ES2217541T3 - Diagnostico de anormalidades en celulas epiteliales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de diagnosis de tumores epiteliales sólidos u otras anormalidades tales como colitis rectal, que comprende separar por tamaños el estroma de las células epiteliales, separar las células epiteliales de la mayor parte de los demás tejidos aún presentes, por reacción del tejido con un anticuerpo monoclonal específico para las células epiteliales, recoger las células que han reaccionado unidas al anticuerpo y liberarlas del anticuerpo, con lo que la muestra contiene al menos un 90 por ciento de células epiteliales en volumen de tejido total de la muestra y comparar al menos una característica fenotípica o genotípica de la muestra con células epiteliales normales correspondientes.

Description

Diagnóstico de anormalidades en células epiteliales.

Antecedentes de la invención 1. Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico de tumores y otras anormalidades de células del cuerpo humano.

2. Descripción de técnicas relacionadas

Existe la necesidad de conseguir métodos perfeccionados para el diagnóstico de tumores, en particular para determinar si existe enfermedad residual después de haber realizado cirugía o terapia. Esto es particularmente necesario para detectar metástasis. La presente invención se refiere específicamente a tumores epiteliales y otras anormalidades de las células epiteliales. El término "diagnóstico" utilizado en esta descripción incluye la obtención de cualquier tipo de información relativa a la existencia de un tumor o estado del mismo u otras anormalidades, e incluye prognosis.

En la clínica práctica, el sistema TNM (metástasis de nodo tumoral), "TNM classification of malignant tumours" ("Clasificación TNM de tumores malignos"), UICC, Springer, Berlín (1992), ofrece todavía la mejor información de prognóstico en el caso de tumores epiteliales, porque describe la expansión del tumor en el momento del diagnóstico. No obstante, este sistema tiene importantes limitaciones, puesto que algunos de los pacientes afectados de etapas tumorales previas desarrollan metástasis después de cirugía curativa, aunque el tumor no reaparezca localmente. Otros pacientes con etapas avanzadas de cáncer permanecen libres de enfermedad después de la cirugía. Se necesitan claramente nuevos marcadores de diagnóstico para estos tumores.

En particular en el cáncer colorectal (cáncer de colon o recto), hay muy pocos marcadores diagnósticos. En principio, se podrían conseguir otros marcadores si se pudiera comparar el genotipo o fenotipo de las células tumorales con las células normales. No obstante, la interpretación de estudios comparativos de cáncer colorectal se ha demostrado hasta el momento poco eficaz, a causa de las variaciones entre muestras y problemas metodológicos. Por ejemplo, la comparación de las huellas de proteínas obtenidas de las líneas de células tumorales con las obtenidas a partir de criptas colónicas humanas ha demostrado que no hay implicaciones clínicas, ver Ji y otros, "Electrophoresis 15", 391-405 (1994). Otro problema es el alto contenido fisiológico de proteasas en la mucosa intestinal.

Anteriormente, se ha dado a conocer por la publicación WO-A-9 709 600 un método de aislamiento de células de residuos fecales a través de inmunoseparación con gránulos magnéticos, en el que los residuos son enfriados a una temperatura por debajo del punto de congelación.

Características de la invención

Se ha descubierto ahora que se puede realizar una comparación apropiada entre el genotipo o fenotipo de muestras procedentes de tejidos normales y tumorales u otros tejidos anormales, utilizando un procedimiento que posibilita el aislamiento de células epiteliales como material celular sustancialmente libre de estroma (tejidos conectivos) y otras impurezas. Esta preparación de células es suficientemente pura para posibilitar la identificación de diferencias entre células normales y anormales, y su utilización para hacer mapas de proteínas o de ácidos nucleicos. Estos mapas han posibilitado el hallazgo de otros marcadores para cáncer colorectal. Además, el procedimiento tiene una aplicabilidad general que se extiende a otros tipos de tumores epiteliales sólidos y otras anormalidades que se encuentran en células epiteliales a partir de una serie de tipos de tejidos corporales.

La presente invención proporciona por lo tanto un método de diagnóstico de una anormalidad en células epiteliales, especialmente tumores, en una muestra de tejidos tomada desde el lugar de la supuesta anormalidad, especialmente tejidos tumorales, que contienen tejidos de células epiteliales de un paciente, especialmente un paciente humano. El método comprende (consiste o comprende) la separación de estroma de células epiteliales, separando las células epiteliales de la mayor parte de otros tejidos todavía presentes, haciendo reaccionar los tejidos con un anticuerpo monoclonal específico para células epiteliales, recoger las células que han reaccionado unidas al anticuerpo y liberarlas del anticuerpo, de manera que la muestra contiene como mínimo 90% de células epiteliales en volumen del tejido total de la muestra y comparando como mínimo una característica fenotípica o genotípica de la muestra con células epiteliales normales correspondientes. Preferentemente, la base para determinar que la muestra purificada contiene como mínimo 90% de células epiteliales en volumen de los tejidos totales de la muestra es por clasificación de células activadas por fluorescencia utilizando anticuerpos anticitoqueratina después de permeabilización de la membrana de las células.

