DK159296B - Fremgangsmaade og proeveudstyr til diagnosticering af reumatologiske sygdomme - Google Patents

Description

i

DK 159296 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde og et udstyr indeholdende materialer til diagnosticering af sygdom og angår især en fremgangsmåde til differentieret diagnose af forskellige reumatologiske sygdomme, som er karak-5 teristiske ved tilstedeværelse af autoimmune komponenter.

Autoimmune sygdomme kan klassificeres i to brede kategorier: Systemiske og organspecifikke sygdomme. Inden for den systemiske kategori er der blevet identificeret en gruppe sygdomme, der kaldes reumatiske sygdomme. Denne gruppe indbe-10 fatter systemisk Lupus erythematosus (SLE), reumatoid ar- tritis (RA) og blandet bindevævssygdom (MCTD). På grund af den systemiske karakter af disse sygdomme er patienter, der lider af en af de tre sygdomme, tilbøjelige til at frembyde de samme kliniske symptomer, i det mindste i de indledende 15 stadier. Skelnen mellem disse sygdomme er derfor ofte ret vanskelig. En bedømmelsesprøve, der kunne give en tidlig diagnose og sondren mellem SLE, RA og MCTD, ville derfor klart være nyttig.

Historisk indebar diagnose af SLE, blandt andre kriterier, 20 identifikation af Lupus erythematosus(LE)-cellen. Denne celle, som er en polymorf-nuclear leukocyt, er karakteristisk ved tilstedeværelse af en stor amorf inklusion, der i almindelighed antages at omfatte det nucleare indhold af en anden af patientens egne hvide blodceller. En prøve baseret på 25 dette kriterium er langt fra afgørende, for selv om tæt ved 80% af SLE-patienter har LE-cellen, har mere end 70% af mennesker, der er "LE-celle-positive", ikke SLE.

Fremkomsten af immunofluorescensteknikken muliggjorde identifikation af en gruppe autoantistoffer, som regelmæssigt 30 blev sat i forbindelse med SLE. Disse autostoffer havde som deres mål kernerne i patientens egne celler og blev kendt som 2

DK 159296 B

antinucleare antistoffer (ANA). Uheldigvis var det sådan, at selv om 100S af SLE-patienterne udviste ANA, gjorde 100% af RA- og MCTD-patienterne det også.

Denne manglende specificitet er ikke overraskende, når man 5 ser på de mange forskellige antigene mål, som eksisterer i kernen. I SLE alene er der blevet identificeret autoantistoffer mod sådanne nucleare komponenter som nucleoprotein, nuclear glycoprotein, dobbeltstrenget DNA (dsDNA), enkelt-strenget DNA (ssDNA), dobbeltstrenget RNA (dsRNA), enkelt-10 strenget RNA (ssRNA), polynucleotider og en gruppe antigener, der er kendt som ekstraherbare nucleare antigener (ENA).

Selv om molekularidentiteterne af nogle af de nucleare antigener er kendt, 'f.eks. DNA: (L.E.Adams m.fl., Amer.J.of Clin. Patn.77 (1), 54-59 (1982)), RNA: (M.R.Lerner m.fl., Science, 15 bind 211, 400-402 (1981)) og histoner: (A.Aitkaci m.fl., J.

Immun.Meth. 44, 311-322 (1981)), er størstedelen kun defineret ved deres immunologiske eller fysisk-kemiske egenskaber. Identifikation af disse antigener som proteiner med specifikke cellefunktioner kunne føre til belysning af ætiologien 20 i de autoimmune sygdomme og til en fremgangsmåde til differentieret diagnose af sygdommene.

For tiden er størstedelen af diagnostiske prøver til reumatologiske sygdomme, såsom SLE, baseret på identifikation af autoantistoffer for DNA. For eksempel: 25 Amerikansk patent nr. 4.234.563 beskriver en fremgangsmåde til påvisning af antistoffer i SLE-patienter, som er rettet mod DNA. DNAet konjugeres med methyleret okseserumalbumin (mBSA), der er reageret med en serumprøve, og vises så ved en velkendt fluorescerende antiglobulin-metode. Ved at ændre 30 antigenet fra DNA til en tymisk ekstrakt opstilles der krav på påvisning af antistoffer for ekstraherbart nucleart anti- 3

DK 159296 B

gen (ENA). Disse ENAer identificeres ikke som sådanne, og de beskrevne prøver for SLE kunne ikke anvendes til at påvise MCTD eller omvendt.

