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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Diagnose von Tumoren und anderen Anomalien
von Körperzellen.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Es
besteht Bedarf an verbesserten Verfahren zur Diagnose von Tumoren
und insbesondere zur Bestimmung, ob irgendeine Residualerkrankung
besteht, nachdem eine Operation oder Therapie stattgefunden hat.
Dies ist insbesondere notwendig, um Metastasen aufzuspüren. Die
vorliegende Erfindung betrifft speziell Epitheltumoren und andere
Anomalien von Epithelzellen. Der Begriff "Diagnose" wie hierin verwendet, umfaßt das Erlangen
jeglicher Art von Informationen, die das Vorliegen oder den Zustand
eines Tumors oder anderer Anomalien betreffen und schließt auch
die Prognose ein.
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In
der klinischen Praxis bietet das TNM-Klassifikationssystem (Tumor-Nodulus-Metastase), "TNM classification
of malignant tumours",
UICC, Springer, Berlin (1992), noch immer die besten prognostischen
Informationen im Falle von Epitheltumoren, da es das Ausmaß der Tumorbeteiligung
zum Zeitpunkt der Diagnose beschreibt. Trotzdem bestehen bei diesem
System schwerwiegende Einschränkungen,
da einige Patienten mit frühen
Tumorstadien Metastasen nach kurativer Chirurgie entwickeln, auch
wenn der Tumor lokal nicht wieder auftritt. Andere Patienten mit
fortgeschrittenen Krebsstadien bleiben nach einer Operation frei
von Erkrankungen. Es ist klar, dass neue diagnostische Marker für diese
Tumoren gebraucht werden.
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Besonders
bei kolorektalem Karzinom (Karzinom des Kolons oder Rektums) gibt
es sehr wenig diagnostische Marker. Prinzipiell könnten weitere
Marker verfügbar
werden, wenn der Genotyp oder Phänotyp
der Tumorzellen mit normalen Zellen verglichen werden könnte. Die
Interpretation vergleichender Studien zu kolorektalem Karzinom erwies
sich aufgrund von Variationen zwischen Proben und Methodikproblemen
bislang allerdings als enttäuschend.
Es zeigte sich zum Beispiel, dass ein Vergleich von Protein-Fingerprints,
die aus Tumorzellinien erhalten wurden, mit solchen, die aus menschlichen
Kolonkrypten erhalten wurden, keine klinische Bedeutung hat; siehe
Ji et al., Electrophoresis 15, 391–405 (1994). Ein weiteres Problem
ist der physiologisch hohe Gehalt an Proteasen in der Darmschleimhaut.
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Aus
WO-A-9 709 600 ist bereits ein Verfahren zur Isolierung von Zellen
aus Faeces über
eine Immuntrennung mit magnetischen Kügelchen bekannt, wobei der
Stuhl auf eine Temperatur unterhalb seines Gelgefrierpunkts abgekühlt wird.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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Es
wurde nun gefunden, dass ein zutreffender Vergleich zwischen dem
Genotyp oder Phänotyp
von Proben aus normalem und tumorösem oder anderem anomalen Gewebe
unter Anwendung eines Verfahrens vorgenommen werden kann, mit dessen
Hilfe Epithelzellen als zelluläres
Material isoliert werden können,
das im wesentlichen frei von Stroma (Bindegewebe) und anderen Verunreinigungen
ist. Dieses Zellpräparat
ist genügend
rein, um Unterschiede zwischen normalen und anomalen Zellen identifizieren
zu können
und es wird zur Erstellung von Protein- oder Nucleinsäure-Karten
genutzt. Mit diesen Karten genutzt, weitere Marker für kolorektales
Karzinom aufzufinden. Des weiteren ist das Verfahren allgemein anwendbar,
und dies erstreckt sich auch auf andere Arten fes ter Epitheltumoren
und andere Anomalien, die in Epithelzellen aus einer Fülle von
Körpergewebearten
anzutreffen sind.
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Die
Erfindung macht somit ein Verfahren zur Diagnose von Epithelzellenanomalien,
insbesondere Tumoren, in einer Gewebeprobe verfügbar, die von der Stelle der
mutmaßlichen
Anomalie entnommen wurde, besonders tumoröses, Epithelzellen enthaltendes
Gewebe eines Patienten, insbesondere eines menschlichen Patienten.