Mediante la utilización del método indicado, se han producido dos mapas electroforéticos bidimensionales a partir de células epiteliales de pacientes normales y portadores de tumor colorectal, y se ha efectuado su comparación. De ello se ha conseguido como resultado el descubrimiento de que ciertos lugares proteínicos son producidos en exceso o producidos en defecto en las células tumorales colorectales.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un mapa de gel 2D de proteínas presentes en células epiteliales colorectales normales de una preparación de células producida por el método de la invención.

Descripción de las realizaciones preferentes

Si bien la invención se refiere principalmente a tumores colorectales, es aplicable a cualquier otro tipo de tumor sólido que contiene células epiteliales, en particular, por ejemplo, a tumores de pulmón, seno, estómago, páncreas, próstata y riñón. Además, es aplicable a detectar otras anormalidades de las células epiteliales, tales como las asociadas a colitis rectal, enfermedad de Crohn o diverticulitis, por ejemplo.

El procedimiento más preferente de la invención para separar las células epiteliales suficientemente para formar el preparado de células altamente puras comprende la reacción del tejido con un anticuerpo monoclonal específico para células epiteliales y recoger las células que han reaccionado. El anticuerpo monoclonal puede ser cualquiera que reaccione con una proteína apropiada de la superficie de la célula epitelial, especialmente un receptor. Un anticuerpo de este tipo especialmente preferente es Ber-EP4, tal como se describe por U. Latza, "J.Clin. Pathol." 43, 213 (1990). Este anticuerpo se encuentra a disposición en forma de gránulos magnéticos ("Dynabeads") recubiertos con el mismo. Dado que los gránulos magnéticos pueden ser fácilmente separados magnéticamente, en un método usual en tecnología de ensayos, las células epiteliales pueden ser recogidas magnéticamente y lavadas a continuación con respecto a los gránulos.

Otra forma de separación de las células sería un método heterogéneo no magnético utilizando el mismo u otro ligando tal como un anticuerpo monoespecífico o un péptido que une fuertemente a un receptor celular epitelial. El ligando está unido a una fase sólida, que a continuación es lavada para eliminar las células epiteliales que han quedado unidas al mismo.

De modo conveniente, la preparación de células epiteliales se utiliza para determinar una diferencia fenotípica entre células normales y anormales. Esto puede tener lugar en términos de la presencia de una concentración mayor a menor en las células anormales con respecto a las células normales. Esta posibilidad comprende la ausencia completa de una proteína con respecto a unas u otras.

La presente invención es útil por sí misma para la realización de mapas de tejidos, para mostrar diferencias entre tejidos normales y anormales, tanto si estas diferencias tienen origen genético o no, e igualmente si tienen o no valor alguno en relación con la prognosis de la enfermedad. Dos métodos especialmente preferentes de realización de mapas son los mapas de proteínas y los mapas de ácido nucleico. Se pueden hacer convenientemente mapas de proteínas mediante electroforesis bidimensional de gel. Los puntos se definen por referencia a 2D-PAGE llevado a cabo en un extracto de proteínas de la muestra por un método que comprende:

(1) centrifugar 1000 microlitros del extracto de proteína 10.000 x G a temperatura ambiente durante 5 minutos formando una pastilla, disolviendo la pastilla en 300 microlitros de una solución que contiene 8M de urea, 40% CHAPS, 40 mM Tris, 65 mM de ditioeritritol y una traza de azul de bromofenol y colocar la solución de muestra resultante en tiras de 3 mm x 180 mm de largo de gel de poliacrilamida de gradiente de pH inmovilizado (IPG) que tiene un gradiente de pH no lineal, sigmoidal (forma de S);

(2) rehidratar el gel durante una noche con 25 ml de una solución acuosa de urea 8M, 2% peso/volumen CHAPS, 10 mM ditioeritritol y 2% de tampones volumen/volumen de pH 3,5 a 10 y traza de azul de bromofenol;

(3) cargar la solución de muestra en las tiras de gel IPG para electroforesis de primera dimensión y realizar la electroforesis en un voltaje que se incrementa linealmente de 300 a 3500 V durante 3 horas, a continuación durante otras 3 horas adicionales a 3500 V, y finalmente durante 17 horas a 5000 V;

(4) tratar las tiras de gel de IPG con 100 ml de una solución acuosa que contiene 50 mM Tris-HC1, pH 6,8, urea 6M, 30% peso/volumen de glicerol, 2% peso/volumen SDS, 2,5% volumen/volumen de yodoacetamida y trazas de azul de bromofenol durante 5 minutos, para resolubilizar las proteínas y reducir cualesquiera enlaces -S-S;

(5) preparar un bloque de gel de 160 x 200 x 1,5 mm de gradiente de poliacrilamida a partir de una solución acuosa que contiene de 9 a 16% de monómero de acrilamida, 2,6% de un agente reticulante de diacriloilpiperacina, 5 mM de tiosulfato sódico, 0,05% de tetrametiletilendiamina, 0,1% de persulfato amónico y tampón Tris-HC1 0,375 M, pH 8,8, siendo todos los porcentajes peso/volumen, con una capa superior de sec-butanol durante 2 horas, sustituyendo el sec-butanol por agua y con una permanencia de 15 horas, con una capa superior sobre el bloque de gel de una solución acuosa que contiene 0,5% de agarosa, Tris-glicina-SDS a pH 8,3, 25 mM de Tris, 198 mM de glicina y 0,1% SDS, calentada a 70°C y cargando las tiras de gel IPG sobre aquél para electroforesis de segunda dimensión;

(6) realizar la electroforesis de segunda dimensión a 40 mA/gel constante y a 10°C durante 5 horas; y

(7) teñir con plata los geles y explorarlos con un densitómetro láser, para obtener una imagen generada por ordenador del gel tintado.