Amerikansk patent nr. 3.897.212 beskriver en direkte radio-5 immunbestemmelse for antistoffer for DNA i SLE-patienter ved at bringe en serumprøve til at reagere med radioaktivt mærket DNA og måle mængden af radioaktivitet i et bundfald af DNAet og prøveserum.

Amerikansk patent nr. 3.997.657 beskriver en tør glasplade-10 teknik til påvisning af human antinuclear faktor. Fremgangsmåden indebærer reaktion af prøveserumet med en tymuscelle-ekstrakt, der forud var blevet fikseret på et objektglas, efterfulgt af en immunofluorescensbestemmelse. Der blev ikke gjort noget forsøg på at identificere nogen komponenter 15 af ekstrakten.

Amerikansk patent nr. 4.314.987 beskriver en fremgangsmåde til at diagnosticere reumatologiske sygdomme baseret på fluorescensmønstre (d.v.s. homogen rand, plettet, nucleolar etc.) af antinucleare antistoffer, efterfulgt af afprøvning for 20 anti-DNA- eller anti-ENA-antistoffer. Selv om det hævdes, at der kan skelnes mellem SLE og MCTD, angiver patentet i det væsentlige en strategi til udførelse og fortolkning af allerede eksisterende prøver og er som sådant begrænset i nøjagtighed af prøverne selv. Endvidere anføres ingen data, 25 der ville gøre det muligt for en fagmand at bedømme virkningsgraden af en sådan fremgangsmåde. 1 modsætning til den i amerikansk patent nr. 4.314.987 givne lære,hvori nucleolare mønstre af fluorescens blev anset for at være ubestemte,gav selve eksistensen af en sådan nuc-30 leolar fluorescens (J.L.Pinnas m.fl., J.of Immunol. Ill (4), 996-1004 (1973)) stødet til de undersøgelser, som den

DK 159296 B

4 foreliggende opfindelse er baseret på.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en fremgangsmåde til at skelne mellem reumatologiske sygdomme såsom systemisk Lupus erythematosus (SLE) og blandet binde-5 vævssygdomme (MCTD) ved at analysere en undergruppe af autoantistoffer, der rutinemæssigt sættes i forbindelse med disse sygdomme , og et prøveudstyr til brug ved denne fremgangsmåde. Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge krav 7 og prøveudstyret ifølge krav 1. Autoantistofferne identificeres ved at bringe serum fra en patient med SLE eller MCDT til at reagere med et højt renset enzym af nuclear oprindelse i dets native (holoenzym) eller denaturerede (underenhed) form. Enzymet (eller dets underenheder) tjener som det antigene mål for et hvilket som helst enzym-15 specifikt antistof, der kan eksistere i prøveseraene.

Antigen-antistof-komplekset afsløres ved tilsætning af et hvilket som helst af mange forskellige analytisk indicer-bare reagenser. For at lette tilsætningen og fjernelse af prøvereagenserne udføres prøven på en fastfasemetode.

20 Ved at iagttage det specifikke reaktionsmønster af antistoffer i prøveserumet med forskellige enzymunderenheder kan der således foretages en hurtig, nøjagtig differentieret diagnose af SLE eller MCTD.

