JPS5995460A - リューマチ性疾病の検査方法および試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リューマチ性疾病の診断方法および診断用試
験キットに関するものであり、特に自家免疫性成分が存
在することを特徴とする各種のリューマチ性疾病を分別
して診断する方法に関するものである。

自家免疫性疾病は大きく２つに分類される。すなわち、
全身的疾病と臓器疾患とである。全身的疾病の中には、
リューマチ性疾病として知られているものかある。この
中には、全身紅斑性狼煩（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　１ｕｐｕ
ｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：　５ＬＥ）、リュー
マチ様関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒｉｔ
ｉｓ：　ＲＡ）および混合結合繊炎（ｍｉｘｅｄ　ｃＯ
ｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅ　ｄｉｓｅａｓｅ：　
ＭＣＴＤ）などが含まれる。これらの疾病は全身的なも
のであるから、３種類の疾病のいずれかにかかった患者
は、初期には同様な症状を呈する。従って、これらの疾
病を区別することはしばしば非常に困難である。また、
これらのＳＬＥ、　ＲＡおよびＭＣＴＤを早期に分別し
て診断することは有用なことである。

歴史的には、ＳＬＨの診断は、紅斑性狼瘍（ｌｕｐｕｓ
ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：　ＬＥ）細胞の同定によ
ッテ行なわれた。この細胞、すなわち多形核白血球は１
．μ者自身の白血球の核成分からなると辿常考えられて
いる大きい不定、形封入体の存在を特徴としている。

この方法による診断は明確とは言い難＜　、ＳＬＥ　Ｊ
患者の約８０％はＬＥ細胞を有しているが、一方、ｒＬ
Ｅ細胞陽性」を呈する人の７０％以上かＳＬＨにかかっ
ていない。

免疫体蛍光技術の開発により、　ＳＬＨに通常関連して
いる自家抗体群の同定が可能になった。これらの抗体は
、μ者自身の細胞の核を指標として有しており、抗核抗
体（ａｎｔｉｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：
ＡＮＡ）として知られるようになった。しかし、残念な
がら全てのＳＬＥ　ｚ者はＡＮＡを示すが、全てのＲＡ
思者およびＭＣＴＤ　１２者もまたＡＮＡを示す。

この特異性がないことは、植生に存在する種々の抗原性
指標を考慮すれば驚くには当らない。ヌクレオプロティ
ン、ヌクリアグリコプロティン、複ストランドＤＮＡ　
（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ：　ｄｓＤ
ＮＡ）、単ストランドＤＮＡ　（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒ
ａｎｄｅｄ　ＤＮＡ：　５ｓＤＮＡ）、複ストランドＲ
ＮＡ　（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ：　
ｄｓＲＮＡ）、単ストランドＲＮＡ　（ｓｉｎｇｌｅ−
ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ：　５ｓＲＮＡ）、ポリヌク
レオチド、および抽出可能核抗原（ｅｘｔｒａｃｔａｂ
ｌｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ：　ＥＮＡ）と
して知られている抗原群などの核成分に対する自家抗体
はＳＬＥ中のみに同定されている。

幾つかの核抗原の分子構造は、例えばＤＮＡについては
り、　Ｅ、　Ａｄａｍｓ他、　Ａｍｅｒ、　Ｊ、　ｏｆ
　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｎ、。

７７（１）：５４−５９　（１１３８２）　；またＲＮ
Ａについてはに、Ｒ１Ｌｅｒｎｅｒ他、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、　２１１＠、４００−４０２　（１９８１）　；お
よびヒストンについてはＡ、　Ａｉｔｋ−ａｃｉ　他。

Ｊ、　１ｍｍ、　Ｍｅｔｈ、、　４４：　３１１−３２
２　（１９８１）などにより知られており、その大部分
は免疫学的および医化学的性質により説明されている。

特定の細胞作用を有する蛋白質としてのこれらの抗原の
同定は、自家免疫症の病因を解明すると共に、病気の分
別診断法を提供した。

現在では、ＳＬＥなとの１２ニーマチ性疾病の診断試験
の大部分はＤＮＡに対する自家抗体の同定に基づいてい
る。例えば、 米国特許第４．２３４．５８３号（Ｄ、　Ｒ，Ｒｉｐｐ
ｅ、　１９８０年１１月１８日）は、ＤＮＡに〜関連し
たＳｔ、ｔ：患者の抗体の検出法を記載している。ＤＮ
Ａを、血清サンプルと反応させたメチル化ウシ血清アル
ブミン（ｍＢｓＡ）と結合し１次に周知の蛍光アンチ−
クロプリン法によって検出する。更に、抗原をＤＮＡか
ら胴線エキストラクトに変え、抽出可能核抗原（ＥＮＡ
）の抗体の検出をクレームしている。このＥＮＡはそれ
自体は同定されず、ＳＬＨのテストはＭＣＴＤの検出に
は使用さす、またその逆もできない。