Se puede hacer un mapa de ARN amplificando el ARN celular (preferentemente total celular o total citoplasmático; mARN es mucho más difícil de extraer de algunas muestras) y hacer actuar el ácido nucleico amplificado resultante (convenientemente en forma de ADN sobre el gel para proporcionar un dibujo de banda característica) la llamada huella dactilar. De manera más preferente, se correlacionan los dos mapas en búsqueda de una proteína que es producida en exceso o en defecto en células tumorales, y se acompaña por un incremento o disminución en la producción de ARN.

Preferentemente, la invención es utilizada para detectar y comprobar nuevos marcadores potenciales para cáncer de diferentes tipos, de acuerdo con los tejidos de origen. Una vez se ha detectado un marcador, puede ser posible eliminar una parte de las etapas de la preparación de la muestra y comparar simplemente los tumores y tejidos normales para el marcador. No obstante, si ello es posible o no, dependerá de los marcadores individuales.

Los marcadores pueden ser detectables como proteínas por cualquiera de los medios convencionales, incluyendo electroforesis de gel bidimensional, transferencia western con un anticuerpo contra la proteína, combinación de la transferencia western con electroforesis de gel de una dimensión, inmunoensayo (especialmente, ensayo quimioluminiscente incrementado, con enlace de enzimas).

Un método de ensayo para la presencia o cantidad del marcador en una muestra de un paciente comprende preferentemente (consiste o incluye) un método electroforético de gel o un método inmunológico o una combinación de los dos. De manera conveniente, el método de comprobación es de manera completa o preliminarmente inmunológico, es decir, típicamente comporta la interacción entre la proteína de la invención y un anticuerpo con respecto a la misma o entre un anticuerpo de la invención y otro anticuerpo. Los métodos inmunológicos comprenden preferentemente el ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzimas (ELISA) o transferencia western (a la que también se hace referencia como inmunotransferencia ("immunoblotting")).

Para un ensayo inmunológico, se requiere un anticuerpo. Para obtener un anticuerpo, es necesario en primer lugar purificar e identificar como mínimo una proteína de los puntos marcadores o una proteína suficientemente similar desde el punto de vista inmunológico a aquélla, y tener el mismo epítopo específico. La proteína se puede purificar por métodos estándar. Por lo tanto, la zona o punto ("spot") es extraído del gel 2D (o electroeluido en solución o electrotransferido a una membrana y recortado de la misma) y, con eliminación del tintado por un método conocido.

La proteína purificada puede ser secuenciada a continuación por cualquier método bien conocido, incluyendo secuenciado de terminal N por degradación de Edman (o bien, si el término N de la proteína está bloqueado, aplicado a un fragmento fraccionado por CNBr o por digestión con una peptidasa). También se puede utilizar espectrometría de masas para determinación de secuencia, especialmente el método de M. wilm y otros, "Nature", 379, 466-469 (1996). Después de que la proteína ha sido secuenciada, se puede comprobar en bases de datos de secuencias en cuanto a similitud con otras proteínas conocidas. Si la proteína es ya conocida o muy similar a otra que ya es conocida, probablemente se dispondrá comercialmente de un anticuerpo. De otro modo, se tendrá que crear un anticuerpo para los objetivos y método inmunológico de ensayo de la proteína marcadora.

La proteína purificada puede ser utilizada directamente para la formación de anticuerpos o bien una proteína sintética o péptido de la misma se podría realizar por medios de ADN recombinante, utilizando un conjunto de oligos degenerados marcados como sonda o cebador.

Con conocimiento de la secuencia completa de aminoácidos de la proteína, se pueden sintetizar varios péptidos de la misma o incluso toda la longitud de la proteína por los métodos usuales de síntesis de péptidos. Los péptidos pueden ser comprobados en cuanto a reacción con los anticuerpos policlonales indicados creados contra la proteína de longitud completa. Estos péptidos que dan lugar a una reacción pueden ser sintetizados y utilizados en lugar de la proteína de longitud completa para crear anticuerpos o en ensayos de competencia o desplazamiento para la proteína presente en la muestra.

El término "anticuerpo" que se utiliza en esta descripción incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, fragmentos de anticuerpos tales como Fab y anticuerpos creados genéticamente. Los anticuerpos pueden ser quiméricos o de una especie única.

Si bien los anticuerpos creados inicialmente pueden ser policlonales, se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando el bien conocido método de Köhler-Milstein. De manera conveniente, el fluido de ascitos de hibridomas ratón-ratón es utilizado y rastreado contra las proteínas purificadas de lugares extraídos de un gel preparativo.

También se pueden crear anticuerpos por expresión del gel de la inmunoglobulina sobre la superficie de un bacteriófago y rastrear los clones resultantes contra el antigén específico, es decir, la proteína marcadora de la presente invención. Ver, por ejemplo, S.L. Morrison en "Molecular Biology and Biotechnology" ed. Robert A. Meyers VCH Publishers Inc., 1995, en la página 37, cuya materia es incorporada a la actual a título de referencia.