Til dato har der ikke været nogen enkelt pålidelig serologisk 25 teknik, der var i stand til at skelne mellem forskellige reumatiske autoimmune sygdomme. Det er hovedformålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en sådan metode. Det er yderligere formålet med opfindelsen, at den skal være egnet til udformning som et diagnostisk prøveudstyr, og at 30 prøven kan udføres billigt og let i et klinisk laboratorium. 1 sin foretrukne udførelsesform omfatter opfindelsen følgende komponenter: 5

DK 159296B

A. Renset RNA-polymerase I.

RNA-polymeraser er enzymer, der katalyserer transskriptionen af DNA til RNA og ville forventes at være blandt de mange proteiner i de nucleare ekstrakter, der anvendes som kilde 5 til ekstraherbare nucleare antigener (ENA). Da antinucleolare antistoffer er blevet angivet at forekomme i sera hos individer med SLE (se J.L.Pinnas m.fl. supra), blev RNA-polyme-rase I, en specifik RNA-polymerase af nucleolar oprindelse, valgt til at være det antigene mål for en undergruppe af 10 de nævnte antinucleolare antistoffer.

Anti-RNA-polymerase I antistoffer blev påvist i 100S af patienter med SLE og kunne ikke påvises i 100% af normale patienter. Anti-RNA-polymerase antistoffer blev også påvist i 100% af MCTD-patienter og i 78% af reumatoide artritis-patien-15 ter.

Fordi RNA-polymerase I er et komplekst enzym, d.v.s. at enzymet er sammensat af otte forskellige polypeptider betegnet som Sl(Mr=190.000), S2(Mr=120.000),S3(Mr=65.000), S4(M =42.000), S5 (M =25.000}, S6 (M =21.000) , S7 (M =19.000) og 3^ ^ * i 20 S8(Mr=18.000), blev der imidlertid udviklet en fremgangsmåde til at bestemme, hvilket af disse polypeptider, der er indeholdt i mål-antigenet. Selv om specificiteten af anti-RNA-polymerase I antistofferne varierede fra patient til patient med hensyn til de individuelle polypeptider i enzymet, blev 25 der overraskende iagttaget tydelige mønstre af antistof- polypeptid-reaktioner med hver type reumatisk sygdom (se tabel 1) .

6

DK 159296B

TABEL 1.

• cl)

Reaktion af patienters sera med RNA-polymerase I polypeptider .

Antistoffer rettet mod RNA-polymerase I polypeptider

Patient Diagnose S2 S3 S4 S5 V.S. RA + 5 E.D. RA + E.K. RA + J.E. RA - + - - 5.5. RA + D.S. SLE - + - + 10 V.D. SLE + + - + H. S. SLE + + — + A.S. SLE + + — — D.G. SLE + + - - S. S. SLE + + — + 15 D.L. SLE + + 1.5. MCTD + + C.C. MCTD - - + - S.B. MCTD - + + + M.B. MCTD - + + + 20 a) De individuelle polypeptider i RNA-polymerase I blev adskilt ved polyacrylamidgel-elektroforese under denaturerende betingelser og anvendt som antigenerne i en fast-fase-radioimmunbestemmelse med sera fra patienter, som tidligere var bestemt at have anti-RNA-polymerase I anti-25 stoffer. Et plus (+) og et minus (-) viser, at antistoffer ne rettet mod det pågældende polypeptid henholdsvis blev påvist og ikke påvist.

7

DK 159296B

Mere bestemt viste sera fra RA-patienter sig at indeholde antistoffer rettet kun mod S3-polypeptider i RNA-polymerase I. I modsætning hertil havde SLE-patienter antistoffer, som reagerede med S2 og/eller S5 foruden med S3. Hverken RA-5 eller SLE-patienter havde anti-S4-antistoffer. Antistoffer rettet mod S4 var karakteristiske for sera fra MCTD-patrenter, der også indeholdt anti-S3- og -S5-antistoffer i nogle tilfælde. Disse kontrasterende reaktionsmønstre med specifikke underenheder muliggør differentieret diagnose af SLE og 10 MCTD.

Selv om kilden til det rensede enzym var fra isolerede kerner fra en rottetumor (Morris hepatoma 3924A), gav rotteenzymet et funktionerende mål for de humane antistoffer på grund af den fylogenetiske bevarelse af RNA-polymeraser fra højere 15 eukaryoter.

På grund af denne bevarelse skal rotteenzymet endvidere ikke forstås som den eneste kilde til målmateriale. Mange kilder er mulige, herunder: humane, fra pattedyr eller hvirveldyr der står lavere end pattedyr, organer, tumorer, vævskultur 20 eller cellelinier deraf eller genetisk manipulerede kimærer indeholdende generne for de individuelle RNA-polymerase I underenheder.