米国特許第３，８９７，２１２号（Ｓ、　Ａ、　Ｌｅａ
ｎ他、１８７５年７月２９日）は、ＳＬＥ、Ｅ者のＤＮ
Ａに対する抗体の直接放射線免疫分析について記載して
おり、血清サンプルを放射性ＤＮＡと反応させ、ＤＮＡ
の沈澱および試料血清中の放射能を測定している。

米国特許第３，９９７，８５７号（Ｂ、　Ｆ、　Ｄｚｉ
ｏｂｋｏｗｓｋｉ、１９７６年１２月１４日）は、人間
の粒核因子の検出にドライスライド法を用いることを記
載している。同法においては、試料血清を、あらかじめ
カラススライドに塗布した胸腺細胞抽出物と反応させ、
次に免疫蛍光分析を行なっている。抽出物の成分の同定
は行なっていない。

米国特許第４，３１４，９８７号（Ｒ，１，Ｍｏｒｒｉ
ｓ他、１９８２年２月９日）は、抗核抗体の蛍光のパタ
ーン（即ち、均質の周縁部、斑点、核化なと）およびそ
の後の抗−ＤＮＡまたは抗−ＥＮＡ抗体の試験に基づい
たリューマチ性疾病の診断法を記載している。この特許
では、ＳＬＥと　ＭＣＴＤとを区別できることをクレー
ムしているが、既存の試験法における実施法および判断
法を述べており、試験自体の精度は良くない。更に、そ
のような方法の効果を当業者が判断するためのデータが
示されていない。

蛍光の核化パターンは不明確であると考えられる米国特
許第ａ、３ｔａ、５５７ｇの技術とは反対に、Ｊ、　Ｌ
、　Ｐｉｎｎａｓ他、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
！１１（４）：　９９６−＋００４　（１９７３）の核
化蛍光についての記載は本発明の研究の端緒となったも
のである。

本発明の目的は、全身紅斑性狼ｆｆｉ　（ＳＬＥ）およ
び混合結合繊炎（Ｍｉｄ：ＴＤ）などのリューマチ性疾
病について、これらの疾病に伴なう自家抗体群を分析す
ることによって分別する方法を提供することである。Ｓ
ＬＥ　Ｈ者またはＭＣＴ［ｌ患者の血清を、高度に精製
した核化系の酵素と、そのまま（全酵素）の状態または
変性（サブユニ、ト）状態で反応させることによって自
家抗体を同定する。酵素（またはそのサブユニント）は
、試料血清中に存在する酵素特異性粒重に対して、抗原
性指標として作用する。抗原−抗体コンプレックスは、
各種の分析指示薬により検出することができる。試薬の
添加および除去を容易にするために、分析は固相で行な
う。

従って、試料血清中の抗体の特定な反応性を。

種々の酵素のサブユニー／　トによって観察することに
より、　ＳＬＥまたはＭＣＴＤの、迅速で正確な分別診
断を行なうことができる。

現在まで、種々のリューマチ性自家免疫性疾病を分別し
得る単一の確実な血清学的方法はなかった。従って、本
発明の第一の目的は、そのような方法を提供することで
ある。本発明の他の目的は診断試験キットの形態に作り
易く、かつ、診断試験は廉価に準備および実施ができ、
更に臨床試験室で容易に行なうことが可能な試験キット
を提供することである。

実施例において、本発明は以下の要素からなるものであ
る。

Ａ、精５ｉｆｌ　ｌ’ｆＮＡポリメラーゼエＲＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡをＲＮＡにするときに触媒作用をす
る酵素であり、抽出可能核抗原（ＥＮＡ）として使用す
る核抽出物中の多くの蛋白質中に存在すると考えられる
。抗核化抗体はＳ　Ｌ　Ｅ　患者の血清中に存在すると
報告されているので（Ｊ、　Ｌ、　Ｐｉｎｎａｓ他の前
記文献参照）、核化系の特定のＲＮＡポリメラーゼであ
るＲＮＡポリメラーゼエは、前記の抗核化抗体群の抗原
指標として選択された。

抗−ＲＮＡポリメラーゼＩ抗体は、１０ｏｚのＳＬＥ患
者に検出されたが、１０（Ｈの通常の患者には検出され
なかった。抗−ＲＮＡポリメラーゼ抗体は、１０ｏｚの
Ｍ　ＣＴ　［１患者にやはり検出され、７８駕のリュー
マチ様関節炎、患者にも検出された。

