrica do sangue inteiro na solução aquosa de pelo menos 20% em volume, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio,
[0022] b) enriquecimento dos basófilos de a) e
[0023] c) comprovação dos basófilos ativados,
[0024] sendo que a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador característico para basófilos ativados é detectado por meio de quimioluminescência.
[0025] Alternativamente, o problema em um primeiro aspecto é resolvido por um método para o diagnóstico de uma alergia, que compreende as etapas:
[0026] a) contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa na presença do sangue inteiro com uma proporção volumétrica do sangue inteiro na solução aquosa de pelo menos 20% em volume, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio,
[0027] b) enriquecimento dos basófilos de a) e
[0028] c) comprovação de basófilos ativados,
[0029] sendo que a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador localizado na superfície de basófilos é detectado por meio de quimioluminescência,
[0030] sendo que na etapa b) os basófilos são enriquecidos pelo fato de que esses se ligam a um ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que é um marcador característico para basófilos ativados
[0031] e/ou a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador característico para basófilos ativados é detectado por meio de quimioluminescência.
[0032] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do sangue inteiro, de um sangue inteiro não processado.
[0033] Em uma outra forma de concretização preferida, a etapa a) é realizada em uma solução aquosa com uma proporção de sangue inteiro de pelo menos 30, preferivelmente 35, de modo ainda mais preferido 40, de modo ainda mais preferido 45% em volume.
[0034] Em uma outra forma de concretização preferida, o método compreende a etapa interromper a ativação de basófilos, preferivelmente antes da etapa b).
[0035] Em uma outra forma de concretização, os basófilos na etapa b) são enriquecidos pelo fato de que esses se ligam a um ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos está localizado na superfície celular. No caso desse polipeptídeo pode se tratar de um polipeptídeo que, independentemente de seu estado de ativação, está localizado na superfície celular dos basófilos e/ou de um marcador característico para basófilos ativados, preferivelmente um outro marcador característico para basófilos ativados, que se distingue do marcador que, de acordo com a invenção, é detectado por meio de quimioluminescência. Em uma forma de concretização particularmente preferida, trata-se de um polipeptídeo que, independentemente do estado de ativação dos basófilos, está localizado em sua superfície celular.
[0036] Em uma outra forma de concretização o ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo que nos basófilos, independentemente de seu estado de ativação, está localizado em sua superfície celular, é um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo.
[0037] Em uma forma de concretização preferida, os basófilos na etapa b) são imobilizados.
[0038] Em uma forma de concretização preferida, os basófilos na etapa b) são imobilizados em um grânulo, preferivelmente em um grânulo magnético.
[0039] Em uma forma de concretização preferida, os basófilos são lavados depois da imobilização.
[0040] Em uma forma de concretização preferida, os eritrócitos na etapa b) são lisados e removidos.
[0041] Em uma forma de concretização preferida, os eritrócitos são removidos através de centrifugação antes da imobilização dos basófilos.
[0042] Em uma forma de concretização preferida, a comprovação na etapa c) é realizada com auxílio de um ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência contra o marcador localizado na superfície de basófilos, preferivelmente um marcador, que é característico para os basófilos ativados.
[0043] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência, de um anticorpo monoclonal, que apresenta por si só uma marcação capaz de quimioluminescência ou que se liga a um anticorpo secundário com uma marcação capaz de quimioluminescência.
[0044] Em uma forma de concretização preferida, as etapas a), b) e c) são executadas em uma placa de microtitulação.
[0045] Em uma forma de concretização preferida, a etapa a) é realizada antes das etapas b) e c).
[0046] Em um outro aspecto, o objeto que serve de base à invenção é resolvido por um kit, que compreende um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio, sendo que no caso do recipiente trata-se preferivelmente de uma placa de microtitulação, opcionalmente de um alergênio, um agente para a detecção de um marcador característico para os basófilos ativados por meio de quimioluminescência, sendo que se trata preferivelmente de um ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência contra o marcador e o ligante ainda é preferivelmente um anticorpo monoclonal, opcionalmente um agente para interromper a ativação dos basófilos, um ligante opcionalmente imobilizável, que se liga a um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos, independentemente de seu estado de ativação, sendo que no caso do ligante trata-se preferivelmente de um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo e opcionalmente um agente para lisar e/ou remover eritrócitos.
[0047] Alternativamente, o problema é resolvido em um outro aspecto por um kit, que compreende um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio, sendo que no caso do recipiente trata-se preferivelmente de uma placa de microtitulação, opcionalmente um alergênio, um ligante contra um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos para o enriquecimento de basófilos e com um ligante contra um marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção, sendo que o ligante contra o marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção, apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência, sendo que no caso da marcação capaz de quimioluminescência pode tratar-se de uma enzima, que catalisa uma reação de quimioluminescência ou de uma molécula, que mesmo em condições adequadas, produz um sinal de quimioluminescência, sendo que a enzima, no primeiro caso, está contida no kit em combinação com uma solução de substrato capaz de quimioluminescência e sendo que o polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos e/ou o marcador localizado na superfície de basófilos é característico para basófilos ativados. Opcionalmente, o kit compreende um agente para lisar e/ou remover eritrócitos.
[0048] Os reagentes contidos em um kit de acordo com a invenção também podem ser utilizados com um ou sem um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio para produzir um kit para o diagnóstico de uma alergia.
[0049] O problema é resolvido em um outro aspecto através da utilização de um ligante contra um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos para o enriquecimento de basófilos juntamente com um ligante contra um marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção para o diagnóstico de uma alergia ou para a produção de um kit para o diagnóstico de uma alergia ou para a seleção de substâncias ativas candidatas para a terapia de uma alergia contra um alergênio, sendo que o ligante contra o marcador para a detecção localizado na superfície de basófilos apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência, sendo que no caso da marcação capaz de quimioluminescência pode tratar-se de uma enzima, que catalisa uma reação de quimioluminescência, sendo que a enzima, no primeiro caso, é utilizada em combinação com uma solução de substrato capaz de quimioluminescência e sendo que o polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos e/ou o marcador localizado na superfície de basófilos é característico para basófilos ativados.
[0050] O problema é resolvido em um outro aspecto através da utilização de um ligante contra um ligante característico para basófilos ativados para o diagnóstico de uma alergia ou para a produção de um kit para o diagnóstico de uma alergia ou para a seleção de substâncias ativas candidatas para a terapia de uma alergia contra um alergênio, sendo que o ligante apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência.
[0051] Em uma forma de concretização preferida, a utilização para aumentar a sensibilidade é preferivelmente em um método de alto rendimento.
[0052] A presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de uma alergia, que compreende inicialmente a etapa a) contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa. No caso da amostra de sangue inteiro, trata-se preferivelmente de sangue inteiro com substâncias de efeito anticoagulante. O sangue inteiro é acrescentado à solução aquosa antes do próprio contato dos basófilos com o alergênio em uma quantidade, para que a proporção volumétrica final da solução aquosa seja de pelo menos 20, mais preferivelmente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 80% em volume. A presença do sangue inteiro leva a que o contato dos basófilos com o alergênio decorra em condições quase fisiológicas.
[0053] No caso do método, trata-se preferivelmente de um método adequado para o alto rendimento. Por esse, entende-se em uma forma de concretização preferida, um método, que permite o processamento paralelo de um grande número de amostras, por exemplo, pelo menos 2, 4, 8, 16 ou 32 amostras, sendo que as etapas do método, que exigem pelo menos 50, mais preferivelmente 60, 70, 80 ou 90% do tempo de processamento para uma única amostra, podem ser realizadas essencialmente ao mesmo tempo com as amostras. Métodos, nos quais o próprio procedimento de medição é, de fato, realizado sucessivamente por meio de um dispositivo de medição em todas as amostras, o processamento individual, não paralelo de uma amostra, contudo, não excede mais de 5, mais preferivelmente 4, 3, 2, 1 minutos ou 30 segundos, é incluído. Métodos adequados para o alto rendimento compreendem, por exemplo, a medição de quimioluminescência em placas de microtitulação adequadas para esse fim. Ao contrário, por exemplo, a citometria de fluxo não é um método adequado para o alto rendimento.
[0054] No caso do sangue inteiro trata-se preferivelmente de sangue inteiro não processado. Em uma forma de concretização preferida, entende-se pelo termo “sangue inteiro não processado”, tal como é utilizado aqui, que o sangue pode, de fato, ser diluído ou que se lhe acrescentam substâncias químicas para a conservação, preferivelmente substâncias de efeito anticoagulante, tal como heparina que, contudo, não é fracionado, por exemplo, através de centrifugação, tal como uma centrifugação por gradiente de densidade.