B. Analytisk indicerbare reagenser.

Når først prøveserumet er blandet med målantigenerne, må der 25 vises eksistensen af en antigen-antistof-reaktion. Mange forskellige reagenser kendes til dette formål, og de er alle forenelige med den foreliggende opfindelse. Til illustrationsformål men uden at begrænse opfindelsen indbefatter de: dobbelt-antistofteknik under anvendelse af fluorescens-, 30 enzym-, ferritin- eller radioaktivt mærkede anti-humane anti- 8

DK 159296 B

125 stoffer, I-/eller lignende radioaktivt mærket protein A fra Staphylococcus aureus, enzymbundet immunbestemmelse (ELISA) eller biotioniseret/streptavidin- eller-avidin-bundne immunbestemmelser.

5 C. Stødpuder og vaskeopløsninger.

Da bestemmelsen indebærer tilsætning i rækkefølge af reaktionsdeltagerne, er et system af stødpuder for at stabilisere komponenterne og fjerne ureageret materiale nødvendig. Det er klart, at mange modifikationer og variationer af stødpude- 10 systemer er mulige. Et sådant system er beskrevet i de følgende eksempler, men det vil forstås, at opfindelsens omfang ikke skal være begrænset til de deri beskrevne enkeltheder.

Por at opsummere kan prøven for anti-RNA-polymerase I antistoffer udføres og fortolkes som følger: 15 1) En patients serum afprøves over for ikke-denatureret RNA-polymerase I. Hvis prøven er negativ, har individet hverken SLE eller MCTD. Hvis prøven er positiv, kan patienten have SLE, MCTD eller RA, og den anden del af prøven udføres.

20 2) En patients serum, som i den første del af prøven blev bestemt at indeholde anti-RNA-polymerase I antistoffer, undersøges så for antistoffer mod hvert separat RNA-poly-merase I polypeptid. Hvis antistoffer mod S4 påvises, er MCTD påvist. Hvis antistoffer mod S3 og S2 og/eller 25 S5 (men ikke S4) findes, er der vist en diagnose for SLE. Hvis der kun er anti-S3-antistoffer til stede, er RA påvist.

9

DK 159296B

Iimtiunobestemraelsen for antistoffer rettet mod RN A-po 1 ymerase I og dens individuelle polypeptider opfylder følgende kriterier, som kræves af en nyttig diagnostisk metode: 1) Prøven er kvalitativ, d.v.s. positiv for patienter med 5 SLE, MCTD og RA, men negativ for sunde individer og pa tienter med cancer. Prøven frembyder således en fordel frem for prøver for ANA og anti-DNA-antistof, da disse anti-DNA-antistoffer også kan findes i cancerpatienter.

2) Prøven er meget specifik og kan skelne mellem SLE, MCTD 10 og RA, en evne, som ingen anden for tiden tilgængelig prøve har.

3) Prøven er kvantitativ og kan således være nyttig til overvågning af sygdommens forløb.

4) Prøven er meget følsom. Femtogram mængder af anti-RNA- 15 polymerase I antistoffer kan påvises. Antistofferne kan således findes i 100% SLE- og MCTD-patienter.

5) Prøven kan forberedes og udføres billigt og kan, i modsætning til LE- og ANA-prøverne, let udføres i kliniske laboratorier, som ikke har nogen specialiseret immunologi- 20 afdeling eller erfaring. LE-celle- og ANA-prøverne er kost bare og tidsrøvende at udføre, hovedsagelig fordi disse prøver kræver en højt uddannet tekniker til at undersøge flere fortyndinger af serum fra hver patient under et mikroskop. Fortolkning af resultaterne er desuden ofte 25 helt subjektive.

EKSEMPEL 1.

Dette eksempel illustrerer en fremgangsmåde til isolering af 10

DK 159296 B

RNA-polymerase I fra en af de mange tilgængelige cellekilder. Isolering af kerner.