Los protocolos para la transferencia western son bien conocidos. Después de la transferencia de la proteína desde el gel electroforético, que puede ser un gel 1D o un gel 2D, a una membrana apropiada, preferentemente de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno, la membrana es bloqueada para impedir absorción no específica de reactivos inmunológicos. Las soluciones típicas de bloqueo son de leche en polvo descremada o suero de albúmina bovina. Después del bloqueo, la proteína puede ser detectada de forma directa o indirecta. La detección directa utiliza anticuerpos primarios marcados, mientras que en la detección indirecta se cultiva un segundo anticuerpo contra el primero y se efectúa el marcado del segundo anticuerpo. Los anticuerpos son usualmente marcados con una enzima tal como peroxidasa o fosfatasa alcalina o con un ligando que tiene elevada afinidad para un coligando, tal como biotina, que tiene una elevada afinidad para la estreptavidina y la avidina. La proteína es detectada a continuación añadiendo un sustrato de enzima, convenientemente un sustrato formador de color, para leer el marcado de enzima o un coligando marcado con una enzima además de un sustrato para la enzima si se ha utilizado un tipo de etiqueta de ligando de alta afinidad.

Un método alternativo de detectar o cuantificar la presencia de la proteína es la utilización de inmunoensayos, preferentemente ELISA, que se pueden llevar a cabo sobre la muestra de células epiteliales o sobre proteínas, separadas o parcialmente separadas por electroforesis de gel 1D o 2D, que se pasa a una membrana por transferencia. Se incluyen entre los tipos de inmunoensayos útiles para esta invención los ensayos de captación de anticuerpos, ensayos de captación de antígenos (llamados también ensayos de competición o de desplazamiento) y el inmunoensayo sándwich de dos anticuerpos. Todos los inmunoensayos requieren proteínas marcadoras etiquetadas, anticuerpos o reactivos secundarios para detección o cuantificación. Las etiquetas descritas anteriormente para la transferencia western pueden ser utilizadas. Las etiquetas pueden ser "leídas" o detectadas por cualquier método convencional, por ejemplo, en un ensayo ELISA utilizando medios quimioluminiscentes, fluorescentes o formadores de color. Son especialmente preferentes los ensayos quimioluminiscentes intensificados y se conocen varios equipos comerciales para estos ensayos en relación con etiquetas de enzima de peroxidasa y de fosfatasa alcalina.

Los equipos de prueba apropiados para las formas anteriores y otras de ensayo quedarán evidentes para los técnicos en la materia. Preferentemente, estos equipos son los destinados a ensayos de captación de anticuerpos y comprenden un primer anticuerpo con respecto a un marcador de proteína y un segundo anticuerpo marcado con respecto a aquél, dispuesto separadamente o en forma de un anticuerpo enlazado doble. Los equipos de prueba pueden incluir opcionalmente cualquiera de una serie de soportes o fases sólidas, especialmente tubos de plástico y placas de microtitulación. Son bien conocidos los procedimientos para ayudar a la asociación de antígenos o de anticuerpos para dichos soportes.

Si bien los ensayos heterogéneos son económicos y bien comprendidos en esta técnica, también se pueden utilizar en esta invención ensayos homogéneos.

Se puede utilizar inmuno-PCR como método de amplificación de la señal de un inmunoensayo anteriormente descrito. En esta técnica, el anticuerpo es enlazado de forma covalente a un fragmento de ADN arbitrario comprendiendo cebadores PCR, de manera que el ADN con anticuerpo asociado es amplificado por el PCR. Ver Hendrickson y otros, "Nucl. Acids Res. 23", 522-529 (1995), cuya materia se incorpora a la actual a título de referencia.

Desde luego es posible ensayar la proteína marcadora por un método que comprende como mínimo una dimensión de electroforesis de gel. Los protocolos de electroforesis de gel no se tienen que considerar limitados a los que se describen en este documento. Pueden variar considerablemente. La muestra es dislocada en primer lugar, por ejemplo, con una concentración molar elevada de urea, detergentes y ditiotreitol o ditioeritritol para fraccionar los enlaces (S-S). El gel de primera dimensión es tratado a continuación en una mezcla de anfolito que establece un gradiente de pH a través del gel, de manera que las proteínas emigran a su punto isoeléctrico, es decir, a un punto en el que el pH del gel con el gradiente de pH establecido por los anfolitos es igual a la carga sobre la proteína. En esta etapa, puede existir una resolución suficiente de los puntos marcadores con respecto a otros para proporcionar una prueba adecuada para la anormalidad del tejido. En caso contrario, una transferencia western o un inmunoensayo utilizando anticuerpo con respecto a la proteína de la invención, puede ser llevado a cabo. De manera alternativa, se puede llevar a cabo entonces la electroforesis de segunda dimensión. En este caso, el gel de primera dimensión es cargado, transversalmente en la dirección de la corriente, sobre el segundo gel. Éste es normalmente un gel SDS-PACE, consistiendo en principio en que cargas sobre la proteína son intercambiadas por el efecto del SDS, de manera que el gel separa las proteínas de acuerdo con el peso molecular. A esto colabora una concentración más elevada de acrilamida.