Das Verfahren umfaßt
(besteht aus oder schließt
ein) die Größentrennung
des Stromas von den Epithelzellen, die Trennung der Epithelzellen
von einem Großteil
desübrigen,
noch vorhandenen Gewebes durch Reaktion des Gewebes mit einem monoklonalen
Antikörper,
der spezifisch für
Epithelzellen ist, Gewinnung der zur Reaktion gebrachten, an den
Antikörper
gebundenen Zellen und Freisetzung derselben vom Antikörper, wobei
die Probe wenigstens 90 Prozent Epithelzellen bezogen auf das Volumen
des gesamten Gewebes der Probe enthält, und Vergleichen wenigstens
eines phänotypischen
oder genotypischen Merkmals der Probe mit entsprechenden normalen
Epithelzellen. Vorzugsweise beruht die Bestimmung, dass die gereinigte
Probe wenigstens 90 Prozent Epithelzellen bezogen auf das Volumen
des gesamten Gewebes der Probe enthält, auf fluoreszenzaktivierter
Zellsortierung mit Antikörpern
gegen Cytokeratin nach Membranpermeabilisierung der Zellen.
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Durch
Anwendung der obigen Methode werden zweidimensionale gelelektrophoretische
Karten aus den Epithelzellen von normalen Patienten und solchen
mit Kolorektaltumor erzeugt und verglichen. Daraus ergab sich der
Befund, dass bestimmte Protein-Flecke bei kolorektalen Tumorzellen über- oder
unterproduziert werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist eine 2D-Gelkarte von
Proteinen, die in normalen kolorektalen Epithelzellen eines mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
hergestellten Zellpräparats
vorhanden sind.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Zwar
betrifft die Erfindung hauptsächlich
kolorektale Tumoren, doch ist sie auch auf jeden anderen festen,
Epithelzellen enthaltenden Tumor anwendbar, insbesondere beispielsweise
auf Lungen-, Brust-, Magen-, Bauchspeicheldrüsen-, Prostata- und Nierentumoren.
Weiterhin ist sie anwendbar zum Aufspüren anderer Anomalien von Epithelzellen,
etwa solchen, die beispielsweise mit Rektalcolitis, Crohn-Krankheit oder Divertikulitis
in Zusammenhang stehen.
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Das
meistbevorzugte erfindungsgemäße Verfahren
zur hinreichenden Trennung der Epithelzellen zur Bildung des hochreinen
Zellpräparats
umfaßt
die Reaktion des Gewebes mit einem monoklonalen Antikörper, der
spezifisch für
Epithelzellen ist, und die Gewinnung der zur Reaktion gebrachten
Zellen. Der monoklonale Antikörper
kann irgendein solcher sein, der mit einem entsprechenden Epithelzellen-Oberflächenprotein,
besonders einem Rezeptor, reagiert. Ein besonders bevorzugter derartiger
Antikörper
ist Ber-EP4, wie beschrieben bei U. Latza, J. Clin. Pathol. 43,
213 (1990). Dieser Antikörper
ist erhältlich
in Form von magnetischen Kügelchen
("Dynabeads"), die mit demselben
beschichtet sind. Da sich die magnetischen Kügelchen in einer in der Analysentechnik üblichen
Weise ohne weiteres magnetisch abtrennen lassen, können die
Epithelzellen magnetisch gewonnen und dann von den Kügelchen
abgewaschen werden.
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Eine
andere Möglichkeit
zur Abtrennung der Zellen wäre
eine nichtmagnetische heterogene Methode mit dem gleichen oder einem
anderen Liganden, etwa einem monospezifischen Antikörper oder
einem Peptid, das starke Bindung an einen Epithelzellenrezeptor
aufweist. Der Ligand wird an eine feste Phase gebunden, die anschließend gewaschen
wird, um die daran gebundenen Epithelzellen zu entfernen.
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Das
Epithelzellen-Präparat
wird zweckmäßigerweise
dazu verwendet, einen phänotypischen
Unterschied zwischen normalen und anomalen Zellen zu bestimmen.
Dabei kann es sich um die Gegenwart einer höheren oder geringeren Konzentration
in den anomalen Zellen als in den normalen Zellen handeln. Zu dieser Möglichkeit
zählt auch
die völlige
Abwesenheit eines Proteins bei dem einen oder dem anderen.
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Die
Erfindung ist von sich aus brauchbar für das Gewebe-Mapping, um Unterschiede
zwischen normalem und anomalem Gewebe aufzuzeigen, ob diese Unterschiede
genetischen Ursprungs sind oder nicht und ob sie irgendeinen Wert
im Hinblick auf die Prognose der Erkrankung haben oder nicht. Zwei
besonders bevorzugte Methoden des Mappings sind das Protein-Mapping
und das Nucleinsäure-Mapping.