しかしＲＮＡボリメラーセエは複合酵素である。

即ち、該酵素は８つの異なったポリペプチドからなって
いる： Ｓｌ（Ｍｒ＝１９０，０００）、　　Ｓ２（Ｍｒ＝１２
０，０００）、Ｓ３（Ｍｒ＝　８５，０００）、Ｓ４（
Ｍｒ＠４２，０００）、Ｓ５（Ｍｒ＝　２５，０００）
、　　Ｓ６（Ｍｒ＝　２１，０００）、Ｓ７（Ｍ、＝　
１９，０００）およびＳ８（Ｍ、＝　１８，０００）。

これらのポリペプチドのうち、いずれが指標の抗原中に
含まれているかを決定する方法を発明した。抗−ＲＮＡ
ポリメラーセＩ抗体の特異性は、酵素の個々のポリペプ
チドに関し、３と４者によって相違しているが、各種の
リューマチ性疾病について、抗体−ポリペプチド間反応
の明確なパターンが観察された（第１表参照）。

第１表 患者の血清と　ＲＮＡポリメラーセエ ポリペブチドとの反応（０） 患者　　診断　　　Ｓ２　　　Ｓ３　　　Ｓ４　　　Ｓ
５Ｖ、Ｓ、　　　　ＲＡ　　　　　　　　　−＋　　　
　　−−Ｅ、Ｄ、　　　　　ＲＡ　　　　　　　　　　
　−十　　　　　−−Ｅ、に、ＲＡ　　　　　　　　　
　　−十　　　　　−−Ｊ、Ｅ、　　　　　ＲＡ　　　
　　　　　　　　−十　　　　　−−５，Ｓ、ＲＡ　　
　　　　　　　−＋　　　　　−−０、Ｓ、　　　　Ｓ
ＬＥ　　　　　　　　　−＋　　　　　　−＋Ｖ、Ｄ、
　　　　　ＳＬＥ　　　　　　　　　＋　　　　　　十
　　　　　−＋Ｈ，Ｓ、　　　ＳＬＥ“　　　　＋　　
　＋−＋Ａ、Ｓ、　　　　ＳＬＥ　　　　　　　　＋　
　　　　＋　　　　　−−Ｄ、Ｇ、　　　　　ＳＬＥ　
　　　　　　　　十　　　　　＋　　　　　　−−９，
Ｓ、　　　　ＳＬＥ　　　　　　　　＋　　　　　＋　
　　　　−＋Ｄ、Ｌ、　　　　ＳＬＥ　　　　　　　　
＋−＋　　　　　　−−１、Ｓ、　　　　ＭＣＴＤ　　
　　　　　−＋　　　　　　＋　　　　　　−Ｃ，Ｃ，
ＭＣＴＤ　　　　　　　−−＋　　　　　−５，Ｂ、　
　　　ＭＣＴＤ　　　　　　　−＋　　　　　　＋　　
　　　　＋Ｍ、Ｂ、　　　　ＭＣ：ＴＤ　　　　　　　
−＋　　　　　＋　　　　　＋第１表の注（＊）　： ＲＮＡポリメラーゼＩの各ポリペプチドは、ポリアクリ
ルアミドゲル゛上気体動によって変性状態において分離
し、抗−ＲＮＡポリメラーセ■抗体を有することをあら
かじめ試験した患者からの血清と共に、固相放射線免疫
分析に抗原として使用した。

プラス（＋）およびマイナス（−）の符号は特定あポリ
ペプチドに対する抗体か、それぞれ検出され、あるいは
検出されなかったことを示す。

（注終） 特にＲＡ思患者血清は、ＲＮＡポリメラーゼ■のＳ３ポ
リペプチドのみに対する抗体を含んでいることを見出し
た。その反対に、ｓＬＥ、６者はＳ２および／またはＳ
５、更にＳ３に反応する抗体を有する。ＲＡ患渚および
ｓｕ４者のいずれも抗−５４抗体を持っていない。Ｓ４
に対する抗体はＭＣＴＤ患者の血清に特有のものであり
、同時に抗−８３および抗−８５抗体をある場合には有
している。特定の群とこれらの対照的な反応パターンは
、　ＳＬＥおよびｌ’１ｃＴＤの分別的な診断を可能に
している。

確認可能な核からＲＮＡポリメラーゼが得られるので、
精製酵素源はネズミの腫瘍（モリースヘパトーマ３９２
４Ａ）の分離核からのものであるか、ネズミ酵素は、人
間の抗体に対して有効な指標を与えた。

更に、上記の理由により、ネズミ酵素のみを指標物質源
とするものではない。即ち、人間、哺乳動物、下位のを
椎動物などの臓器、腫瘍、組織片培地あるいは細胞線、
あるいは各ＲＮＡポリメラーゼエの遺伝子を含有する遺
伝学的化学製品などを包含するものである。