Los genotipos anormales pueden ser detectables como ARN por cualquiera de los medios convencionales para detección de ARN celular, especialmente con sondas con ADN marcado específico para el ARN, preferentemente en dos lugares en el ADN que codifica la proteína a efectos de incrementar la astringencia de la unión de la sonda a la muestra. Oligonucleótidos etiquetados de una longitud, por ejemplo, de 17 a 40 nucleótidos son utilizables para esta finalidad. Preferentemente, el ARN extraído de la muestra sería amplificado, por ejemplo, mediante una reacción de cadena de polimerasa, antes de llevar a cabo este ensayo. Dado que el ARN de la muestra tendrá que ser habitualmente amplificado de todos modos, puede ser más conveniente utilizar un proceso de amplificación etiquetado, tal como un PCR utilizando un cebador de etiquetado. A este respecto, se ha observado que un cebador arbitrario al azar puede ser muy útil en el caso de que se ignore el genotipo de la enfermedad.

Los siguientes ejemplos explicarán la invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos Aislamiento de criptas colónicas humanas

Inmediatamente después de cirugía de resección de intestino humano por diferentes razones médicas, la muestra quirúrgica fue almacenada sobre hielo. Después de lavar con solución salina tamponada de fosfato (PBS) congelada, se diseccionó un fragmento de mucosa (5 x 5 cm) procedente de una parte sana de tejido, retirada lo más lejos posible del lugar de la enfermedad. La mucosa fue sumergida a continuación en una solución de PBS enfriada con hielo conteniendo 3 mM de EDTA y un cóctel recién preparado de inhibidores de proteasa (50 microgramos/ml de leupeptina, 0,2 mM de PMSF y 0,8 mM de benzamidina). Las criptas fueron retiradas de la membrana basal con un escalpelo, y a continuación presionadas suavemente a través de una rejilla de acero con dimensiones de poros de 300 micras para separar las células epiteliales del estroma. La suspensión celular obtenida de esta manera fue filtrada a continuación a través de una malla de nylon con tamaño de poros de 200 micras. Se permitió el aislamiento de agrupaciones únicas o pequeñas de células epiteliales y otras (linfocitos, macrófagos, etc.). El estroma (tejido conectivo) no quedó alterado por este procedimiento mecánico y teóricamente podría ser utilizado para otros análisis de aislamiento de células epiteliales.

Después de lavar y centrifugar las células a 350 x g durante 10 minutos a 4°C, éstas fueron resuspendidas en la solución antes mencionada con una concentración de 2 x 10_{7} células/ml. Esta suspensión fue incubada a continuación a 4°C durante 30 minutos con anticélulas epiteliales "Dynabeads" recubiertas con anticuerpos Ber-EP4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Deutsche Dynal GmbH, Hamburgo, Alemania). Las células fueron recogidas a continuación con un concentrador de partículas magnéticas (MPC-1, Deutsche Dynal GmbH, Hamburgo, Alemania) y lavadas 5 veces. Se llevó a cabo el contaje de células y comprobación de viabilidad utilizando azul tripán, y ello demostró más de 90% de células viables. Esta primera parte del procedimiento no requirió más de 90 minutos.

Control

La naturaleza de las muestras de células se evaluó después de marcado de los productos de preparación con anticuerpos de anticitoqueratina conjugados de fluoresceína (CAM 5,2, Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut, Estados Unidos) durante 45 minutos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron clasificadas cualitativamente a continuación con un clasificador de células activado por fluorescencia (Epics, Coulter-Immunotech, Hamburgo, Alemania). Se estimó de esta manera que la muestra contenía como mínimo 90% de células epiteliales en volumen del tejido total de la muestra en dicha etapa.

Desnaturalización

Después de centrifugación, las pastillas fueron desnaturalizadas con urea 8M, CHAPS (4% peso/volumen), Tris (40 mM) y DTE (65 mM) de acuerdo con los protocolos SWISS-2D-PAGE, Sanchez y otros, "Electrophoretics 16", 1131-1151 (1995), y se almacenaron a -20°C.

2D PAGE analítico

Se ensayaron las proteínas totales de cada muestra tal como se describe por el bien conocido método Bradford. Se separaron por 2D PAGE 100 microgramos de muestras de proteínas de células epiteliales colónicas humanas normales. Se utilizó un gradiente de pH inmovilizado sigmoidal comercial (IPG) comprendido entre pH 3,5 y 10,0 (18 cm) para la primera dimensión. Después del equilibrado, las tiras de gel IPG fueron pasadas a geles de gradiente vertical (9-16% de acrilamida) para la segunda dimensión, y se sometieron al sistema discontinuo Laemmli-SDS. El reticulador utilizado era diacrililpiperacina (PDA 2,6%), y el catalizador añadido tiosulfato sódico (5 mM). Una descripción completa del método se facilita en el resumen de la invención.

2D PAGE preparatorio

3 mg de muestras de proteínas normales fueron separadas por 2D PAGE y se electrotransfirieron sobre membranas PVDF. Se utilizó un gradiente de pH inmovilizado comercial (IPG) comprendido entre pH 3,5 y 10,0 para separación de primera dimensión. Se utilizó rehidratación de una muestra en gel, que posibilitó una mayor carga de la muestra, incrementó la resolución y consiguió un tiempo de tratamiento más corto. Después de equilibrado, las tiras de gel de IPG fueron transferidas a geles de gradiente vertical (9-16% de acrilamida) para la segunda dimensión. A continuación se llevó a cabo la electrotransferencia sobre membranas de PVDF utilizando un aparato semiseco de fabricación propia con 10% de metanol y 10 mM CAPS como tampón (pH 11) a 200 V durante 2 horas. Las membranas fueron teñidas con negro amido.