Proteine lassen sich in bequemer Weise durch zweidimensionale Gelelektrophorese
kartieren. Die Flecke werden definiert anhand einer 2D-PAGE, die
durchgeführt
wird mit einem Proteinextrakt der Probe mit Hilfe eines Verfahrens, umfassend:
- (1) fünfminütiges Zentrifugieren
von 1000 μl
des Proteinextrakts bei 10 000 × g
und Raumtemperatur, so dass sich ein Pellet bildet, Lösen des
Pellets in 300 μl
einer Lösung,
enthaltend 8 M Harnstoff, 40% CHAPS, 40 mM Tris, 65 mM Dithioerythrit
und eine Spur Bromphenolblau, und Aufbringen der resultierenden
Probenlösung
auf 3 mm breite und 180 mm lange Streifen eines Polyacrylamid-Gels
mit immobilisiertem pH-Gradienten (IPG), das einen nichtlinearen,
sigmoiden (S-förmigen)
pH-Gradienten aufweist;
- (2) Rehydratisieren des Gels über Nacht mit 25 ml einer wäßrigen Lösung von
8 M Harnstoff, 2% Gew./Vol. CHAPS, 10 mM Dithioerythrit und 2% Vol./Vol.
Puffern mit pH 3,5 bis 10 und einer Spur Bromphenolblau;
- (3) Aufbringen der Probenlösung
auf IPG-Gelstreifen für
die Elektrophorese in einer ersten Dimension und dreistündiges Durchführen der
Elektrophorese bei einer Spannung, die linear von 300 auf 3500 V
erhöht wird,
dann weitere 3 Stunden bei 3500 V und schließlich 17 Stunden bei 5000 V;
- (4) fünfminütiges Behandeln
der IPG-Gelstreifen mit 100 ml einer wäßrigen Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl,
pH 6,8, 6 M Harnstoff, 30% Gew./Vol. Glycerin, 2% Gew./Vol. SDS,
2,5% Vol./Vol. Iodacetamid und eine Spur Bromphenolblau, um die
Proteine wieder löslich
zu machen und etwaige -S-S--Bindungen zu reduzieren;
- (5) Herstellen eines tafelförmigen
Polyacrylamid-Gradientengels mit 160 × 200 × 1,5 mm aus einer wäßrigen Lösung, enthaltend
9 bis 16% Acrylamid-Monomer, 2,6% Diacryloylpiperazin-Vernetzer,
5 mM Natriumthiosulfat, 0,05% Tetramethylethylendiamin, 0,1% Ammoniumpersulfat
und 0.375 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,8, wobei alle Prozentanteile in
Gew./Vol. sind, zweistündiges Überschichten
mit sec-Butanol, Ersetzen von sec-Butanol durch Wasser und 15 Stunden
Stehenlassen, Überschichten
des tafelförmigen
Gels mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend
0,5% Agarose, Tris-Glycin-SDS, pH 8,3, mit 25 mM Tris; 198 mM Glycin und
0,1% SDS, erwärmt
auf 70°C,
und Aufbringen der IPG-Gelstreifen für die Elektrophorese in der
zweiten Dimension;
- (6) fünfstündiges Durchführen der
Elektrophorese in der zweiten Dimension bei konstant 40 mA/Gel und 10°C; und
- (7) Silber-Anfärbung
der Gele und Abtastung derselben mit einem Laserdensitometer, um
ein computererzeugtes Abbild des angefärbten Gels zu ergeben.
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Die
RNA läßt sich
kartieren durch Amplifizieren der zellulären RNA (vorzugsweise gesamte
zelluläre oder
gesamte zytoplasmatische; mRNA ist aus einigen Proben weit schwieriger
zu extrahieren) und Laufenlassen der resultierenden Nucleinsäure (zweckmäßigerweise
als DNA) auf einem Gel, um ein charakteristisches Bandenmuster (sogenannter
Fingerprint) zu ergeben. Ganz besonders bevorzugt werden die beiden Karten
korreliert, so dass man nach einem Protein suchen kann, das in Tumorzellen überproduziert
oder unterproduziert wird, was mit einer Zunahme oder Abnahme der
RNA-Produktion einhergeht.
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Vorzugsweise
wird die Erfindung dazu verwendet, potentielle neue Marker für verschiedenartige
Karzinome gemäß dem Ursprungsgewebe
nachzuweisen und zu prüfen.