[0055] A etapa a) pode ser realizada também com mais do que um alergênio e/ou um alergênio em mais de uma concentração em diferentes preparados, que trabalham em paralelo. Em particular, o antígeno pode ser usado em duas ou mais, preferivelmente em três ou mais diferentes concentrações em um número correspondente de preparados paralelos. Preferivelmente, um controle positivo e um controle negativo são adicionalmente levados juntos. Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um material selecionado a partir do grupo, que compreende culturas de ácaros e fezes de ácaros do grupo taxonômico principal Animalia Arthropoda; caspa, cabelo, saliva, excrementos ou outras secreções, que são derivados do grupo traxonômico principal Animalia Chordata; esporos ou partículas, que são derivados do grupo taxonômico principal Funghi Ascomycetes; pólen, que é originário do grupo taxonômico principal Corniferopsida, pólen, que é originário do grupo taxonômico principal Plantae Magnoliopsidae, pólen, que é originário do grupo taxonômico principal Plantae Liliopsidae; veneno ou secreções, que são derivados do grupo taxonômico principal animalia Anrthropoda; borracha ou produtos, que compreendem uma tal borracha, que é originária de árvores do grupo taxonômico principal Plantae Magnoliopsidae.
[0056] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de uma substância farmacológica selecionada a partir do grupo, que compreende antibióticos, mais preferivelmente β-lactamas, de modo ainda mais preferido a partir do grupo, que compreende penicilina G, penicilina V, PPL, MDM, amoxicilina e ampicilina; cefalosporinas, de modo ainda mais preferido a partir do grupo, que compreende cefazolina, cefamandol, cefaclor, cefonaxim, ceftazidima, cefotaxima, ceftazidima, cefepim, carbapeneme, monobactame, inibidores da β-lactamase, de modo ainda mais preferido ácido clavulânico; macrolidas, aminoglicosídeos, rifamicinas, glicopeptídeos, polipeptídeos, tetraciclinas, imidazóis, quinolonas, pirazolonas, de modo ainda mais preferido sulfometoxazol; estreptograminas, nitrofuranos, isoniazidas, pentamidinas; antisséticos, preferivelmente clorhexidina, fungicidas, agentes antivirais, agentes antimaláricos, analgésicos, inibidores de COX-2 e medicamentos inibidores de inflamação não esteroidais, preferivelmente a partir do grupo, que compreende aspirina, lys-aspirina, luprofeno, cetoprofeno, diclofenaco, naproxeno, paracetamol, dipirona, indometacina, ácido mefenâmico, fenilbutazona e propifenazona; bloqueadores neuromusculares, preferivelmente a partir do grupo, que compreende suxametônio, atracurium, cisatracurium, mivacurium, pancurônio, rocurônio, vecurônio e succinilcolina; hipnóticos e anestésicos locais, preferivelmente a partir do grupo, que compreende midazolam, propofol, tiopental, fentanila e lidocaína; tranquilizantes; opioides; meios de contraste com rádio, preferivelmente a partir do grupo, que compreende meios de contraste com iodo iônico, agentes de contraste iodados não iônicos, azul de isossulfano, azul patente e azul de metileno; inibidores de bombas de prótons, anticonvulsivantes e neurolépticos, preferivelmente a partir do grupo, que compreende carbamazepina, fenitoína e ácido valproínico; agentes antipsicóticos; antidepressivos; dopamina; antihistamínicos; corticosteroides e glicocorticoides; agentes quimioterápicos e vasodilatadores; medicamentos cardíacos, preferivelmente a partir do grupo, que compreende as estatinas, inibidores de ACE, bloqueadores do receptor alfa, bloqueadores do receptor beta, antagonistas do cálcio e anti-hipertônicos; fármacos (anti-)ulcerosos, agentes (anti-)tireoidais; estrogênios; heparinas e derivados; insulinas; estreptoquinases e uroquinases.
[0057] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um expansor coloide ou plasmático ou agente auxiliar, preferivelmente selecionado a partir do grupo, que compreende albumina, dextrano, gelatina, amido de hidroxietila (Hetastarch), pentastarch, sinistrina, polidocanol 600 (etoxiesclerol), lactose, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, protamina e aprotinina.
[0058] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um aditivo de nutrientes, preferivelmente selecionado a partir do grupo, que compreende conservantes para alimentos, corantes para alimentos, agentes de beneficiamento para nutrientes, agentes antioxidantes e emulsificantes.
[0059] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um agente ambiental ou poluente, preferivelmente selecionado a partir do grupo, que compreende isocianatos, isotiazolinonas, formaldeído, óxido de etileno, anidrido de ácido ftálico, cloramina T, DMSO, látex e enzimas, que são utilizados no processamento de assados, alimentos e na indústria de lavagem.
[0060] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um material selecionado a partir do grupo, que compreende uma cultura e/ou fezes de um ácaro, que é selecionado a partir do grupo, que consiste em ácaros do gênero Acarus, Glycyphagus, Lepidoglyphus, Tryophagus, Blomia, Dermatophagoides, Euroglyphus, Blaterra e Periplaneta; caspas, cabelo, saliva ou excrementos de um animal de um gênero selecionado a partir de Canis, Felis ou Equus; leveduras, mofo ou fungos de um gênero selecionado a partir do grupo, que consiste em Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria e Candida; pólen de um gênero selecionado a partir do grupo, que consiste em Chamaecyparis, Cryptomeria, Cupressus, Juniperus, Anthoxanthum, cynodon, dactylis, Festuca, Holcus, Hordeum, Lolium, Oryza, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum, Zea, Ambrosia, Artemisia, Alnus, Betula, Corylus, Fraxinus, Olea e Platanus; veneno de um inseto de um gênero selecionado a partir do grupo, que consiste em Apis Bombus, Dolichovespula, Polistes, Polybia, Vespa e Vespula; borracha ou produtos, que compreendem uma tal borracha, que deriva do gênero Hevea.
[0061] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um material selecionado a partir do grupo, que compreende camarão ou um alimento contendo camarão do grupo taxonômico principal Animalia Arthropoda; lagosta ou um alimento contendo lagosta do grupo taxonômico principal Animalia Arthropoda; frutas, legumes, cereais ou feijões, que derivam do grupo taxonômico principal Liliopsidae ou um produto alimentício, que compreende tais frutas, legumes, cereais e/ou feijões; frutas, legumes, cereais e/ou feijões, que derivam do grupo taxonômico principal Plantae Magnoliopsidae ou um produto alimentício, que compreende tais frutas, legumes, cereais e/ou feijões; noz ou um alimento contendo noz do grupo taxonômico principal Plantae Magnoliopsidae.
[0062] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um material selecionado a partir do grupo, que compreende leite de vaca, alimento contendo leite de vaca, clara de ovo, alimento contendo clara de ovo, peixe ou alimento contendo peixe.
[0063] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um material selecionado a partir do grupo, que compreende Hordeum, Oryza, Secale, Triticum, Zea, Arachis, Corylis, Juglans, Prunus, Anacardium, Pistacia e Glycine.