Ｂ１分析指示薬 試料血清を指標抗原と混合した場合、抗原−抗体反応の
存在が判明しなければならない。この目的のために、種
々の試薬が知られており、本発明においてはそれらを使
用することができる。限定的意味ではなく、単に説明の
ために、それらを例示すれば、フルオレセイン−１酵素
−、フェリチン−１あるいは放射性−ラベル抗−人間抗
体を含む複抗体法、黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓａｕ、ｒｅｕｓ）からの１２５　Ｉ−ま
たは同様物の放射性ラベル蛋白質Ａ、酵素結合免疫試薬
（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
）、゛あるいはヒオチオン化／ストレプトアヒジン（ｂ
ｉｏｔｉｏｎｉｚｅｄ／５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）あ
るいはアヒシン結合免疫試薬なとがめる。

Ｃ９緩衝液および洗浄液 分析中には反応物を次々に加えるので、成分を安定化し
未反応物を除去するために緩衝系が必要である。緩衝系
については、種々の変法が可能であることは明らかであ
る。一つの緩衝系を以下の実施例に示すか、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

要約すると、ＲＮＡポリメラーゼエ抗体の試験は次のよ
うにして行なう。

（１）患者の血清を変性してないＲＮＡポリメラーゼエ
に対して試験する。もし試験結果が陰性である場合には
、その人はＳＬＥおよびＭＣＴＤのいずれも持っていな
い。もし試験結果が陽性の場合は、患者はＳＬＥ、ＭＣ
ＴＤあるいはＲＡを有しているので、第２の試験を行な
う。

（２）第１の試験で抗−ＲＮＡポリメラーゼＩ抗体を含
むことが判明した。１９者の血清について、各分離Ｒ″
ＮＡＮＡポリメラーゼエポリペプチドる抗体の試験を行
な＼う。Ｂ４に対する抗体が検出された場合はＭＣＴＤ
であることが解る。また、もしＢ３およびＢ２および／
またはＢ５（但しＢ４ではない）か見出された場合には
ＳＬＥを示す。もし抗−５３抗体のみか存在する場合に
はＲＡである。

ＲＮＡポリメラーゼＩおよびそのポリペプチドに対する
抗体の免疫分析は、次のような有効な診断法を提供する
ものである。

（１）試験法は定性的でありＳＬＥｌＭｃ：ＴＤおよび
ＲＡの患者に対しては陽性であるが、餠康な人や癌、巴
者に対しては陰性である。従って、抗−ＡＮＡ抗体は癌
、＋、！！者にも見出されるので、この試験は、ＡＮＡ
および抗−ＡＮＡ抗体の試験よりも有利である。

（２）この試験は非常に特異的であり、ＳＬＥ　、ＭＣ
ＴＤおよびＲＡを分別することかできる。このことは現
行の他の方法では不可能なことである。

（３）この試験は定Ｆ、）的であり、従って、病気の経
過の監視に有用である。

（４）この試験は非常に高感度である。微量の抗−ＲＮ
ＡポリメラーゼＩ抗体を検出することかできる。

従って、１００％のＳＬＥ思渚およびＭＣ：ＴＤ思患者
抗体を見出すことかできる。

（５）　ＬＥおよびＡＮＡの試験とは相違し、この試験
のべ１ｉおよび芙虚は低廉に行なうことができ、特別の
免疫試験部門や試験経験を持たない臨床試験室において
も容易に実施できる。ＬＥ細胞およびＡＮＡの試験は、
各患者からの種々の血清稀釈物を顕微鏡下で試験するた
めの高度に訓練された技術者が必要であるから、費用と
時間かかかる。更に、試験結果の解釈にはしばしば個人
差かある。

実施例１ 本実施例においては、入手可能な種々の細胞源の１つか
らＲＮＡポリメラーセエを分離する方法を示す。

［核の分離］ モーリスへパトーマ３９２４Ａ（倍増期間：４．４日）
を接種し、・２８０間経過した肝臓腫瘍を有するネズミ
を使用した。壊死組織のない腫瘍を０．９２　Ｍａｉｌ
ｌｏ、２５　Ｍシュークロースの溶液１こ浮遊させた。

全ての処理は冷却下で行なった。腫瘍を細かく切り、０
．２５　ｍＭのスペルミンと３．３　ｍＭのＭｇＣｌ２
を含む１２倍：％の２．０Ｍシュークロース溶液中でホ
モシナイス゛した（２ストローク、テフロン−カラスホ
モジナイザー使用）。得られたホモゲネートをチーズク
ロスでシル過し、４０．Ｑ（ｌＯＸｇで７０分間遠心分
離した。得られたペレントを、ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２お
よび０．３％　（Ｖハ）トリ　トン（Ｔｒｉｔｏｎ）　
Ｘ−１００を含む０．３４　Ｍシュークロースの溶液に
再度懸濁させた　（ｌ　ｍｌ／ｇ原組織）。この懸濁液
をドーンスホモンナイザーでホモジナイズし、４℃で５
から１０分間静置し、２０．０００Ｘｇで５分間遠、心
分離した。この処理により殆ど酵素活性のロスなしに腫
瘍核を回収した。