Sobald ein Marker auf diese Weise nachgewiesen wurde, ist es durchaus
möglich,
einige Schritte der Probenvorbereitung wegzulassen und einfach das
tumoröse
und normale Gewebe auf den Marker hin zu vergleichen. Ob dies möglich ist,
richtet sich allerdings nach den einzelnen Markern.
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Die
Marker können
als Proteine mit Hilfe irgendeines der gängigen Hilfsmittel nachgewiesen
werden, darunter die zweidimensionale Gelelektrophorese, Western-Blotting
mit einem Antikörper
gegen das Protein, einer Kombination aus Western-Blotting und eindimensionaler
Gelelektrophorese, Immunassay (insbesondere enzymgekoppelt, Assay
mit verstärkter
Chemilumineszenz).
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Ein
Analysenverfahren zur Prüfung
auf Gegenwart oder Menge des Markers in einer Probe aus einem Patienten
umfaßt
(besteht aus oder schließt
ein) vorzugsweise ein gele lektrophoretisches Verfahren oder ein immunologisches
Verfahren oder eine Kombination aus beiden. Zweckmäßigerweise
ist das Testverfahren gänzlich
oder vorwiegend immunologisch, d. h., es ist typischerweise eine
Wechselwirkung zwischen dem erfindungsgemäßen Protein und einem Antikörper dagegen
oder zwischen einem erfindungsgemäßen Antikörper und einem anderen Antikörper beteiligt.
Immunologische Verfahren umfassen vorzugsweise die enzymgekoppelte
Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) oder das Western-Blotting (auch
als Immun-Blotting bezeichnet).
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Für immunologische
Analysen benötigt
man Antikörper.
Um Antikörper
zu erhalten, ist es zunächst
erforderlich, wenigstens ein Protein der Marker-Flecke oder ein
Protein, das immunologisch insofern hinreichend ähnlich ist, als es das gleiche
spezifische Epitop aufweist, zu reinigen und zu identifizieren.
Das Protein kann mittels üblicher
Verfahren gereinigt werden. So wird der Fleck aus dem 2D-Gel ausgeschnitten
(oder elektrisch in Lösung
eluiert oder elektrisch auf eine Membran übertragen und aus der Membran
ausgeschnitten) und mit Hilfe eines bekannten Verfahrens entfärbt.
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Das
gereinigte Protein kann dann mit Hilfe einer der bekannten Methoden
sequenziert werden, darunter N-terminales Sequenzieren durch Edman-Abbau
(oder, falls das N-terminale Ende des Proteins blockiert ist, auf
ein Fragment angewendet werden, das mit CNBr oder durch Verdau mit
einer Peptidase gespalten ist). Auch die Massenspektrometrie kann
zur Sequenzbestimmung herangezogen werden, insbesondere die Methode
von M. Wilm et al., Nature 379, 466–469 (1996). Nach der Sequenzierung
des Proteins kann es mit Hilfe von Sequenz-Datenbanken auf Ähnlichkeit
mit anderen bekannten Proteinen überprüft werden.
Ist das Protein bereits bekannt oder sehr ähnlich zu einem bereits bekannten,
so wird ein Antikörper
wahrscheinlich im Handel erhältlich
sein. An sonsten muß ein
Antikörper
für ein
immunologisches Verfahren zur Analyse des Markerproteins erzeugt
werden.
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Das
gereinigte Protein kann direkt zur Erzeugung von Antikörpern verwendet
werden, oder man könnte
auch ein synthetisches Protein oder Peptid desselben mit Hilfe der
DNA-Rekombinationstechnik
unter Verwendung eines Pools von degenerierten Oligonucleotiden
als Sonde oder Primer herstellen.
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Mit
der Kenntnis der vollständigen
Aminosäuresequenz
des Proteins lassen sich verschiedene Peptide desselben oder auch
das Protein in seiner vollen Länge
mit Hilfe der üblichen
Methoden der Peptid-Synthese synthetisieren. Die Peptide desselben
können
auf Reaktion mit den besagten polyklonalen Antikörpern geprüft werden, die gegen das Protein
in seiner vollen Länge
erzeugt wurden. Diejenigen Peptide, die eine Reaktion ergeben, können dann
synthetisiert und an Stelle des Proteins in voller Länge zum
Erzeugen von Antikörpern
oder in kompetitiven oder Verdrängungsanalysen
auf das in der Probe vorhandene Protein verwendet werden.