[0064] Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do alergênio, de um polipeptídeo, que compreende um antígeno ou uma variante desse a partir do grupo, que compreende Aca s 13, Gly d 2, Lep d 2, Lep d 5, L, Tyrep d 7, Lep d 10, Lep d 13, Tyr p 2, Tyr p 3, Tyr p 10, Tyr p 13, Tyr p 24, Blo t 1, Blo t 2, Blo t 3, Blo t 4, Blo t 5, Blo t 6, Blo t 10, Blo t 11, Blo t 12, Blo t 13, Blo t 19, Blo t 21, Der f 1, Der f 2, Der f 3, Der f 6, Der f 7, Der f 10, Der f 11, Der f 13, Der f 14, Der f 15, Der f 16, Der f 17, Der f 18, Der f 22, Der m 1, Der p 1, Der p 2, Der p 3, Der p 4, Der p 5, Der p 6, Der p 7, Der p 8, Der p 9, Der p 10, Der p 11, Der p 14, Der p 20, Der p 21, Der p 23, Eur m 1, Eur m 2, Eur m 3, Eur m 4, Eur m 14, Bla g 1, Bla g 2, Bla g 4, Bla g 5, Bla g 6, Bla g 7, Bla g 8, Per a 1, Per a 3, Per a 6, Per a 7, Per a 9, Per a 10, Can f 1, Can f 2, Can f 3, Can f 4, Can f 5, Can f 6, Fel d 1, Fel d 2, Fel d 3, Fel d 4, Fel d 5w, Fel d 6w, Fel d 7, Fel d 8, Equ c 1, Equ c 2, Equ c 3, Equ c 4 and Equ c 5, Cla c 9m, Cla c 14, Cla h 2, Cla h 5, Cla h 6, Cla h 7, Ca h 8, Cla h 9, Cla h 10, Cla h 12, Asp fl 13, Asp f 1, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, Asp f 5, Asp f 6, Asp f 7, Asp f 8, Asp f 9, Asp f 10, Asp f 11, Asp f 12, Asp f 13, Asp f 15, Asp f 16, Asp f 17, Asp f 18, Asp f 22, Asp f 23, Asp f 27, A5p f 28, A5p f 29, Asp f 34, Asp n 14, Asp n 18, Asp n 25, Asp o 13, Asp o 21, Pen b 13, Pen b 26, Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch 20, Pen ch 31, Pen ch 33, Pen ch 35, Pen c 3, Pen c 13, Pen c 19, Pen c 22, Pen c 24, Pen C 30, Pen c 32, Pen o 18, Fus c 1, Fus c 2, Alt a 1, Alt a 3, Alt a 4, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 12, Alt a 13, Cand a 1, Cand a 3 and Cand b 2, Cha o 1, Cha o 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1 and Jun v 3, Ant o 1, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 12, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec C 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 15, Tri a 21, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Zea m 1, Zea m 12, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 8, Amb a 9 and Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 4, Art v 5, Art v 6, Aln g 1, Aln g 4, Bet v 1, Bet v 2, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Cor a 10, Fra e 1, Ole e 1, Ole e 2, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, OIe e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Pla or 1, Pla or 2 and Pla or 3, Api c 1, Api d 1, Api m 1, Api m 2, Api m 3, Api m 4, Api m 5, Api m 6, Api m 7, Api m 8, Api m 9, Api m 10, Api m 11, Bom p 1, Bom p 4, Bom t 1, Bom t 4, Dol a 5, Dol m 1, Dol m 2, Dol m 5, Pol a 1, Pol a 2 and Pol a 5, Pol d 1, Pol d 4, Pol d 5, Pol e 1, Pol e 4 e Pol e 5, PoI f 5, Pol g 1, Pol g 5, Poly p 1, Poly s 5, Vesp c 1, Vesp c 5, Vesp ma 2, Vesp ma 5, Vesp m 1, Vesp m 5, Ves g 5, Ves m 1, Ves m 2, Ves m 5, Ves p 5, Ves s 1, Ves s 5, Ves vi 5, Ves v 1, Ves v 2, Ves v 3, Ves v 5, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b, 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 8, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13 and Hev b 14, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Ory s 12, Sec c 20, Tri a 12, Tri a 14, Tn a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 36, Zea m 14, Zea m 25, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Pru du 3, Pru du 4, Pru du 5, Pru du 6, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5 and Gly m 6.
[0065] A etapa a) pode ser realizada em um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio. Em uma forma de concretização preferida trata-se, no caso do recipiente, de uma placa de microtitulação. Em uma outra forma de concretização preferida, o alergênio ou os alergênios são previamente introduzidos no recipiente em forma liofilizada e ao adicionar uma solução aquosa e a amostra de sangue inteiro esses passam para a fase líquida.
[0066] Em uma forma de concretização preferida, o antígeno é Ara h 7 isotipo 7.0201 (documento EP17000245). Em uma outra forma de concretização preferida, o antígeno é o antígeno da noz de macadâmia descrito no documento EP 16000165.7. Também polipeptídeos modificados podem ser usados como antígeno, por exemplo, as construções de oleosina publicados no documento EP 15001277.1.
[0067] Em uma forma de concretização preferida, o método compreende a etapa interromper a ativação dos basófilos, preferivelmente antes da etapa b). O especialista conhece diversos meios para interromper a reação de ativação, por exemplo, a adição de agentes ligadores de cálcio, tal como EDTA, a adição de azida, preferivelmente azida de sódio ou o resfriamento da amostra, preferivelmente a uma temperatura de no máximo 4oC.
[0068] Preferivelmente depois da etapa a), os basófilos são enriquecidos na etapa b). Em uma forma de concretização preferida, entende-se pelo termo “enriquecer”, tal como aqui utilizado, que o número dos basófilos em relação ao número total de todas as células ou ao número de leucócitos, preferivelmente ao número de leucócitos na amostra de sangue inteiro, é aumentado, preferivelmente em torno do fator de pelo menos 2, 5, 10, 20, 50, 100 ou 1000, mais preferivelmente, pelo menos 1000. Isso ocorre preferivelmente pelo fato de que esses ligam um ligante, que se liga especificamente através de um primeiro ponto de ligação, a um polipeptídeo, que nos basófilos se expressa de forma dependente ou independente, preferivelmente independente de seu estado de ativação e está localizado em sua superfície celular, enquanto que em outras células ou pelo menos na maioria das outras células está localizado apenas em baixa proporção ou preferivelmente não está localizado ali. Esse polipeptídeo, portanto, deve ser adequado como meio de seleção, a fim de enriquecer os basófilos em relação ao número total das células em uma amostra de sangue. Neste caso é aceitável, que o enriquecimento não ocorra completamente, mas sim, que uma pequena parte das outras células permaneça na amostra, por exemplo, células dendríticas. Preferivelmente, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo de polipeptídeos localizados na superfície celular dos basófilos, independentemente do estado de ativação dos basófilos, que compreende o CD123 (código do banco de dados NM_002183), CD193 (NP_001828), Fcϵ RI (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) e CRTH2 (NM_004778) e é preferivelmente CD123 ou IgE, de modo ainda mais preferido CD123. Todos os códigos do banco de dados relacionados nesse registro referem-se à sequência acessível online através do número estabelecido pelo banco de dados no momento do dia de apresentação do registro baseado em prioridade mais antiga. O ligante é preferivelmente um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo, preferivelmente um anticorpo monoclonal contra CD123 ou IgE, de modo ainda mais preferido, contra CD123 (Agis, H., Füreder, W., Bankl, H. C., Kundi, M., Sperr, W. R., Willheim, M., ... & Valent, P. (1996). Comparative immunophenotypic analysis of human mast cells, blood basophils and monocytes. Immunology, 87(4), 535-543.; SainteLaudy, J. Sabba, A., Vallon C, Guerin JC (1998). Analysis of anti-IgE and allergen induced human basophil activation by flow cytometry. Comparison with histamine release. Inflamm Res. 47(10), 401-8.). Em uma forma de realização ainda mais preferida, neste caso, é usado um anticorpo monoclonal isolado. Em uma outra forma de concretização preferida, os basófilos se ligam a mais de um ligante, que se liga especificamente através de um primeiro ponto de ligação, a um polipeptídeo, que nos basófilos, expressa de forma dependente ou independente, preferivelmente independente de seu estado de ativação e está localizado em sua superfície celular, sendo que o polipeptídeo é preferivelmente selecionado a partir do grupo de polipeptídeos localizados na superfície celular dos basófilos, independentemente do estado de ativação, que compreende CD123 (código do banco de dados NM_002183), CD193 (NP_001828), FcϵRI (NM_002001), IgE, CD203c (NM_005021) e CRTH2 (NM_004778), mais preferivelmente dois ou três ligantes, sendo que mais preferivelmente, um dos ligantes é CD123. Um polipeptídeo, que nos basófilos expressa dependendo de seu estado de ativação e que está localizado em sua superfície celular, é preferivelmente selecionado a partir do grupo, que compreende basogranulina (Mochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgEindependent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation. J. Allergy Clin. Immunol. 2003 Jul;112(1):102-8.)], 2D7 Antigen [C L Kepley, S S Craig and L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils. J Immunol June 15, 1995, 154 (12) 6548-6555;), Avidin bindender Mediator (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidin-based probes. J Allergy Clin Immunol. 2017 ), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) e CD203c (NM_005021) e é preferivelmente CD63 (Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991). Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338).
[0069] Preferivelmente, o ligante apresenta um segundo ponto de ligação, que pode ser utilizado para imobilizá-lo em um suporte sólido, preferivelmente específico, quando o suporte apresenta uma capacidade de ligação complementar, mais exatamente, a capacidade, de se ligar especificamente ao ligante. Preferivelmente, o ligante apresenta uma molécula com uma capacidade de ligação, que é selecionada a partir do grupo, que compreende biotina, estreptavidina, His Tag, GST, avidina, neutravidina, proteína A, proteína G, proteína L, S-Tag e MBP. No caso do suporte sólido, trata-se preferivelmente de um suporte a partir do grupo, que compreende um grânulo, preferivelmente um grânulo magnético, uma placa de microtitulação, um recipiente de reação de material plástico e um recipiente de reação de vidro. Em uma forma de realização particularmente preferida trata-se, no caso do suporte, de um grânulo, preferivelmente de um grânulo magnético e a solução aquosa, que compreende o grânulo, encontra-se em uma cavidade de uma placa de microtitulação. Em uma forma de concretização preferida, a solução aquosa na etapa a) e/ou na etapa b) é misturada continuamente, por exemplo, através de agitação ou vibração.