細胞体原形質の！り染および後続の酵素抽出を阻害する
１ＩｌＮ！瘍核の脂質を減少させるために、トリトンＸ
−１００の洗浄が必要であった。ＤＮＡの回収率は肝臓
腫瘍１ｇ当り１．２　ｍｇ　ＤＮＡであった。

精製した核を　５０ｍＭ）リス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣ：ｌ
　（ｐＨ：８．８）、ｌ　ｍＷ　８ｇＣＩ２．０．１　
ｍ１４　ＥＤＴＡ　、　２　ｍＭジチオトレイトール（
ＤＴＴ）、　　５０　ｍＭ　ＫＣｌ、１０．５　ａ＋Ｍ
フｚニルメチルスルフォニルフルオライドおよび４０％
（ｖ／ｖ）グリセリンを含有するアルカリ性緩衝液に懸
濁させた　（１ｍｌ／ｇ原組＃ｌｉ）　、懸濁液をプラ
ンソン、ｔ！１音波粉砕機で、１５秒の最大出力で、核
が完全に破砕されたことを監視しながら粉砕した（約８
０秒間）。グリセリンを含まない超音波粉砕緩衝液を添
加することによって、懸濁液を２０χ（マハ）グリセリ
ンになるよう稀釈した。次に抽出物を固体（ＮＨ４）２
Ｓ０４　（０，４２ｇ／ｍｌ）　ニＪ：　ツテ沈’Ｆ９
　サセ、４５分間撹拌し、８０，０００Ｘｇで４０分間
遠心分敲した。更に、　５０　ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ
　（ｐＨ：？Ｊ）、２５％　（ｖハ）グリセリン、５　
ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０
．５　ｍＭジチオトレイトールを含有する緩衝液（緩衝
液工）に沈Ｖを再懸濁させた。この懸濁液を２部の同一
の緩衝液によって夜通し透析した。この鼾濁液を次に８
０，０００Ｘｇで４０分間遠心分離した。

得られた粘稠なペレットを緩衝液Ｉ中に再懸濁させ（０
，［ｌ　ｍｌ／ｇ）、３０秒間超音波粉砕し上記のよう
にして再度遠心分離した。遠心分離で得られた両方の上
澄みを一緒にしてイオン交換クロマトグラフィーにかけ
た。この低−塩分抽出法は、蛋白質と共に沈Ｃするクロ
マチンの再抽出が続き、活性のロスなしに最良の酵素収
率を与える。

［ＤＥＡＥ−セファデッタスクロマトグラフイ−３１０
ｍＭの（ＮＨ４）２５０４を含有するＲ衝ｍｌ中であら
かしめ平衡化したＤＥＡＥ−セフ、デツクスＡ、２５の
カラム（１，３−１，６ｍｌゲル／ｇ組織）に抽出した
酵素を供給した６カラムベツドの容積の！　、５４Ｂ　
’Ａ：の前記１０　ｍＭの（ＮＨ４）２Ｓ０４を含有す
る緩衝液■を用いて洗浄した後、カラムヘット容積の２
倍量の０．１　＋（、ＮＨ４）２５０４を含有する緩衝
液Ｉを用いて酵素を溶出した。酵素を含有する区分を集
め一緒にして、５０　ａ＋Ｍ　）　’）　ス’−ＨＣｌ
　（ｐＨ：　７．９）、３０Ｘ　（ｖ＃）　り’　！ｊ
　セリン、　０．１　ｆｆ１Ｍ　ＥＤＴＡおよび０．５
　ｍＭジチオトレイトールを含有する緩衝液（緩衝液Ｉ
Ｉ）によって夜通し透析した。

［ＤＮＡ−セルロースクロマトグラフイーコ集めたフラ
クションを５０ｍ１ｌトリス−ＨＣｌ　（ｐ）ｌニア、
９）および０．５　ｍＭジチオトレイトールを含有する
緩衝液を用いて稀釈し、グリセリンの最終濃度を１５％
（ｖ／ｖ）に誠した。稀釈サンプルはＤＮＡ−セルデー
スカラムに供給した。このカラムは、あらかしめ５　ｍ
ＨのＮａＣｌを含む緩衝液ｍ（グリセリン濃度を１５％
（マハ）に城した他は緩衝液工と同一である）によって
平衡化した。同緩衝液で洗浄した後、カラムへ、ト容植
の　１．５倍量の０．５６　ＭのＮａＣｌを含有する緩
Ｗ！１液ｍで酵素を溶出した。次に酵素を含むフラクシ
ョンを集めた。