Identificación de las proteínas Equilibrado de gel

Después de exploración por medio de densitómetro láser, se llevó a cabo un análisis de imagen 2D PAGE utilizando el paquete de software MELANIE II (Bio-Rad, CA). Los puntos de proteínas fueron detectados y cuantificados automáticamente. La densidad óptica, área y volumen fueron calculados y relacionados directamente a la concentración de proteínas. También se calcularon la densidad óptica relativa y el volumen relativo para corregir diferencias en la carga de gel y tintado. El PL experimental y el peso molecular (MW) de los puntos, y también la identificación de proteína, se dedujeron por medio del software de análisis de imagen MELANIE II (Bio-Rad, Hércules, California, Estados Unidos) a partir del mapa de referencia de hígado SWISS-2DPAGE, Sanchez y otros (1995) al que se hace referencia anteriormente.

Microsecuenciado

Se tintaron membranas de PVDF con Negro Amido, se limpiaron con agua, y se secaron. Los puntos de interés fueron separados por corte, secados en atmósfera de nitrógeno y mantenidos en tubos Eppendorf a -20°C hasta la realización del microsecuenciado. Se llevaron a cabo de 10 a 15 ciclos de degradación Edman para cada punto y se investigó la base de datos SWISS-PROT, ver Bairoch y otros "Nucleic Acids Res.", 22, 3578-3580 (1994) para establecer la identidad de las proteínas ya conocidas.

Inmunotransferencia

Después de transferencia electroforética sobre membranas PVDF, estas últimas fueron bloqueadas con 10 mM Tris-HC1 (pH 7,0), 500 mM NaCl, 0,05% Tween-20 y 0,5% de leche seca sin grasas antes de la incubación con los anticuerpos primarios. Se utilizaron anticuerpos de cabra conjugados de peroxidasa de rábano, anti-conejo y anti-ratón con una dilución 1/1000 como anticuerpos secundarios. Se desarrollaron puntos utilizando quimioluminiscencia incrementada y película de rayos X según se describe por Boehringer Mannheim. Un anticuerpo monoclonal anti-TCTP fue utilizado como marcador interno para control y comparación con mapas de referencia.

(5) Resultados

La separación de tamaño y magnética antes descrita utilizando "Dynabeads" con recubrimiento de "Ber-EP4" permitió el enriquecimiento de las muestras hasta más de 95% de células epiteliales. Este estado puro fue evaluado por un segundo tintado consecutivo utilizando anticuerpos anticitoqueratina conjugados de fluoresceína, seguido de Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia. Un control de calidad utilizando microscopio electrónico de exploración no mostró degradación de las superficies de las células. La contaminación por sangre, evaluada por albúmina de suero, era baja después de lavado y enriquecimiento. La comparación de las muestras antes y después de la separación con los "Dynabeads" mostró una mejora como contraste y desaparición de dibujos de degradación. Se obtuvo un número medio de 900-1200 puntos/gel utilizando tintado de plata.

Se secuenciaron puntos relativos a 40 proteínas y se identificaron tal como se ha indicado en la tabla 1. Se definió (figura 1) un mapa maestro de proteínas de las células epiteliales colónicas normales. La tabla siguiente facilita una clave para la interpretación de la figura 1, de manera que todos los valores de PL y pesos moleculares son aparentes (no absolutos). Utilizando inmunotransferencia, se evaluó la expresión de proteínas con diagnóstico posible o significado prognóstico en anormalidades de tejidos tales como cáncer colorectal. En particular, se localizaron las familias de proteínas CD44, Mn-SOD, EGF-receptor, PAI-1, hsp 70 y PMS2.

Se indican a continuación ejemplos de referencias relativas a la implicación de las proteínas anteriores en el diagnóstico o prognosis de anormalidades de células de tejidos:

EGFR: R. Seshadri y otros, "Int. J. Cancer", 69, 23-27 (1996)

CD44: L.H. Finke y otros, "The Lancet", 345, 583 (1995); J. Mulder, "The Lancet", 344, 1470-1472 (1994); Z. Nihei y otros, "Surgery Today", 26, 760-761 (1996)

PMS2: B. Liu y otros, "Nature Medicine", 2, 169-174 (1996)

MnSOD: A.M.L. Janssen y otros, Abstracto N° 1327, "Proceeding of the 18^{TH} Meeting of the American Association for Cancer Research", Washington D.C., 20-24 de abril, 1996, 37, 194-195 (1996);

I. Katsumi y otros, JICST Abstract Accession N° 97A0705439 (1997);

HSP-70: J. Stulik y otros, "Electrophoresis", 18 (3-4), 625-628 (1997).

Se puede llevar a cabo un trabajo similar en piezas cortadas de tejidos tumorales para conseguir geles que producen puntos representativos de proteínas con sobreexpresión o subexpresión en los tejidos tumorales. La comparación de los mapas, utilizando especialmente software MELANIE II, posibilita la identificación de proteínas significativas en diagnóstico o pronóstico. Se indican ejemplos en una solicitud de patente PCT pendiente con la actual de Electrophoretics International plc y otros, presentada en la oficina receptora del Reino Unido el 23 de marzo de 1998, reivindicando la misma prioridad y titulada "Diagnosis of Colorectal Cancer and Proteins and Antibodies por Use Therein" ("Diagnóstico de Cáncer colorectal y proteínas y anticuerpos para su utilización en el mismo"), cuya materia se incorpora a la actual descripción a título de referencia.