[0070] Em um método de concretização preferido, a lise e a subsequente remoção de eritrócitos, preferivelmente na etapa b). O especialista conhece agentes para lisar eritrócitos, por exemplo, esses são descritos nos documentos US4902613, US6143567 ou WO85/05640. Por exemplo, uma lise hipotônica pode ser realizada unicamente com água ou na presença de dietilenoglicol, formaldeído e ácido cítrico (documento US4902613).
[0071] A remoção dos eritrócitos ocorre preferivelmente através de centrifugação.
[0072] A ativação de basófilos é comprovada, de acordo com a invenção, pelo fato de que a concentração superficial de um marcador característico para a ativação é detectada por meio de quimioluminescência. Preferivelmente, o marcador é selecionado a partir do grupo, que compreende basogranulina (Mochizuki A, McEuen AR, Buckley MG, Walls AF. The release of basogranulin in response to IgE-dependent and IgE-independent stimuli: validity of basogranulin measurement as an indicator of basophil activation. J. Allergy Clin. Immunol. 2003 Jul;112(1):102-8.)], 2D7 Antigen [C L Kepley, S S Craig and L B Schwartz. Identification and partial characterization of a unique marker for human basophils. J Immunol June 15, 1995, 154 (12) 6548- 6555), Avidin bindender Mediator (Joulia R, Valitutti S, Didier A, Espinosa E. Direct monitoring of basophil degranulation by using avidinbased probes. J Allergy Clin Immunol. 2017 ), CD13 (NM_001150), CD45 (NM_001150), CD63 (NP_001244318.1), CD107a (NM_00556), CD11b (NM_000632), CD62L (NM_000655), CD11c (XM_011545852), CD164 (NM_001142401), CD45 (NM_001267798) e CD203c (NM_005021) e é preferivelmente CD63 (Knol, E. F., Mul, F. P., Jansen, H., Calafat, J., & Roos, D. (1991). Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 88(3), 328-338.). Há a possibilidade de detectar mais do que um desses marcadores. Preferivelmente, para esse fim, um ligante contra um marcador característico para os basófilos ativados, preferivelmente um anticorpo monoclonal, é provido de uma marcação capaz de quimioluminescência. Em uma forma de concretização ainda mais preferida, é usado, neste caso, um anticorpo monoclonal isolado.
[0073] No caso da marcação capaz de quimioluminescência pode tratar-se de uma enzima, que catalisa uma reação de quimioluminescência ou de uma molécula, que mesmo em condições adequadas, produz um sinal de quimioluminescência, preferivelmente de uma última molécula, de modo ainda mais preferido, de um éster de acridínio ou sulfonamida de acrínio. Em uma etapa realizada antes da etapa a) um ligante contra um marcador, que é característico para os basófilos ativados, pode ser acoplado com uma marcação capaz de quimioluminescência. Por exemplo, o anticorpo monoclonal pode ser misturado com um éster de acridínio (AE). Compostos de AE são marcações altamente sensíveis, que já são usados em ensaios automatizados para o diagnóstico clínico (I Weeks, I Beheshti, F McCapra, A K Campbel, J S Woodhead. Acridinium esters and high specific activity labels in immunoassay. Clin Chem 29; 1474-1479 (1983). O acoplamento dos compostos de AE em anticorpos é bem estabelecido e na maioria das vezes é obtido através de grupos funcionais, tal como a N-hidroxissuccinimidila (NHS) no anel fenol. Para esse fim, o anticorpo adequado é reagido com AE (por exemplo, NSPSA-NHS, NSP-DMAE ou NSP-DMAE-NHS da empresa Heliosense) à temperatura ambiente durante um certo tempo. Em seguida, o anticorpo marcado é separado do AE livre não reagido através de colunas ou outros métodos de limpeza, tais como HPLC.
[0074] Em uma forma de concretização preferida, o éster de acridínio tem a fórmula:
Figure img0001
[0075] em que R1 é uma alquila, alquila substituída, arila, arila substituída e R2 e R3, independentemente uns dos outros, são selecionados a partir do grupo, que compreende hidrogênio, alquila, alquila substituída, halogênio, cianeto, hidróxi, alcóxi, tiol, alquilmercapto e em que Y é um grupo de partida, preferivelmente com pKa<12, preferivelmente selecionado a partir do grupo, que compreende arilóxi, arilóxi substituído, alcóxi substituído, mercapto, mercapto substituído, sulfonamidila, sulfonamidila substituída, Nhidroxilamida, N-hidroxilamida substituída e em que o éster de acridínio contém um grupo, através do qual esse pode ser ou é acoplado a um polipeptídeo, preferivelmente a um anticorpo, preferivelmente um grupo N-hidroxissuccinimidila (NHS). Compostos e métodos adequados são descritos no documento WO2012/028167.
[0076] Para a detecção pode ser utilizado um kit de detecção de quimioluminescência (por exemplo, empresa Invitron). Depois de lavar o anticorpo não ligado, ocorre no luminômetro sucessivamente a adição automática dos dois acionadores (100 µl cada; acionador 1: contém peróxido de hidrogênio; acionador 2: contém hidróxido de sódio). O composto de éster de acridínio é oxidado, neste caso, em condições alcalinas, o que produz acridona emissora de luz. O sinal é liberado em forma de um raio de luz (luminescência flash), que perdura tipicamente de 1 a 5 segundos. A curta duração da emissão requer a iniciação e medição da reação diretamente no detector. Luminômetros adequados permitem a adição automática do acionador e a detecção do sinal na placa de microtitulação. Para uma maior intensidade, todo o sinal é geralmente integrado através do intervalo de medição.
[0077] Uma alternativa é o acoplamento do anticorpo com uma enzima, preferivelmente selecionada a partir do grupo, que compreende peroxidase, fosfatase alcalina e β-galactosidase, que pode reagir um substrato capaz de quimioluminescência. Analytica chimica acta, 500(1): 279-286). Dependendo da enzima, é usado, neste caso, um substrato a partir do grupo das diacil-hidrazidas cíclicas, preferivelmente luminol ou isoluminol, acridina, dioxetano e seus derivados. A enzima mais frequentemente usada para esse fim é a peroxidase de raiz forte (HRP), que na presença de peróxido de hidrogênio catalisa a oxidação de luminol. A luz liberada neste caso pode ser detectada com um comprimento de onda de 425 nm. Um possível procedimento é descrito em Neupert, W., Oelkers, R., Brune, K., Geisslinger, G. A new reliable chemiluminescence immunoassay (CLIA) for prostaglandin E2 using enhanced luminol as substrate. Prostaglandins. 1996 Nov;52(5):385- 401.
[0078] Uma outra alternativa é a utilização de quimioluminescência gerada eletricamente. O tris(2,2-bipiridil)rutênio(II) já é utilizado em alguns ensaios imunológicos (Xiaoming Zhou, Debin Zhu, Yuhui Liao, Weipeng Liu, Hongxing Liu, Zhaokui Ma & Da Xing (2014). Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2- bipyridyl)ruthenium(II)-based electrochemi-luminescence probe. Nature Protocols Volume 9, Pages: 1146–1159). Depois de aplicar uma tensão, na reação do complexo de rutênio com tripropilamina (TPA) do meio envolvente, a quimioluminescência é liberada com um máximo de emissão de 620 nm. Preferivelmente no caso da marcação capaz de quimioluminescência trata-se, neste caso, de um complexo metálico capaz de quimioluminescência, compreendendo preferivelmente rutênio.
[0079] Em uma forma de concretização preferida, a marcação capaz de quimioluminescência catalisa a emissão através de um outro grupo ou ela própria emite em um máximo de emissão com um comprimento de onda de 400 nm ou mais, preferivelmente 400 nm até 650 nm, mais preferivelmente 400 nm até 550 nm, de modo ainda mais preferido 405 nm até 500 nm, de modo ainda mais preferido 405 nm até 490 nm, de modo ainda mais preferido 410 até 490 nm, de modo ainda mais preferido 410 até 450 nm, do modo mais preferido, 415 até 445 nm. Compostos e métodos adequados são descritos em Natrajan et al. (2010) Enhanced immunoassay sensitivity using chemiluminescent acridinium esters with increased light output, Analytical Biochemistry, 27 July 2010).
[0080] Preferivelmente, um grande número de reações que são realizadas paralelamente em várias cavidades em uma placa de microtitulação e os sinais de quimioluminescência são detectados com auxílio de um luminômetro de placa, tal como está disponível no mercado (por exemplo, da Berthold Technologies). A extensão da ativação dos basófilos correlaciona-se, neste caso, com a intensidade ou aumento do sinal de quimioluminescência em relação a um controle não estimulado. Para uma avaliação positiva, um valor de limiar dependente da substância de teste deve ser excedido, o qual o especialista pode estipular de forma rotineira.