［ヘパリン−セファ゛ロースクロマトグラフィー］１　
　　集めたフラクションを２５％（Ｖハ）グリセリン濃
度に調整し、更に適９．の３．ＯＭ　ＮＨ４Ｃ：ｌを加
えて塩濃度を０．３Ｍに調整した。０．３　Ｍ　Ｎ８４
ＣＩ　を含む緩衝液■中で平衡化したヘパリン−セファ
ロースカラムにサンプルを直ちに供給した。カラムへ・
ント容稙の２倍量の０．３　Ｍ　Ｎ）１４ｃｌ含有緩衝
液ｌによって洗浄した後、カラムベッド容積の３倍量の
ＩＭＮＨ４Ｃ：ｌを含む緩衝液Ｉによって酵素を溶出し
た。

次に酵素を含むフラクションを集め合一した。

［シュークロース濃度勾配遠心分離］ 集めたフラクションを、０．３８　ＫＣＩを含む緩衝液
工　（但しＥＤＴＡを含まない）で、真空下で夜通し透
析した。遠心分離の３時間前に、透析用緩種１液を、５
％　（ｗ／ｖ）のシュークロースを含む緩衝液■（５０
ｌ１１Ｍ　ト　リ　ス　−ＭＣＩ　　（ＰＨ４７，９）
、　５　　ｍＭ　　ＭｇＣｌ２゜０．３　Ｍ　ＭＣＩ　
、　０．５　ｍＭ　ＤＴＴ、および０．５　ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール）に変え、透析した酵素（０，８−
１，０ｍｌ）を、緩衝液■で調製ＬりｌＯ＄−３０％　
（ｗ／ｖ）のシュークロース濃度勾配層（３２ｍｌ）の
上に重ね更に２％　（ｗ／マ）のシュークロースを含む
緩衝液■を１　ｍ１重ね、デュポンＴＶ　８５０縦型ロ
ーターを使用して、４℃、４９．００Ｏｒｐｍで４時間
遠心分離した。

ＲＮＡボリメラーセ■は、均質な状態で段階１８Ｓから
回収され、その状態で定常的に使用された。

［ゲル電気泳動（非変性状態）］ 純度を確認するために、ＲＮＡボリメラーゼエを減圧下
テ５０ＩｏＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ＋　７．８）、２
５％グリセリフ、　５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．０１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５　ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１
５　Ｍ　ＫＣＩの溶液により透析を行ない、電匁体動の
準備をした。電気体動は５０ｍＭトリス−）Ｉｃ＋、　
０．２　Ｍグリシ７．１０％グリセリン、０．１　ｍＭ
ＤＴＴおよびｌ　ｍＭチオグリセリンの溶液を用い、線
状ポリアクリルアミド（２−１１３％）スラブゲル上で
、４°Ｃ１？ＯＶにおいて６時間行なった。精製した酵
素は次にゲルから溶出した。

実施例２ 本実施例においては、ＲＮＡポリメラーセ■のサブユニ
、トの分離について説明する。

実施例１のシュークローズ濃度勾配遠心分離によって調
製したＲＮＡポリメラーゼＩを、ロース（Ｒｏｓｅ）ノ
方法（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２５４：　Ｉ
Ｑ、２５Ｂ−２８１（＋９７！３））Ｌ：　ヨッテ変性
し、ソシテ線状（２−１０％）ポリアクリルアミドの勾
配ゲル板（８Ｘ　７．５Ｘ　Ｏ，３ｃｍ）に１．５　ｍ
ｇ酵素／ゲルの速度で供給した。変性した酵素は、レム
リ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７７：　８
８０−６８５　（＋９７０））が記載した変性条件に従
って電気泳動を行なった。電気泳動は、＋２５Ｖ、　２
０ｍＡｍｐでトラ２キング染料かゲルの端部へ至るまで
行なった。

ゲルは　８Ｘ　Ｏ，０２ｃｍの片にスライスし、３ｍｌ
の２　ｍＭＥＤＴＡ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１，４Ｍ尿素
および０．Ｉ　Ｍ　ＤＴＴを含む　１１０１ｎトリス−
ＨＣｌ　（ｐＨ：　７．０）１衝液中に、２５°Ｃで２
時間保持した。スライスは緩衝液Ａ（実施例３参照）中
で洗浄し、ホモジナイズし、８ｍｌの緩衝液Ａ中で４°
Ｃで保持した。その−後、ホモジナイズしたスライスを
１２，０００％ｇで遠心分離してペレット化し、各サブ
ユニットを含む上澄みフラクションを集めた。