Hepatomabærende rotter blev dræbt 28 dage efter implantation af Morris hepatoma 3924A (fordoblingstid 4,4 dage). Tumorer, 5 der var befriet for nekrotisk væv, blev suspenderet i 0,9% NaCl/0,25 M saccharose. Alle fremgangsmåder blev udført i kulden. Tumorerne blev hakket og homogeniseret (to slag med en Teflon-glashomogenisator) i 12 rumfang 2,0 M saccharose indeholdende 0,25 mM spermin og 3,3 mM MgCl^. Homogenatet 10 blev filtreret gennem osteklæde og centrifugeret ved 40.000 x g i 70 minutter. Pillen blev gensuspenderet (1 ml/g originalt væv) i 0,34 M saccharose indeholdende 1 mM MgC^ og 0,3% (v/v) Triton X-100. Suspensionen blev homogeniseret med 1-2 slag i en Bounce homogenisator, henstillet 15 i 5 - 10 minutter ved 4°C og centrifugeret ved 2.000 x g i 5 minutter. Denne metode gav en høj udvinding af tumorkernerne med intet eller ringe tab af enzymaktivitet. Triton X-100-vasken var nødvendig for at formindske den cytoplasmiske forurening og lipidindholdet i tumorkernerne, som generede 20 den følgende ekstraktion af enzymet. Udvindingen af DNA var 1,2 mg DNA pr. g hepatoma.

Ekstraktion af RNA-polymerase.

De rensede kerner blev suspenderet i en alkalisk stødpude (1 ml/g originalt væv) indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 8,9),

25 1 mM MgC^, 0,1 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT) , 50 mM

KC1, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 40% (v/v) glyce= rin. Suspensionen blev sonikeret i et Branson apparat med fuld ydelse i 15 sekunders stød, der styrer til fuldstændig 11

DK 159296 B

nucleart brud (ca. 90 sekunder). Suspensionen blev fortyndet til 20% (v/v) glycerin ved tilsætning af sonikerings-stødpuden uden glycerin. Ekstrakten blev så fældet med fast (NH^^SO^ (0,42 g/ml) , blev omrørt i 45 minutter og 5 centrifugeret ved 80.000 x g i 40 minutter. Bundfaldet blev gensuspenderet (1 ml/g) i stødpude indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 7,9), 25% (v/v) glycerin, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA og 0,5 mM dithiothreitol (stødepude I). Suspensionen blev dialyseret natten over over for 2-1 portioner af samme 10 stødpude. Suspensionen blev så centrifugeret ved 80.000 x g i 40 minutter. De viskose piller blev gensuspenderet i stødpude I (0,6 ml/g), sonikeret i 30 sekunder og recentrifu-geret som ovenfor. De overliggende væsker fra begge centrifugeringer blev forenet og underkastet ionbytningskromatogra-15 fi. Det skal bemærkes, at denne ekstraktionsmetode med lavt saltindhold, efterfulgt af genekstraktion af chromatinet, som var medudfældet med proteinerne, gav maksimale udbytter af enzym med minimalt tab af aktivitet.

DEAE-Sephadex-kromatografi.

20 Det ekstraherede enzym blev påført på en DEAE-Sephadex A- søjle (1,3 - 1,6 ml gel/g væv), der forud var bragt i ligevægt i stødpude I indeholdende 10 mM (NH4) 2SC>4. Efter vask med i.r5 søjleleje-rumfang stødpude I indeholdende 10 mM (NH4)2S04 blev enzymet elueret med 2 søjleleje-rumfang af stødpude I 25 indeholdende 0,1 M (NH4)2S04· Fraktioner indeholdende enzymer blev opsamlet, forenet og dialyseret natten over over for stødpude indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 7,9), 30% (v/v) glycerin, 0,1 mM EDTA og 0,5 mM dithiothreitol (stødpude II).

12

DK 159296 B

DNA-cellulose-kromatografi.