[0081] Preferivelmente, o método é executado em tal ordem, que inicialmente é executada a etapa a), depois a etapa b) e finalmente a etapa c). Contudo, também é possível, realizar inicialmente a etapa b) e, em seguida, a etapa a) e depois a etapa c). Alternativamente, a etapa b) e etapa c) podem ser realizadas de forma simultânea ou por sobreposição.
[0082] Em uma forma de concretização particularmente preferida, depois da etapa a), acrescenta-se à solução aquosa com os basófilos tanto um ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos, independentemente de seu estado de ativação, está localizado em sua superfície celular, como também um ligante contra o marcador provido de uma marcação capaz de quimioluminescência, que é característico para os basófilos ativados. De modo ainda mais preferido, isso ocorre na presença de um suporte, em que o ligante se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos, independentemente de seu estado de ativação, está localizado em sua superfície celular, de modo ainda mais preferido é ou será imobilizado em um suporte sólido, tal como um grânulo. Em seguida, a solução aquosa pode ser trocada e os basófilos imobilizados podem ser lavados, sendo que os ligantes em excesso e as células não ligadas são removidos. Restam, desde que presentes, basófilos, que são imobilizados no suporte através do ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos, independentemente de seu estado de ativação, está localizado em sua superfície celular. Desses basófilos imobilizados, aqueles realmente ativados através do contato com o alergênio são caracterizados pelo fato de que nesses está ligado o ligante contra o marcador, que é característico para basófilos ativados. Desde que o último ligante por si só não seja provido de uma marcação capaz de quimioluminescência, opcionalmente depois de uma etapa de lavagem para remover os ligantes em excesso, pode ser acrescentado em uma etapa seguinte, caso necessário, um anticorpo secundário com uma marcação capaz de quimioluminescência, que se liga contra o último ligante mencionado, sendo que esse permanece ligado apenas aos basófilos ativados, não aos não ativados. Em uma etapa de lavagem adicional, o anticorpo secundário em excesso pode ser removido.
[0083] Em seguida, mede-se a quimioluminescência. Com auxílio desse método, em particular, em combinação com a remoção de eritrócitos, apesar da baixa proporção dos basófilos durante a comprovação da ativação, pode ser obtida uma sensibilidade, que é comparável com os métodos por meio de citometria de fluxo.
[0084] O método de acordo com a invenção ou o kit de acordo com a invenção ou um ou mais de um reagente, tal como pode estar contido no kit de acordo com a invenção, pode ser utilizado também para a seleção de substâncias ativas candidatas, a fim de identificar substâncias ativas terapeuticamente eficazes dentre uma seleção de substâncias ativas candidatas. Neste caso, a etapa a) é realizada depois do contato dos basófilos com uma substância ativa candidata. No caso de uma substância ativa candidata terapeuticamente eficaz, verifica-se uma ativação inferior em relação a um preparado sem substância ativa candidata ou com uma substância ativa candidata não eficaz.
[0085] Em uma forma de concretização preferida, neste caso, entende-se pelo termo “substância ativa candidata”, tal como aqui utilizado, um composto, do qual se presume ou que deve ser examinado, se esse tem um efeito terapêutico em um paciente, preferivelmente no sentido de que esse atenue ou impeça uma reação alérgica. Em uma forma de concretização preferida, uma ou mais de uma substância ativa já conhecida, que opcionalmente testa apenas um subgrupo dos pacientes que sofrem de alergia, é examinada se essa é terapeuticamente eficaz em um determinado paciente.
[0086] A invenção refere-se à utilização do ligante que apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência contra um ligante característico para basófilos ativados, para o diagnóstico de uma alergia ou para a produção de um kit para o diagnóstico de uma alergia. Do mesmo modo, para o diagnóstico de uma alergia pode ser usado o kit de acordo com a invenção. A produção pode compreender o acoplamento de uma marcação capaz de quimioluminescência ao ligante. O ligante pode ser utilizado em um kit ou em uma composição ou em outra combinação com o ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos, independentemente de seu estado de ativação, está localizado em sua superfície celular.
[0087] Um kit de acordo com a invenção pode conter um reagente, que ativa basófilos independentemente da presença de um alergênio. Tais reagentes são descritos no estado da técnica e compreendem, mas não são limitados, às formil-metionil-leucil-fenilalaninas (fMLP), lonomicina, 12-miristato-13-acetato (PMA), fMLP e A23187, IgG antihumano, um anticorpo do receptor anti-IgE C40/80 e sinomenina. Preferivelmente, trata-se de uma fMLP e/ou de um anti-Fc epsilon-RI, de modo ainda mais preferido, de fMLP.
[0088] A presente invenção refere-se, além disso, a um método e reagentes adequados para esse fim, para verificar a qualidade de uma amostra eficiente, isto é, em um método apto para um alto rendimento. Um tal método, de fato, não é realizado com um alergênio e, por conseguinte, não fornece qualquer resultado diagnosticamente útil, mas permite uma previsão, se a qualidade da amostra é adequada para um método diagnóstico realizado em um preparado separado.
[0089] Para esse fim, o método de acordo com a invenção é realizado, sendo que o alergênio é substituído por um reagente, do qual se sabe, que esse ativa basófilos ativáveis independentemente da presença de um alergênio.
[0090] Como um controle positivo adicional ou alternativo, pode ser usada, ao invés da amostra do paciente, uma preparação de basófilos em combinação com um alergênio ou com um reagente, do qual se sabe, que esse ativa os basófilos ativáveis independentemente da presença de um alergênio, sendo que dessa preparação de basófilos se sabe, que essa é suficientemente reativa, isto é, é ativável através de alergênios. Essa pode ser usada isoladamente ou em combinação com um alergênio ou com um reagente, do qual se sabe, que esse ativa os basófilos ativáveis independentemente da presença de um alergênio, contido em um kit de acordo com a invenção.
[0091] Esse método pode ser realizado antes, depois ou paralelamente ao método diagnóstico ou independentemente desse.
[0092] A invenção refere-se, além disso, a um método não diagnóstico para validar ou para revisar a confiabilidade de um método para comprovar uma ativação de basófilos ou para verificar a qualidade da amostra, que contém basófilos, preferivelmente a capacidade de ativação de basófilos contidos na amostra, que compreende as etapas:
[0093] a) o contato dos basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um reagente, que ativa os basófilos independentemente da presença de um alergênio, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio,
[0094] b) enriquecimento dos basófilos de a) e
[0095] c) comprovação dos basófilos ativados,
[0096] sendo que a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador característico para basófilos ativados é detectado por meio de quimioluminescência.
[0097] No caso dos reagentes que ativam os basófilos, independentemente da presença de um alergênio, pode tratar-se de uma formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP; por exemplo, da Sigma, St Louis, MO) e/ou de um anticorpo do receptor anti-IgE.
[0098] A seguir, a invenção é esclarecida com referência às Figuras com base em exemplos de concretização. As formas de concretização descritas devem ser entendidas em todos os aspectos apenas como exemplos e não como restritivos e diferentes combinações das características listadas são compreendidas pelo contexto da invenção.
[0099] A Figura 1 mostra os resultados do método de acordo com a invenção medido em quimioluminescência flash em relative light units (RLU; Figura 1a-d). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (t2: extrato de pólen de amieiro; t3: extrato de pólen de bétula; t4: extrato de pólen de aveleira em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (antiFcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio do teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição RLU absolutos em função das concentrações do alergênio ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 1a mostra a reação do controle não estimulado (controle negativo), assim como a estimulação do controle com anti-FcϵRI e fMLP. A Figura 1b mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de amieiro. A Figura 1c mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de bétula. A Figura 1d mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de aveleira. A determinação ocorreu em triplicata. Foram calculados valores médios e desvios padrão. Na Figura 1e-h o índice de estimulação (SI) calculado através de (valor médio RLU da amostra ativada)/(valor médio RLU do controle negativo) é mostrado para as amostras representadas na Figura 1 a-d.