実施例３ 本実施例はＲＮＡポリメラーセエおよび抗−ＲＮＡポリ
メラーゼエ抗体コンプレックスの殻ある検出法の中の１
つを説明する。実施例１においてネズミ腫瘍（モーリス
ヘパトーマ３９２４Ａ）の分離核から精製したＲＮＡポ
リメラーゼＩを、２５　ｍＭ　リン酸カルシウム（ｐＨ
：　７．５）　、　１５０　ｍＭ　Ｎａ１ｌおよび０．
０１％（ｖ／ｖ）　ＮａＮ３からなる緩せｉ液Ａで、蛋
白質の最終濃度が２０　ｊＬ　ｇ／ｍｌになるように稀
釈した。稀釈した酵素（１００ｇ＋）を　４００ｋｌの
平底容器（リム−／＼つ工ルストリンプス（Ｒｅｍｏｖ
ａｖｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ）　、米国［］ｙｎａｔｅｃ
ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、製）に入れ
た。湿潤させ、かつ、緩やかに振盪して、３７°Ｃで３
時間反応させた後、溶液を除去し、容器を緩衝液Ａ（４
Ｘ　　１ｏＯｐｌ）で洗浄した。次に、１％　（ｗ／ｖ
）のウシ血ＩＩ−アルブミンを含む緩衝液Ａ　（１５ｉ
　１）を各容器に入れ、振盪台の上で室温で１時間反応
させた。

アルブミン含有緩衝液を除去した後、緩衝液Ｂ［５０ｍ
Ｍ　　ト　リ　ス　−ＨＣＩ　　　（ｐＨ：　　７．４
）、　　１５０＋ＩＭ　　ＮａＣ１，５ｍＷＥＤＴＡ、
０．０５％　（Ｗ／ｖ）　　ノニデント（ｎｏｎｉｄｅ
ｔ）　Ｐ−４０゜および０．１　［ＩＭフェニルメチル
スルフォニルフルオライド］で１／１０に稀釈した１０
０ｇ１の人またはウサキの血清を添加した。そして容器
を室温で１時間および４°Ｃで１６時間保持した。次に
、血清を除去し、容器を緩衝液Ｂ（４Ｘ　　１００用１
）および緩衝液Ｂ中の１２５Ｉ−ラヘル蛋白質Ａ　（Ｓ
ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ；　３０ｐＣ
ｉ／　μｇ）を各容器へ加えた（ｌｏＯｐｌ／容器；　
０．０１ルＧｉ／容器）。室温で２時間反応させた後、
　＋２５　Ｉ−蛋白質Ａの溶液を除去し　１００ｇ１の
５ＨＰｊ液Ｃ［５０＋ｏＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ：　
７．４）、１．０ＭＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　
０．４％（ｗ／ｖ）　Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１
　ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオ＋２５ ライド］で容器を４回洗浄した。　　　■−蛋白質Ａの
結合を次にカンマ−カウンターで定植した。

酵素の存在しない状態で調製した容器を対照として使用
した。酵素なしで得られた各血清の値を、酵素が存在す
る場合の値から差引いた（補正ｃｐｍ）。

実施例４ 本実施例は、試料血清とＲＮＡポリメラーセエサブユニ
ントとの反応を説明する。ネズミ肝臓腫瘍のＲＮＡポリ
メラーゼ■を精製した。実施例２のようにして分離した
サブユニットを、実施例３における固相放射線免疫分析
（ＲＩＡ）の各抗原として用いた。第２表に示す結果は
複数の測定値の乎均値である。

同相放射線免疫分析（ＲＩＡ）における血清とＲＮＡポ
リラーゼＩボｌパブチドとの反応（杓ＲＮＡポリメラー
セエポリペプチトとの反応（ｃｐｍ）被験者　診断　　
　ＳＩ　　　　Ｓ２　　　５３Ｓ４　　　　Ｓ５　　　
　ＳＳＣ，Ｋ、　　正常　　　　ｏｏｏｏｏ。