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Der
Begriff "Antikörper", wie hierin verwendet,
umfaßt
polyklonale, monoklonale Antikörper,
Fragmente von Antikörpern
wie etwa Fab und gentechnisch erzeugte Antikörper. Die Antikörper können chimär oder von
einer einzigen Spezies sein.
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Zwar
können
die zunächst
erzeugten Antikörper
polyklonal sein, doch lassen sich monoklonale Antikörper mit
Hilfe des wohlbekannten Köhler-Milstein-Verfahrens
herstellen. Zweckmäßigerweise
wird die Aszites-Flüssigkeit
von Maus-Maus-Hybridomen
verwendet und gegen die Proteine gescreened, die aus Flecken auf
gereinigt wurden, die aus einem präparativen Gel ausgeschnitten
wurden.
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Antikörper können auch
so erzeugt werden, dass man das Immunglobulin-Gen auf der Oberfläche eines
Bakteriophagen exprimiert und die resultierenden Klone gegen das
spezifische Antigen screened, d. h., das Markerprotein der vorliegenden
Erfindung. Siehe z. B. S. L. Morrison in "Molecular Biology and Biotechnology", Hrsg. Robert A.
Meyers, VCH Publishers Inc. 1995, auf Seite 37, dessen Offenbarung
hierin durch Zitat erwähnt
sei.
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Vorschriften
für das
Western-Blotting sind wohlbekannt. Nach Übertragung des Proteins vom
elektrophoretischen Gel, das ein 1D-Gel oder ein 2D-Gel sein kann,
auf eine geeignete Membran, vorzugsweise aus Nitrocellulose oder
Polyvinylidendifluorid, wird die Membran blockiert, um unspezifische
Adsorption immunologischer Reagenzien zu verhindern. Typische Blockierlösungen sind
solche von entrahmtem Milchpulver oder Rinderserumalbumin. Nach
dem Blockieren kann das Protein direkt oder indirekt nachgewiesen
werden. Beim direkten Nachweis werden markierte primäre Antikörper verwendet,
während
beim indirekten Nachweis ein zweiter Antikörper gegen den ersten erzeugt
wird und der zweite Antikörper
markiert ist. Die Antikörper
werden normalerweise mit einem Enzym wie etwa Peroxidase oder alkalischer
Phosphatase oder mit einem Liganden markiert, der hohe Affinität zu einem
Coliganden aufweist, etwa Biotin, das hohe Affinität zu Streptavidin
und Avidin besitzt. Der Nachweis des Proteins erfolgt dann durch
Zugabe eines – zweckmäßigerweise
farbbildenden – Enzymsubstrats,
um die Enzymmarkierung abzulesen, oder eines enzymmarkierten Coliganden
plus Substrat für
das Enzym, falls eine Markierung von der Art eines hochaffinen Liganden
verwendet wurde.
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Ein
alternatives Verfahren zum Quantifizieren oder Nachweisen der Gegenwart
des Proteins ist die Anwendung von Immunassays, vorzugsweise ELISAs,
die mit der Epithelzellenprobe oder dem Protein durchgeführt werden
können,
das mittels 1D- oder 2D-Gelelektrophorese isoliert oder teilweise
isoliert und durch Blotting auf eine Membran übertragen wird. Zu den bei
dieser Erfindung brauchbaren Arten von Immunassays zählen Antikörpereinfangassays,
Antigeneinfangassays (auch als kompetitive oder Verdrängungsassays
bezeichnet) und der Zwei-Antikörper-Sandwich-Immunassay.
All diese Immunassays erfordern markiertes Markerprotein, Antikörper oder
sekundäre
Reagenzien zum Nachweis oder zur Quantifizierung. Es können die
vorstehend beim Western-Blotting beschriebenen Markierungen verwendet
werden. Die Markierungen können "abgelesen" oder mit Hilfe irgendeiner
herkömmlichen
Methode nachgewiesen werden, z. B. in einem ELISA durch Verwendung
farbbildender, fluoreszierender oder chemilumineszierender Hilfsmittel.
Assays mit verstärkter
Chemilumineszenz sind besonders bevorzugt, und es sind mehrere kommerzielle
Kits für
solche Assays in Verbindung mit den Enzymmarkierungen Peroxidase
und alkalische Phosphatase bekannt.