Forenede fraktioner blev fortyndet med stødpude indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 7,9) og 0,5 mM DTT for at reducere gly= cerinen til en endelig koncentration på 15% (v/v). Den for-5 tyndede prøve blev lagt på en DNA-cellulosesøjle, der forud var bragt i ligevægt i stødpude III (samme stødpude som stødpude I mad den undtagelse, at glycerinkoncentrationen var reduceret til 15% (v/v)) indeholdende 5 mM NaCl. Efter vask med samme stødpude blev enzymet elueret med 1,5 leje-rumfang 10 af stødpude III indeholdende 0,56 M NaCl. Fraktioner indeholdende enzymerne blev forenet.

Heparin-Sepharose-kromatografi.

De forenede fraktioner blev bragt op på 25% (v/v) glycerin og indstillet til 0,3 M salt ved tilsætning af den nødvendige 15 mængde 3,0 M NH^Cl. Prøven blev straks påført på heparin-Sepharose-søjle (10,07 ml gel/g hepatoma) bragt i ligevægt i stødpude I indeholdende 0,3 M NH^Cl. Efter vask med 2 lejerumfang af stødpude I indeholdende 0,3 M NH^Cl blev enzymet elueret med 3 leje-rumfang af stødpude I indeholdende 1 M 20 NH^Cl. Fraktioner indeholdende enzym blev opsamlet og forenet.

Saccharose-vægtfylde-centrifugering.

De forenede fraktioner blev dialyseret (under vakuum) natten over over for stødpude I (minus EDTA) indeholdende 0,3 M KC1.

13

DK 1.59296 B

3 timer før centrifugering blev dialysestødpuden ændret til 50 mM tris-HCl (pH 7,9), 5,0 mM MgCl2, 0,3 M KC1, 0,5 mM DTT, og 0,5 mM β-mercaptoethanol (stødpude IV) indeholdende 5% (w/v) saccharose-dialyseret enzym (0,8 - 1,0 ml) blev lagt 5 på 10% - 30% (w/v) saccharosegradient (32 ml), fremstillet i stødpude IV, overlagt med 1 ml stødpude IV indeholdende 2% (w/v) saccharose og centrifugeret i en DuPont TV 850 lodret rotor ved 4°C i 4 timer og 49.000 omdrejninger pr. minut. ENA-polymerase I blev udvundet fra gradienten ved 16S i homo-10 gen tilstand og blev rutinemæssigt anvendt i denne form.

Gel-elektroforese (ikke-denaturerende betingelser).

For at bekræfte renheden blev ENA-polymerase I tilberedt til elektroforese ved dialyse under reduceret tryk over for 50 mM tris-Cl (pH 7,9) , 25% glycerin, 5 mM MgC^/ 0,01 mM 15 EDTA, 0,5 mM DTT og 0,15 M KC1. Elektroforese blev udført på lineær polyacrylamid (2 - 16%) pladegeler ved 70 V i 6 timer ved 4°C i 50 mM tris-0,2 M glycin, 10% glycerin, 0,1 mM DTT, 1 mM thioglycerin. Det rensede enzym blev så elueret af gelen.

20 EKSEMPEL 2.

Dette eksempel illustrerer isoleringen af underenheder af ENA-polymerase I.

ENA-polymerase I, fremkommet ved saccharose-vægtfylde-gradientcentrifugeringen ved fremgangsmåden i eksempel 1, blev 25 denatureret efter fremgangsmåden ifølge Eose (J.Biol.Chem.254, 10, 256-261 (1979)) og anbragt på lineær (2--10%) polyacryl= amid-gradientpladegeler (8 x 7,5 x 0,3 cm) ved 1,5 mg enzym pr. gel. Det denaturerede enzym blev underkastet elektroforese

DK 159296B

14 under denaturerende betingelser som beskrevet af Laemrali (Nature 277, 680-685 (1970)). Elektroforesen blev udført yed 125 volt og 20 mAmp., indtil et sporfarvestof nåede enden af gelerne. Gelerne blev skåret til 8 x 0,02 cm styk-5 ker og inkuberet i 3 ml 10 mM tris-HCl (pH 7,0) stødpude indeholdende 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 4 M urinstof, 0,1 M DTT i 2 timer ved 25°C. Stykkerne blev skyllet i stødpude A (se eksempel 3), homogeniseret og inkuberet ved 4°C i 6 ml stødpude A. Efter inkubering blev de homogeniserede styk-10 ker pelleteret ved 12.000 x g, og de overliggende fraktioner indeholdende de enkelte underenheder blev opsamlet.