[0100] A Figura 2 mostra um teste de ativação de basófilos com determinação em citometria de fluxo dos basófilos ativados em % (Figura 2a-d) ou como intensidade de fluorescência média (MFI; Figura 2e-h). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com mesmos extratos de alergênios como no ensaio em relação à Figura 1 (t2: extrato de pólen de amieiro; t3: extrato de pólen de bétula; t4: extrato de pólen de aveleira em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio do teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada as proporções dos basófilos ativados em função das concentrações dos alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 2a mostra a reação do controle não estimulado (controle negativo), assim como a estimulação do controle com antiFcϵRI e fMLP. Neste caso, nos dois controles positivos foram ativados cerca de 30% dos basófilos. A partir de uma estimulação de mais de 10%, a reação foi avaliada como positiva. A Figura 2b mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de amieiro. A Figura 2c mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de aveleira. Células com um fenótipo CD123+/HLA-DR foram identificadas como basófilos, a ativação foi detectada através de anti-CD63-Vio-Blue.
[0101] A reatividade máxima dos basófilos, dependendo do extrato de pólen, era de 80-88% em cada concentração mais elevada usada e diminuiu continuamente com o aumento da diluição dos extratos de alergênios.
[0102] A Figura 3 mostra os resultados do método de acordo com a invenção medidos em quimioluminescência flash em relative light units (RLU; Figura 3a-d). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (f49; extrato de macieira; g6: extrato de pólen de Phleum pratense; t3: extrato de pólen de bétula) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (antiFcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição de RLU absolutos em função das concentrações dos alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através da barra. A Figura 3a mostra a reação do controle não estimulado (controle negativo), assim como da estimulação do controle com anti-FcϵRI e fMLP. A Figura 3b mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de maçã. A Figura 3c mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de Phleum pratense. A Figura 3d mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extrato de pólen de bétula. A determinação ocorre em triplicada. Foram calculados valores médios e desvios padrão. Na Figura 3 e-h o índice de estimulação (SI) calculado através de (valor médio RLU da amostra ativada)/(valor médio RLU do controle negativo) é mostrado para as amostras representadas na Figura 3 a-d.
[0103] A Figura 4 mostra um teste de ativação dos basófilos com determinação por meio de citometria de fluxo em % (Figura 4a-d) ou como intensidade de fluorescência média (MFI; Figura 4e-h). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (f49: extrato de maçã; g6: extrato de pólen de Phleum pratense; t3: extrato de pólen de bétula) em diversas concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de citometria de fluxo. Os diagramas de barras mostram cada as proporções dos basófilos ativados em função das concentrações dos alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 4a mostra a reação dos controles não estimulados (controle negativo), assim como da estimulação do controle com antiFcϵRI e fMLP. Neste caso, nos dois controles positivos foram ativados cerca de 30% dos basófilos. A partir de uma estimulação de mais de 10%, a reação foi avaliada como positiva. A Figura 4b mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de maçã. A Figura 4c mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de Phleum pratense. A Figura 4d mostra a reação das amostras estimuladas com diversas concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extrato de pólen de bétula. Células com um fenótipo CD123+/HLA-DR foram identificadas como basófilos, a ativação foi detectada através de antiCD63-Vio-Blue.
[0104] A reatividade máxima dos basófilos, dependendo do extrato, situou-se em 96-65% em cada concentração mais elevada usada e diminuiu continuamente com o aumento da diluição dos extratos de alergênios.
[0105] A Figura 5 mostra os resultados do método de acordo com a invenção, medido em quimioluminescência flash em relative light units (RLU; Figura 5a-d). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (e94: rFeld d 1; t3: extrato de pólen de bétula; w6: extrato de pólen de artemísia) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de um teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição RLU absolutos em função das concentrações de alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 5a mostra a reação dos controles não estimulados (controle negativo), assim como da estimulação do controle com anti-FcϵRI e fMLP. A Figura 5b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de rFel d 1. A Figura 5c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de bétula. A Figura 5d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de artemísia. A determinação ocorreu em triplicata. Foram calculados valores de medição e desvios padrão. Na Figura 5 e-h, o índice de estimulação (SI) calculado através do (valor médio RLU da amostra ativada)/ (valor médio RLU do controle negativo) é mostrado para amostras representadas na Figura 5 a-d.
[0106] A Figura 6 mostra um teste de ativação de basófilos com determinação por citometria de fluxo dos basófilos ativados em % (Figura 6a-d) ou como intensidade de fluorescência média (MFI; Figura 6 e-h). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (e94: rFeld d 1; t3: extrato de pólen de bétula; w6: extrato de pólen de artemísia) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRI e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de citometria de fluxo. Os diagramas de barras mostram cada as proporções dos basófilos ativados em função das concentrações de alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 6a mostra a reação mostra a reação dos controles não estimulados (controle negativo), assim como da estimulação do controle com anti-FcϵRI e fMLP. Neste caso, nos dois controles positivos foram ativados cerca de 40% dos basófilos. A partir de uma estimulação de mais de 10%, a reação foi avaliada como positiva. A Figura 6b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de rFel d 1. A Figura 6c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de bétula. A Figura 6d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pólen de artemísia. Células com um fenótipo CD123+/HLA-DR foram identificadas como basófilos, a ativação foi detectada através de antiCD63-Vio-Blue.
[0107] A reatividade máxima dos basófilos, dependendo do extrato, situou-se em 73-12%.
[0108] A Figura 7 mostra os resultados do método de acordo com a invenção, medido em quimioluminescência flash em relative light units (RLU; Figura 7a-d). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (e2: extrato de pelo canino; i3: extrato de veneno de vespa; i209: rVes v 5) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRi e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de um teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição RLU absolutos em função das concentrações dos alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 7a mostra a reação do controle não estimulado (controle negativo), assim como da estimulação do controle com anti-FcϵRi e fMLP. A Figura 7b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de pelo canino. A Figura 7c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de extrato de veneno de vespa. A Figura 7d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de rVes v 5. A determinação ocorreu em triplicata. Foram calculados valores médios e desvios padrão. Na Figura 7 e-h o índice de estimulação (SI) é calculado através de (valor médio RLU da amostra ativada)/ (valor médio RLU do controle negativo) mostrado para as amostras representadas na Figura 7 a-d.
[0109] A Figura 8 mostra um teste de ativação de basófilos com determinação por citometria de fluxo dos basófilos ativados em % (Figura 8a-d) ou como intensidade de fluorescência média (MFI; Figura 8e-h). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (e2: extrato de pelo canino; i3: extrato de veneno de vespa; i209: rVes v 5) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRi e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de citometria de fluxo. Os diagramas de barras mostram cada as proporções dos basófilos ativados em função das concentrações de alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 8a mostra a reação do controle não estimulado do (controle negativo), assim como da estimulação do controle com antiFcϵRi e fMLP. Neste caso, nos dois controles positivos foram ativados cerca de 30% dos basófilos. A partir de uma estimulação de mais de 10%, a reação foi avaliada como positiva. A Figura 8b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extrato de pelo canino. A Figura 8c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml) de extrato de veneno de vespa. A Figura 8d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml) de rVes v 5. Células com um fenótipo CD123+/HLA-DR foram identificadas como basófilos, a ativação foi detectada através de anti-CD63-Vio-Blue.
[0110] A reatividade máxima dos basófilos, dependendo do extrato, situou-se em 25-8%.
[0111] A Figura 9 mostra os resultados do método de acordo com a invenção, medido em quimioluminescência flash em relative light units (RLU; Figura 9a-d). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (w8: extrato de pólen de dente de leão; f17: extrato de avelã; f49: extrato de maçã; e94: rFel d 1) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (antiFcϵRi e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de um teste de quimioluminescência. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição RLU absolutos em função das concentrações dos alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 9a mostra a reação do controle não estimulado (controle negativo), assim como da estimulação do controle com anti-FcϵRi e fMLP. A Figura 9b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml) de extrato de dente de leão. A Figura 9c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml) de extrato de avelã. A Figura 9d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/m) de extrato de maçã. A Figura 9e mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/m) de rFel d 1. A determinação ocorreu em triplicata. Foram calculados valores médios e desvios padrão. Na Figura 9 f-j o índice de estimulação (SI) é calculado através de (valor médio RLU da amostra ativada)/ (valor médio RLU do controle negativo) mostrado para as amostras representadas na Figura 9 a-e.
[0112] A Figura 10 mostra um teste de ativação de basófilos com determinação por citometria de fluxo dos basófilos ativados em % (Figura 10a-e) ou como intensidade de fluorescência média (MFI; Figura 1-f-j). 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram estimulados com extratos de alergênios (w8: extrato de pólen de dente de leão; f17: extrato de avelã; f49: extrato de maçã; e94: rFel d 1) em diferentes concentrações (10 µg – 1 ng) ou controles (anti-FcϵRi e fMLP) e a ativação dos basófilos foi determinada por meio de citometria de fluxo. Os diagramas de barras mostram cada as proporções dos basófilos ativados em função das concentrações de alergênios ou dos controles. Os valores de medição são adicionalmente indicados através das barras. A Figura 10a mostra a reação do controle não estimulado do (controle negativo), assim como da estimulação do controle com antiFcϵRi e fMLP. Neste caso, nos dois controles positivos foram ativados cerca de 30% dos basófilos. A partir de uma estimulação de mais de 10%, a reação foi avaliada como positiva. A Figura 10b mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml) de extrato de pólen de dente de leão. A Figura 10c mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml) de extrato de avelã. A Figura 10d mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml) de extrato de maçã. A Figura 10e mostra a reação das amostras estimuladas com diferentes concentrações (10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/m) de rFel d 1. Células com um fenótipo CD123+/HLA-DR foram identificadas como basófilos, a ativação foi detectada através de anti-CD63-Vio-Blue.