Ｓ、Ｂ、　　Ｍ（：ＴＤ　　　　　Ｏ０７，９５４４，
２２１２０，５４９０Ｍ、Ｂ、　　ＭＣ：ＴＤ　　　　
　　ＯＱ　　？、０８３　２，３１４２２．７９８　　
　０Ｅ、Ｄ、ＲＡ　　　　　　Ｏ０５，３５８０００Ｅ
、に、ＲＡ　　　　　　ＯＯ６２８０００Ｊ、Ｅ、ＲＡ
　　　　　　０　　　０　　５０７　　　０　　　０　
　　０Ｄ、Ｓ、　　ＳＬＥ　　　　　　ＯＯＢ、７０４
　　　０　１２，５８０　　　０Ｈ，Ｓ、　　　　ＳＬ
Ｅ　　　　　　　　　　　Ｏ３，８４８５，３５８０４
１８ＯＡ、Ｓ、　　ＳＬＥ　　　　　　０　２，２１０
　　＋’、８４４　　　０　　　０　　　０Ｓ、Ｓ、　
　ＳＬＥ　　　　　　０　３，２＋２　２．３３２　　
　０　４．０７６　　　０第２表の一注（辛） ＲＮＡポリメラーゼ１で免疫化されたネズミの血清は、
どのゲルスライスがポリメラーゼボ１ノペプチドを含む
かを調べるために使用した。これらの結果は酵素を含有
する平行ゲルトランクをクマシーブルーで染色すること
により確認した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）リューマチ性疾病の患者の血清を、電気泳動によ
   り精製した核蛋白質抗原と反応させ、生成する抗原−抗
   体コンプレックスを検出することによって、血清中の抗
   体を同定することからなるリューマチ性疾病の診断方法
   。 （２）前記蛋白質抗原は精製ＲＮＡポリメラーゼエ、　
   　である特許請求の範囲第１項に記載のリューマチ性疾
   病の診断方法。 （３）以下の工程からなる特許請求の範囲第１項または
   第２項に記載のリューマチ性疾病の診断方法、 （ａ）固体支持体上にｉ＆置した精製した核蛋白質抗原
   を、前記抗体を含む血清と共に、充分な時間反応させ、
   特定の抗原−抗体コンプレックスを生成する； （ｂ）前記コンプレックスを分析指示薬と充分な時間反
   応させて、抗原と抗体と分析指示薬との三元コンプレッ
   クスを生成して未反応の血清を除去した後、前記抗原−
   抗体コンプレックスの存在を検出し、 （ｃ）　ｊｉｉｊ記三元コンブレンクス中の抗体の量に
   比例するコンプレックス化した分析指示薬の量を測定す
   る。 （４）前記精製蛋白質は、電気泳動により精製したＲＮ
   ＡポリメラーゼＩ酵素である特許請求の範囲第１項から
   第３項のいずれかに記載のリューマチ性疾病の診断方法
   。 （５）前記蛋白質の原料は１人間、哺乳動物、非咄乳類
   を推動物の細胞である特許請求の範囲第１項から第４項
   のいずれかに記載のリューマチ性疾病の診断方法。 （６）前記細胞は、臓器１組織、腫瘍、細胞線、組織片
   培地あるいは遺伝学的合成化合物から得たものである特
   許請求の範囲第５項に記載のリューマチ性疾病の診断方
   法。 （７）前記分析指示薬は、フルオレセイン−、フエリチ
   ン−１酵素−あるいは放射性−ラベル抗−人間抗体、酵
   素結合イムノソルベント試薬（ＥＬＩＳＡ）　、放射性
   ラベルイムノグロブリン結合蛋白質、あるいはビオチオ
   ン化ストレプトアビジンあるいはアビジン結合免疫試薬
   からなる群から選択されたものである特許請求の範囲第
   １項から第６項のいずれかに記載のリューマチ性疾病の
   診断方法。 （８）前記試薬は、黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙ　
   １ｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）からの１２５Ｉ−
   蛋白質Ａである特許請求の範囲第７項に記載のリューマ
   チ性疾病の診断方法。 （９）前記血清は、ＳＬＥ患者またはＭＣＴＤ患者から
   得たものである特許請求の範囲第１項から第８項のいず
   れかに記載のリューマチ性疾病の診断方法。 （１０）以下の要素からなるリューマチ性疾病の分別的
   診断用試験キット、 （ａ）前記疾病患者の血清中の抗体と反応して抗体−抗
   原コンプレックスを生成する精製核蛋白質抗（ｂ）前記
   抗体−抗原コンプレックス用の分析指示薬。 （ｌ　ｌ）前記要素に、抗体−抗原コンプレックスを生
   成するための緩衝液を加えてなる特許請求の範囲第１０
   項に記載のリューマチ性疾病の分別的診断用試験キット
   。 （１２）前記蛋白質抗原は、変性あるいは未変性の精製
   ＲＮＡポリメラーセエ酵素である特許請求の範囲第１Ｏ
   項または第１１項に記載のリューマチ性疾病の分別的診
   断用試験子ント。 （１３）前記分析指示薬は、フルオレセイン−、フェリ
   チン−１酵素−あるいは放射性−ラベル抗−人間抗体、
   酵素結合イムノンルヘント試薬（ＥＬ　ｌ５Ａ）、放射
   性ラヘルイムノグロプリン結合蛋白質、あるいはビオチ
   オン化ストレプトアビジンあるいはアビジン結合免疫試
   薬のうちのいずれか１つである特許請求の範囲第１０項
   から第１２項のいずれかに記載のリューマチ性疾病の分
   別的診断用試験キット。 （１４）前記試薬は黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙ　
   Ｉｏ−ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）からノ１２５Ｉ−
   蛋白質Ａである特許請求の範囲第１３項に記載のリュー
   マチ性疾病の分別的診断用試験キット。