EKSEMPEL 3.

Dette eksempel illustrerer én fremgangsmåde af de mange mulige til påvisning af ENA-polymerase I og anti-ENA-polymerase I-15 antistofkomplekser. RNA-polymerase I, renset fra isolerede kerner fra rottetumor (Morris hepatoma 3924A) ifølge eksempel 1, blev fortyndet med stødpude A bestående af 25 mM ka= liumphosphat (pH 7,5) , 150 mM NaCl og 0,01% (w/v) NaN^, således at slutkoncentrationen af protein var 20 fag/ml. For-20 tyndet enzym (100 jul) blev anbragt i 400 ial fladbundede fordybninger (Removawell strips, Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Virginia). Efter inkubation ved 37°C i 3 timer i et fugtigt kammer under forsigtig rystning blev opløsningen fjernet og fordybningerne vasket med stødpude A (4 x 100 «1) . 25 Stødpude A (150 μΐ) indeholdende 1% (w/v) okseserumalbumin blev så anbragt i hver fordybning og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur på rysteplade. Efter fjernelse af den albumin-holdige stødpude blev 100 fil human serum eller kaninserum, fortyndet 1/10 med stødpude B (50 mM tris-HCl (pH 7,4), 30 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) Nonidet P-40, 0,1 mM phe= nylmethylsulfonylfluorid), tilsat, og fordybningerne blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur og i 16 timer ved 4°C.

15

DK 159296 B

Serumet blev fjernet, fordybningerne vasket med stødpude B 125 (4 x 100 All), og I-mærket protein A (Staphylococcus aureus, 30 μ Ci/fag) i stødepude B blev sat til hver fordybning (100 Ail/fo^dykning, 0,01 ;u Ci/fordybning) . Efter inkubation 125 5 i 2 timer ved stuetemperatur blev I-protein A-opløsningen fjernet og fordybningerne vasket fire gange med 100 jul stødpude C (50 mM tris-HCl (pH 7,4), 1,0 M NaCl, 5 mM EDTA, 0,4% (w/v) N-laurylsarcosin, 0,1 mM phenylmethylsulfonylfluorid). 125

Bundet I-protein A blev så kvantificeret i en gamma-tæller. 10 Fordybninger tilberedt i fravær af enzym tjente som kontrol. Værdierne fremkommet med individuelle sera i fravær af enzym blev subtraheret fra værdierne fremkommet ved dets tilstedeværelse (korrigeret cpm).

EKSEMPEL 4.

15 Dette eksempel illustrerer reaktionen af prøveserum med RNA-polymerase I underenheder. Renset rotte-hepatoma RNA-polyme-rase I. Underenheder, isoleret som beskrevet i eksempel 2, blev anvendt som individuelle antigener i fast-fase RIA som i eksempel 3. Resultaterne, der er vist i tabel 2, er middel-20 tallet af to bestemmelser.

16

DK 159296B

TABEL 2.

Reaktion af serum med RNA-polymerase I polypeptider i fast-fase RIA 1.

Reaktion med RNA-polymerase I polypeptid (cpm) .

5 Individ Diagnose Si S2 S3 S4 S5 S6

Kanin 1 - 14,651 6,679 10,121 1,984 1,470. 2,043 C. K. Normal 0 0 0 0 0 0 S.B. MCTD 0 0 7,954 4,221 20,549 0 M.B. MCTD 0 0 7,083 2,314 22,798 0 10 E.D. RA 0 0 5,356 0 0 0 E.K. RA 0 0 626 0 0 0 J.E. RA 0 0 507 0 0 0 D. S. SLE 0 0 6,704 0 12,560 0 H.S. SLE 0 3,648 5,356 0 419 0 15 A.S. SLE 0 2,210 1,644 0 0 0 S.S. SLE 0 3,212 2,332 0 4,076 0

Serum fra en kanin, som var blevet immuniseret med RNA-polymerase I, blev anvendt til at bestemme, hvilke gelstykker, der indeholdt polymerase polypeptider. Disse 20 resultater blev bekræftet ved at farve et parallelt gel spor indeholdende enzymet med Coomassie blåt.