[0113] A reatividade máxima dos basófilos, dependendo do extrato, situou-se em 89-37%.
[0114] A Figura 11 mostra os resultados de uma amostra de paciente depois da estimulação com fMLP ou do controle não estimulado (controle negativo) com diferentes sistemas de detecção. A Figura 11a mostra os resultados do método de acordo com a invenção medidos na quimioluminescência rápida de unidades de luz relativas (RLU). A Figura 11b mostra os resultados do enriquecimento dos basófilos realizado com o método de acordo com a invenção, depois da detecção com um anticorpo marcado com fluorescência (anti-CD63- FITC; 2 µg/ml), medido como intensidade de fluorescência (FI). A Figura 11c mostra um teste de ativação de basófilos com determinação por citometria de fluxo dos basófilos ativados. 50 µl cada de sangue inteiro de um alérgico ao pólen foram deixados estimulados ou não estimulados com fMLP (controle negativo). A ativação dos basófilos foi determinada, então, com os métodos indicados acima. Os diagramas de barras mostram cada os valores de medição absolutos em RLU (Figura 11a) ou Fi (Figura 11b) ou a ativação dos basófilos em % (Figura 11c).
[0115] A Figura 12 mostra os resultados de uma amostra de paciente depois da estimulação com fMLP ou do controle não estimulado (controle negativo), utilizando diversas combinações de anticorpos para o enriquecimento e comprovação dos basófilos. Não foram usados quaisquer alergênios. A Figura 12a mostra os resultados do método de acordo com a invenção medido em quimioluminescência rápida de unidades de luz relativas (RLU). A Figura 12b mostra o índice de estimulação (SI) calculado através de (valor médio RLU da amostra ativa)/ (valor médio RLU do controle negativo) para a amostra representada na Figura 12a. A Figura 12c mostra um teste de ativação de basófilos com determinação por citometria de fluxo dos basófilos ativados. A Figura 12d mostra os resultados de um enriquecimento dos basófilos através do marcador CD63 dependente de ativação através de anti-CD63-biotina e a comprovação com anti-IgE-NSP-SA. O anticorpo anti-CD63-biotina foi usado em concentrações de 0,2-1 µg/ml, enquanto o anticorpo de comprovação anti-IgE-NSP-SA foi usado em uma concentração fixa de 0,5 µg/ml. A Figura 12e mostra o índice de estimulação (SI) calculado através de (valor médio RLU da amostra ativada)/ (valor médio RLU do controle negativo) para as amostras mostradas na Figura 12d.
Exemplos 1a. Preparação de diluições de alergênios
[0116] Para comprovar a ativação dos basófilos, um anticorpo antiCD63 (clone 7G3, BD Bioscience #353014) foi acoplado de forma covalente com um éster de acridínio NSP-SA-NHS (Heliosense Biotechnologies, #199293-83-9) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, o anticorpo foi purificado através de uma coluna PD-10 (GE Healthcare, #383420). Da mesma maneira, o IgE foi marcado pelo Biomol GmbH com NSP-SA-NHS.
1b. Preparação de diluições de alergênios
[0117] T2 extrato de pólen de amieiro (Squarix, #T-4402), t3 extrato de pólen de bétula (Squarix, T2-4400) e t4 extrato de pólen de aveleira (Squarix, #T-4404) foram diluídos em concentrações de 10 µg/ml, 1 µg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml em tampão de diluição (1xHanks Balanced Salt Solution (Thermo Fisher Scientific #14065056), 40 mM de Hepes, pH 7,4). Como controle negativo serviu o tampão de diluição. Como controles positivos foram usados fMLP (Sigma, #3506-5MG) em uma concentração de 10-6 M e anticorpo anti-FcϵRI (clone AER-37), ebiosicence, #14-5899-82) em uma concentração de 100 ng/ml. Além disso, como antígeno foi usado extrato de maçã (Squarix # F-2327), extrato de pólen de Phleum pratense (Squarix # G-5501), e94 (purificado de acordo com Rogers e colaboradores (1993) Recombinant Fel d.I: Expression, purification, IgE binding and reaction with cat-allergic human T cells., Molecular Immunology, 30 April 2010 (6), 559-568), extrato de pólen de artemísia (Squarix #W-3400), extrato de pelo canino (Squarix # E-6617), extrato de veneno de vespa (Squarix # I-7804), i209 (purificado de acordo com Seismann e colaboradores 2010, Clinical and Molecular alergy, 8:7), extrato de pólen de dente de leão (Squarix # W3404) e extrato de avelã (Squarix # T-4404).
1c. Estimulação:
[0118] 50 µl cada de sangue inteiro periférico (heparinizado) foi misturado em uma placa de microtitulação com 50 µl cada de diluição de alergênios ou controle e incubado em uma estufa a 37oC. A reação foi interrompida pela adição de 10 µl de uma solução de EDTA concentrada (100 mM de EDTA em PBS).
2a.1. Incubação de anticorpo:
[0119] Em seguida, dois anticorpos foram colocados nas amostras:
[0120] 1) anti-CD123-biotina (clone H5C6, Biolegend #353014) em uma concentração final de 0,5 µg/ml
[0121] 2) anti-CD63-NSP-SA (clone 7G3, BD Bioscience #353014) em uma concentração final de 2 µg/ml.
[0122] As amostras foram misturadas e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente.
[0123] Alternativamente, foram usados anti-CD63-biotina (Biolegend 351017) e anti-CD63-FITC (Miltenyi 130-100-160).
2a2. Eritrólise:
[0124] Através da adição de 100 µl de um tampão de lise contendo saponina (0,14% de saponina em PBS) e 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, os eritrócitos foram lisados. Em seguida, a placa de microtitulação foi centrifugada durante 5 minutos a 500 g e o sobrenadante foi retirado.
2a3. Incubação de grânulos:
[0125] As amostras foram misturadas com 10 µg cada de grânulos magnéticos revestidos com estreptavidina (Sera-Mag Speedbeads Streptavidin blocked, GE-Healthcare, #21152104010350) e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente.
2a4. Lavagem:
[0126] As células ligadas aos grânulos foram lavadas 5 vezes com 300 µl de tampão de lavagem (0,05% de Tween, 2mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 0,05% de NaN3) no lavador de placa, por exemplo, Tecan Hydroflex equipado com um magneto MBS96.
2a5. Detecção
[0127] Na subsequente detecção, o éster de acridínio NSP-SA foi acionado no anticorpo CD63 por duas soluções (H2O2; HNO3 0,1 M e NaOH 0,25 M (Chemiluminescence Detection Reagent Kit, Invitron Ltd., #IV1-001)). O sinal de quimioluminescência produzido (luminescência flash) foi detectado no luminômetro de placa, por exemplo, Berthold Centro LB 960 com um comprimento de onda de 425 nm.
2a6. Avaliação:
[0128] A intensidade da ativação dos basófilos foi calculada através do aumento do sinal de quimioluminescência em comparação com o controle não estimulado. Pode ser calculado um índice de estimulação (SI) unidades de luz relativas (RLU) da amostrada ativada/RLU da amostra não estimulada. O valor do limiar a ser ultrapassado, neste caso, depende da substância de teste.
2b. Medição por citometria de fluxo
[0129] Para a determinação por citometria de fluxo, as amostras, depois da ativação com anticorpos anti-CD123-PE (Miltenyi Biotec, #130-098-894), anti-HLA-DR-PerCPVio700 (Miltenyi Biotec, #130-103- 873) e anti-CD63-Vio-Blue (Miltenyi Biotec, #130-100-154), são incubadas protegidas da luz, de acordo com as instruções do fabricante, durante 15 minutos a 4oC.
[0130] Depois de adicionar 1 vez 1 ml de solução de lise FACS (BD Bioscience, #349202) e de uma incubação durante 10 minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 500 g, durante 5 minutos, o sobrenadante foi retirado e as amostras foram novamente lavadas com 500 µl cada de tampão de lavagem (PBS sem Ca2+/Mg2+, 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA, 0,05% de NaN3). A medição ocorreu no citômetro de fluxo, por exemplo, MACS Quant (Miltenyi Biotec) dentro de 2 horas. As células com um fenótipo CD123+ /HLA-DRforam identificadas como basófilos. Os basófilos estavam ativados, quando o sinal CD63 ultrapassou um valor de limiar selecionado. Uma ativação total de ≥ 10% foi avaliada como positiva.