La preparación de la muestra para enriquecerla en células epiteliales tiene la ventaja de que se pueden obtener modelos reproducibles incluso cuando el estroma (tejidos conectivos intercelulares) difiere en diferentes muestras. De esta manera, las muestras se encuentran libres de sangre, materias fecales, linfocitos, etc.

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Ejemplo 2 Muestras

Se tomaron muestras de tejidos colorectales humanos tumorales y normales. Se aislaron células epiteliales de estos tejidos colorectales con partículas magnéticas ("Dyna-Beads") tal como se describe en el ejemplo 1.

Extracción de ARN

Se extrajo el ARN celular total por el método de extracción de guanidinio-tiocianato-fenol-cloroformo de Cho-
mczynsky y Sacchi, "Analytical Biochemistry", 162, 156-159 (1987). Como resumen, el procedimiento era el que se indica a continuación. A los tejidos, cortados y homogeneizados sobre hielo, se añadió una solución 4 M de tiocianato de guanidinio conteniendo 2-mer-captoetanol, seguido de acetato sódico, pH 4, fenol y cloroformo. Después de mezcla completa y centrifugación, la fase acuosa conteniendo el ARN fue retirada y se precipitó el ARN con isopropanol o etanol. Después de centrifugación, la pastilla de ARN fue lavada con etanol y disuelta en SDS.

El ARN citoplasmático total fue extraído tal como se describe por Aubel y otros, en "Current Protocols in Molecular Biology" (1981), Unidad 4.1 ("Protocolos actuales de Biología Molecular"), "Preparation of Cytoplasmic RNA from Tissue Culture Cells" ("Preparación de ARN citoplasmático a partir de células de cultivos de tejidos"). En resumen, el procedimiento era el siguiente. Se lavaron células con solución salina con tampón fosfato enfriadas en hielo y se mantuvieron sobre el hielo durante todas las manipulaciones subsiguientes. Las pastillas o células recogidas fueron resuspendidas en tampón de lisis conteniendo el detergente no iónico "Nonidet" P-40. La lisis de las membranas de plasma tiene lugar casi de modo inmediato. Los núcleos intactos fueron retirados mediante una acción breve de microcentrifugado, y se añadió dodecilsulfato sódico al supernadante citoplasmático para desnaturalizar la proteína. La proteína y lípido fueron retirados por extracciones con fenol/cloroformo y cloroformo. En algunos casos, fue necesario tratar el extracto citoplasmático con proteasa antes de la extracción. El ARN citoplasmático fue recuperado por precipitación de etanol y cuantificado por medición de la absorbancia a 260 y 280 nm.

Selección del cebador

Se utilizaron cebadores oligonucleótidos arbitrarios (ADN). Todavía no se han optimizado, pero normalmente tendrán de 17 a 40 nucleótidos.

Condiciones de ensayo

El método general era el siguiente. Todos los EARN fueron sometidos a transcripción inversa a CADN utilizando un cebador arbitrario, después de lo cual se llevó a cabo PCR con el mismo cebador desde el producto de la reacción previa en 5 ciclos a una temperatura de reasociación de baja estringencia y 35 ciclos a una temperatura de alta estringencia, todo ello en presencia de un nucleótido radioactivo, de manera que los productos podían ser distinguidos o resueltos en un gel de tipo secuenciado.

De manera más detallada, cada reacción de transcripción inversa (RT) fue llevada a cabo en un volumen final de 20 \mul utilizando 50 ng de ARN total, 50 mM Tris-HC1 (pH 8,3), 75 mM KC1, 3 mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, 0,5 mM de cada uno de dNTP, 0,5 \muM cebador, 20 u ARNse inhibidor y 200 u de transcriptasa inversa (Gibco BRL). La incubación con la enzima fue llevada a cabo durante 1 hora a 37°C y la reacción fue interrumpida por calentamiento a 95°C durante 5 minutos.

Se llevaron a cabo PCR subsiguientes con 2 \mul del producto del RT, 10 mM Tris-HC1, 2,5 mM de MgCl_{2}, 50 mM de KC1, 0,1 mg/ml gelatina, 0,1 mM de cada dNTP, 2 \muM de cebador, 1,25 u Taq polimerasa (Boehringer Mannheim) y 2 \muCi [\alpha-^{33}P] -dATP en un volumen final de 25 \mul. Las reacciones consistieron en una etapa de desnaturalización inicial (94°C durante 1 minuto), 5 ciclos a condiciones de baja estringencia (94°C durante 1 minuto; 45 segundos a la temperatura de reasociación; 72°C durante 1 minuto y 30 segundos), 35 ciclos en condiciones de alta estringencia (94°C durante 1 minuto; 60°C durante 45 segundos; 72°C durante 1 minuto) y una prolongación final (72°C durante 5 minutos). Todas las reacciones fueron llevadas a cabo con un Controlador Térmico Programable 100 (MJ Research Inc.).