Claims (16)

1. Prøveudstyr til differentieret diagnose af reumatologiske sygdomme, kendetegnet ved, at det omfatter (a) renset RNA-polymerase I som antigen, der er i stand 5 til at reagere med antistoffer forbundet med sygdommene i serum fra patienter til dannelse af et antistof-antigen-kompleks, og (b) et analytisk indicerbart reagens for antistof-antigen-komplekset.

2. Prøveudstyr ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det som antigen omfatter RNA-polymerase I i naturlig form til brug i en ikke-diskriminerende diagnostisk prøve.

3. Prøveudstyr ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det som antigen omfatter polypeptiderne s^r Sg, 15 og Sjj af en denatureret RNA-polymerase I til brug i en differentieret diagnostisk prøve.

4. Prøveudstyr ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter stødpuder for dannelsen af antistof- antigen-komplekset .

5. Prøveudstyr ifølge krav 1- 4, kendetegnet ved, at det analytisk indicerbare reagens er et af følgende: fluorescein-, ferritin-, enzym- eller radioaktivt mærkede anti-humane antistoffer, enzym og substrat som elementer af en ELISA, radioaktivt mærkede immunoglobulinbindende prote-25 iner eller biotin-streptavidin eller biotin-avidin. DK 159296 B

6. Prøveudstyr ifølge krav 5, kendetegnet ved, 125 at reagenset er I-protein A fra Staphylococcus aureus.

7. Fremgangsmåde til diagnosticering af reumatologiske sygdomme in vitro, kendetegnet ved identificering 5 af antistoffer forbundet med disse sygdomme i serum fra patienter ved reaktion af serumet med elektroforetisk ren RNA-polymerase I som antigen og påvisning af det fremkomne antigen-antistof-kompleks.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, 10 at RNA-polymerasen er i naturlig form.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at RNA-polymerasen er denatureret i form af SS^, pg S5 polypeptider.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7-9, kendetegnet 15 ved, at den omfatter følgende trin: (a) inkubering af en renset RNA-polymerase I i naturlig eller denatureret form som antigen, hvilken polymerase er understøttet på en fast bærer, med serum indeholdende antistofferne i tilstrækkelig lang tid til dannelse af et spe- 20 cifikt antigen-antistof-kompleks, (b) bestemmelse af tilstedeværelsen af antigen-antistof-komplekset efter fjernelse af ureageret serum derfra ved in-kubering af komplekset med et analytisk indicerbart reagens i tilstrækkelig tid til at danne et tertiært kompleks sammen-25 sat af antigen, antistof og analytisk indicerbart reagens og (c) bestemmelse af mængden af analytisk indicerbart reagens i det tertiære kompleks, hvilket kompleksbundne reagens er proportionalt med mængden af antistof i komplekset. DK 159296B

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7-10, kendetegnet ved, at polymerasen er elektroforetisk rent RNA-polymerase I enzym.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 7-11, kendetegnet 5 ved, at kilderne til proteasen er celler valgt af gruppen omfattende humane celler, pattedyrceller eller celler fra hvirveldyr, der ikke er pattedyr.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at cellerne fås fra organer, væv, tumorer, cellelinier, vævs- 10 kultur eller genetisk manipulerede kimærer.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 7-13, kendetegnet ved, at det analytisk indicerbare reagens er valgt af gruppen omfattende fluorescein-, ferritin-, enzym- eller radioaktivt 15 mærkede anti-humane antistoffer, enzym og substrat som elementer af en ELISA, radioaktivt mærkede immunoglobulin-bindende proteiner eller biotin-streptavidin eller biotin-avidin.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, 125 20 at reagenset er I-protein A fra Staphylococcus aureus.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 7-15, kendetegnet ved, at serumet er fra en patient med systemisk Lupus erythematosus (SLE) eller blandet bindevævssygdom (MCTD).