2c. Medição de fluorescência
[0131] A fluorescência de anti-CD63-FITC foi medida com um aparelho BMG Labtech Fluostar (485 nm/520 nm).
Resultados:
[0132] O teste de quimioluminescência (Figura 1) foi avaliado, então, como positivo, quando o sinal da amostra estimulada duplica em relação ao controle (Si > 2). Na avaliação das determinações por citometria de fluxo (Figura 2), todas as amostras são avaliadas como positivas, que mostram uma ativação de > 10%. A comparação do teste de quimioluminescência com o teste de citometria de fluxo mostra uma boa correlação dos resultados dos dois sistemas de teste, assim como uma capacidade de reprodução muito boa. A faixa de medição dinâmica do sinal de quimioluminescência, neste caso, é significativamente mais larga do que no sinal de fluorescência.
[0133] Na avaliação por citometria de fluxo, janelas de análise (Gating) devem ser definidas para definir as populações celulares ativadas e não ativadas, que devem ser ajustadas individualmente para cada paciente e definidas de forma subjetiva pelo respectivo avaliador. Essas possibilidades da avaliação variante não são dadas no teste de quimioluminescência, visto que aqui é formada apenas a relação de amostra estimulada para o controle. Isso permite uma avaliação padronizada, que não pode ser obtida, assim, em um teste por citometria de fluxo. Com base na preparação da amostra no formato de placa de microtitulação, da rápida medição e da avaliação simples, possibilita-se, além disso, um rendimento da amostra significativamente mais elevado.
[0134] Esse ensaio mostrou, além disso, que o uso de quimioluminescência como sistema de detecção representa uma vantagem decisiva: os basófilos e outras células mostram uma autoquimioluminescência apenas muito baixa. Por conseguinte, não é necessária uma pureza absoluta das células-alvo na medição.
[0135] Ao contrário, em particular, células mortas e granulócitos possuem uma alta autofluorescência, o que provocaria uma sobreposição do sinal desejado na citometria de passagem e, por conseguinte, requer um Gating correspondente. Ao utilizar o anticorpo CD123-biotina para purificar os basófilos, uma baixa proporção de células especialmente dendríticas, que do mesmo modo exprimem CD123 na superfície, estão contidas nas amostras. Essas não exprimem, no entanto, qualquer CD63, de modo que o sinal de quimioluminescência anti-CD63 detectado deve ser atribuído exclusivamente aos basófilos. A própria medição não é prejudicada pela presença de outras células não marcadas.
[0136] A combinação da quimioluminescência como método de comprovação com a presença de sangue inteiro não fracionado leva, por conseguinte, a um método de comprovação altamente sensível, com o qual um grande número de amostras pode ser processado com a máxima capacidade de reprodução e capacidade de padronização.
[0137] Nas Figuras 3-10 mostra-se com uma ampla seleção de antígenos e doadores de amostras, que o método de acordo com a invenção pode ser amplamente aplicado. Em cada caso, a primeira Figura (por exemplo, Figura 3) mostra o mesmo experimento com quimioluminescência e a subsequente (Figura 4) com citometria de fluxo, a fim de demonstrar a capacidade de comparação. O resultado é que esse é surpreendentemente alto. O método de acordo com a invenção pode substituir, por conseguinte, a citometria de fluxo.
[0138] Na Figura 11 os três métodos de comprovação quimioluminescência, fluorescência e citometria de fluxo são diretamente comparados. Neste caso, é evidente, que a quimioluminescência da citometria de fluxo corresponde aproximadamente à sensibilidade e é significativamente mais adequada do que a fluorescência, para confirmar, que o método de acordo com a invenção pode substituir a citometria de fluxo.
[0139] O experimento mostrado na Figura 12 demonstra, finalmente, que o método de acordo com a invenção também funciona, se para o enriquecimento for usado um ligado dependente de ativação e para a detecção um independente de ativação, ao invés do contrário, tal como nos outros experimentos. Embora a origem aqui na quimioluminescência em comparação com o sinal seja maior, mas o sinal de origem ainda pode ser claramente distinguido.

Claims (17)

  1. Método para o diagnóstico de uma alergia, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:
    a) contato de basófilos de uma amostra de sangue inteiro de um paciente com um alergênio em uma solução aquosa na presença do sangue inteiro com uma proporção volumétrica do sangue inteiro na solução aquosa de pelo menos 20% em volume, em condições, que permitem uma ativação dos basófilos através do alergênio,
    b) enriquecimento dos basófilos de a) e
    c) comprovação dos basófilos ativados,
    sendo que a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador para basófilos localizado na superfície de basófilos é detectado por meio de quimioluminescência,
    sendo que na etapa b) os basófilos são enriquecidos pelo fato de que esses se ligam a um ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que é um marcador característico para basófilos ativados
    e/ou a comprovação na etapa c) é obtida pelo fato de que um marcador característico para basófilos ativados é detectado por meio de quimioluminescência.
  2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, no caso do sangue inteiro, trata-se de um sangue inteiro não processado.
  3. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a) é realizada em uma solução aquosa com uma proporção de sangue inteiro de pelo menos 30, preferivelmente 35, de modo ainda mais preferido 40, de modo ainda mais preferido 45 % em peso.
  4. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa interrupção da ativação dos basófilos, preferivelmente antes da etapa b).
  5. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que na etapa os basófilos são enriquecidos pelo fato de que esses se ligam a um ligante, que se liga especificamente a um polipeptídeo, que nos basófilos está localizado na superfície celular, preferivelmente independente de seu estado de ativação
  6. . Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ligante é um anticorpo monoclonal contra o polipeptídeo.
  7. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que na etapa b) os basófilos são imobilizados.
  8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os basófilos são imobilizados em um grânulo, preferivelmente em um grânulo magnético.
  9. Método de acordo com uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato que os basófilos são lavados depois da imobilização.
  10. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato que na etapa b) os eritrócitos são lisados e removidos.
  11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os eritrócitos, antes da imobilização dos basófilos, são removidos através de centrifugação.
  12. Método de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a comprovação na etapa c) é realizada com auxílio de um ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência contra o marcador localizado na superfície de basófilos, preferivelmente um marcador, que é característico para os basófilos ativados.
  13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que no caso do ligante provido de uma marcação capaz de quimioluminescência, trata-se de um anticorpo monoclonal, que por si só apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência ou se liga a um anticorpo secundário com uma marcação capaz de quimioluminescência.
  14. Método de acordo com as reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as etapas a), b) e c) são executadas em uma cavidade de uma placa de microtitulação.
  15. Método de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada antes das etapas b) e c).
  16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente para o contato dos basófilos com o alergênio, sendo que no caso do recipiente trata-se preferivelmente de uma placa de microtitulação,
    opcionalmente de um alergênio,
    de um ligante contra um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos para o enriquecimento de basófilos e um ligante contra um marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção,
    sendo que o ligante contra o marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção, apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência,
    sendo que no caso da marcação capaz de quimioluminescência pode tratar-se de uma enzima, que catalisa uma reação de quimioluminescência ou de uma molécula, que por si só produz um sinal de quimioluminescência em condições adequadas, sendo que a enzima no primeiro caso está contida no kit em combinação com uma solução de substrato capaz de quimioluminescência
    e sendo que o polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos e/ou o marcador localizado na superfície de basófilos é característico para basófilos ativados,
    opcionalmente um agente para interromper a ativação dos basófilos,
  17. Uso de um ligante contra um polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos para o enriquecimento de basófilos juntamente com um ligante contra um marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção,
    para o diagnóstico de uma alergia ou para a produção de um kit para o diagnóstico de uma alergia ou para selecionar substâncias ativas candidatas para a terapia de uma alergia contra um alergênio,
    caracterizado pelo fato de que o ligante contra o marcador localizado na superfície de basófilos para a detecção apresenta uma marcação capaz de quimioluminescência,
    sendo que no caso da marcação capaz de quimioluminescência, pode tratar-se de uma enzima, que catalisa uma reação de quimioluminescência ou de uma molécula, que mesmo em condições adequadas produz um sinal de quimioluminescência, sendo que a enzima, no primeiro caso, é utilizada em combinação com a solução de substrato capaz de quimioluminescência
    e sendo que o polipeptídeo localizado na superfície celular de basófilos e/ou o marcador localizado na superfície de basófilos é característico para basófilos ativados.
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