Los productos PCR fueron diluidos (1/4) con un tampón de carga de desnaturalización de formamida desionizada al 95% (DLB), calentado a 95°C durante 3 minutos y enfriado inmediatamente sobre hielo. 2 \mul de cada una de las muestras diluidas fueron cargados en un gel de secuenciado de desnaturalización de 6% poliacrilamida/urea 8 M (40 cm longitud, 30 cm anchura, 0,4 mm grueso) y se sometió a 55 W durante 3-4 horas. Los geles fueron secados en vacío a 80°C y expuestos a rayos X a temperatura ambiente, sin pantalla intensificadora, durante 1-3 días. A continuación, se compararon las "huellas dactilares" representadas por los geles de las muestras de tejidos normales y anormales.

Se cortó ADN de las bandas de gel y se secuenció. A continuación se puede determinar si predice las proteínas que aparecen en el gel 2D.

Claims (7)

1. Método de diagnóstico de anormalidad celular epitelial en una muestra de tejidos tomados de un lugar que se sospecha dicha anormalidad, que comprende la separación según tamaño del estroma de células epiteliales, separando las células epiteliales de la mayor parte de otros tejidos todavía presentes, por reacción de los tejidos con un anticuerpo monoclonal específico para células epiteliales, recogiendo las células reaccionadas unidas al anticuerpo y liberándolas del anticuerpo, de manera que la muestra contiene como mínimo 90% de células epiteliales en volumen de los tejidos totales de la muestra y comparando como mínimo una característica fenotípica o genotípica de la muestra con correspondientes células epiteliales normales.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que la separación según tamaños se efectúa por filtrado de la muestra de tejidos a través de un filtro de aproximadamente 300 micras y recogiendo las células epiteliales que pasan por el filtro.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que la separación según tamaños comprende además un filtrado adicional de las células epiteliales a través de un filtro de 150-250 micras y recogiendo las células epiteliales que pasan por el filtro.

4. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el que una característica fenotípica es comparada por determinación de si como mínimo una proteína se encuentra presente en una concentración superior o inferior en la muestra que en las células normales.

5. Método, según la reivindicación 4, en el que la proteína es seleccionada entre las que se encuentran presentes en cantidades mayores o menores en un gel electroforético bidimensional de proteínas extraídas de la muestra en comparación con células normales.

6. Método, según la reivindicación 5, en el que el gel electroforético bidimensional es obtenido por:

(1) centrifugar 1000 microlitros del extracto de proteína a 10.000 G a temperatura ambiente durante 5 minutos para formar una pastilla, disolviendo la pastilla en 300 microlitros de una solución que contiene urea 8M , 40% CHAPS, 40 mM Tris, 65 mM de ditioeritritol y trazas de azul de bromofenol y cargando la solución de muestra resultante en tiras con una anchura de 3 mm x 180 mm de longitud de gel de poliacrilamida de gradiente de pH inmovilizado (IPG) que tiene un gradiente de pH no lineal, sigmoidal (forma de S);

(2) rehidratar el gel durante una noche con 25 ml de una solución acuosa de urea 8M, 2% peso/volumen de CHAPS, 10 mM de ditioeritritol y 2% volumen/volumen de tampones de pH 3,5 a 10 y trazas de azul de bromofenol;

(3) cargar la solución de muestra en tiras de gel IPG para electroforesis de primera dimensión y realizando electroforesis a un voltaje que aumenta linealmente de 300 a 3500 V durante 3 horas, a continuación durante 3 horas adicionales a 3500 V, y finalmente durante 17 horas a 5000 V;

(4) tratar las tiras de gel IPG con 100 ml de una solución acuosa que contiene 50 mM de Tris-HC1, pH 6,8, urea 6M, 30% peso/volumen de glicerol, 2% peso/volumen de SDS, 2,5% volumen/volumen de yodoacetamida y trazas de azul de bromofenol durante 5 minutos, para resolubilizar las proteínas y reducir cualesquiera enlaces -S-S-;

(5) preparar un gel de gradiente de poliacrilamida de 160 x 200 x 1,5 mm a partir de una solución acuosa que contiene de 9 a 16% de monómero de acrilamida, 2,6% de agente reticulante de diacriloilpiperazina, 5 mM de tiosulfato sódico, 0,05% de tetrametiletilenediamina, 0,1% de persulfato amónico y tampón Tris-HC1 0,375 M, pH 8,8, siendo todos los porcentajes peso/volumen, disponiendo una capa superior de sec-butanol durante 2 horas, sustituyendo el sec-butanol con agua y reposo durante 15 horas, colocando una capa sobre el gel de una solución acuosa que contiene 0,5% de agarosa, Tris-glicina-SDS a pH 8,3 a 25 mM Tris, 198 mM de glicina y 0,1% SDS, calentando a 70°C y cargando las tiras de gel IPG sobre aquél para electroforesis de segunda dimensión;

(6) llevar a cabo la electroforesis de segunda dimensión a 40 mA/gel constante y a 10°C durante 5 horas; y

(7) tintar con plata los geles y explorarlos con un densitómetro láser, para conseguir una imagen generada por ordenador del gel tintado.

7. Método, según la reivindicación 1, 2 6 3, en el que la característica genotípica es comparada para determinar si el ARN total o el ARN citoplasmático se encuentra presente en una concentración mayor o menor en la muestra que en células normales.