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Für die obigen
und andere Formen von Analysen passende Testkits sind für den Fachmann
ersichtlich. Bevorzugte derartige Kits sind solche für einen
Antikörpereinfangassay
und umfassen einen ersten Antikörper gegen
einen Proteinmarker und einen markierten zweiten Antikörper für denselben,
die entweder getrennt oder in Form eines verknüpften Doppelantikörpers bereitgestellt
sind. Die Testkits können
gegebenenfalls irgendeinen aus einer Vielzahl von Trägern bzw.
festen Phasen enthalten, insbesondere Kunststoffgefäße und Mikrotiterplatten.
Verfahren zur Unterstützung
der Bindung von Antigenen oder Antikörpern an derartige Träger sind wohlbekannt.
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Zwar
sind heterogene Analysen preisgünstig
und in der Fachwelt gut verstanden, doch können auch homogene Analysen
bei dieser Erfindung eingesetzt werden.
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Als
Verfahren zur Amplifizierung des Signals eines vorstehend beschriebenen
Immunassays kann eine Immuno-PCR angewendet werden. Bei dieser Technik
wird der Antikörper
covalent an ein Stück
einer beliebigen DNA mit PCR-Primern gebunden, wodurch die DNA mit
dem gebundenen Antikörper
durch die PCR amplifiziert wird. Siehe Hendrickson et al., Nucl.
Acids Res. 23, 522–529
(1995), deren Offenbarung hierin durch Zitat erwähnt sei.
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Es
ist natürlich
auch möglich,
das Markerprotein mit Hilfe eines Verfahrens zu analysieren, das
wenigstens eine Gelelektrophorese-Dimension umfaßt. Die Vorschriften zur Gelelektrophorese
sind nicht so aufzufassen, als seien sie auf die hierin beschriebenen
beschränkt.
Sie können
in erheblichem Maße
abgewandelt werden. Die Probe wird zunächst auseinander gerissen,
z. B. mit einer hohen molaren Konzentration an Harnstoff, Detergenzien
und Dithiothreit oder Dithioerythrit, um die -S-S--Bindungen aufzubrechen.
Das Gel der ersten Dimension wird dann in einer Ampholyt-Mischung laufen gelassen,
die einen pH-Gradienten über das
gesamte Gel schafft, so dass die Proteine zu ihrem isoelektrischen
Punkt wandern, d. h., an einen Punkt, an dem der pH des Gels innerhalb
des von den Ampholyten geschaffenen pH-Gradienten gleich der Ladung am
Protein ist. In diesem Stadium kann die Auflösung der Marker-Flecke von
anderen bereits ausreichend sein, um eine adäquate Prüfung auf die Gewebeanomalie
zu ergeben. Falls nicht, kann ein Western-Blot oder Immunassay mit Antikörper gegen
das erfindungsgemäße Protein
durchgeführt
werden. Alternativ kann dann die Elektrophorese in der zweiten Dimension
vorgenommen werden. Hierbei wird das Gel der ersten Dimension quer
zur Strom- richtung auf ein zweites Gel aufgetragen. Normalerweise
ist dies ein SDS-PAGE-Gel, wobei das Prinzip darin besteht, dass
die Ladungen am Protein durch die Wirkung des SDS überdeckt
werden, so dass das Gel die Proteine nach dem Mo lekulargewicht trennt.
Dies wird durch eine höhere
Acrylamid-Konzenträtion
unterstützt.
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Anomale
Genotypen lassen sich mit irgendeinem der üblichen Hilfsmittel zum Nachweis
zellulärer RNA
als RNA nachweisen, wobei man insbesondere mit markierter DNA sondiert,
die für
die RNA spezifisch ist, vorzugsweise an zwei Stellen an der DNA,
die für
das Protein codiert, um so die Stringenz der Bindung der Sonde an
die Probe zu erhöhen. Üblich für diesen
Zweck sind markierte Oligonucleotide mit einer Länge von etwa 17 bis 40 Nucleotiden.
Vor der Durchführung
dieser Analyse wird die aus der Probe extrahierte RNA vorzugsweise
amplifiziert, z. B. mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion. Da
die Proben-RNA normalerweise ohnehin amplifiziert werden muß, kann
der Einsatz eines Amplifikationsverfahrens mit Markierung, etwa
einer PCR mit markiertem Primer, zweckmäßiger sein. In diesem Zusammenhang
zeigte sich, dass ein beliebiger Zufalls-Primer bei unbekanntem
Genotyp des Krankheitszustands sehr nützlich sein kann.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die Erfindung.
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Beispiel 1
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Materialien und Methoden
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Isolierung
menschlicher Koloakrypten
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Unmittelbar
nach einer Darmresektionsoperation am Menschen aus verschiedenen
medizinischen Gründen
wurde die chirurgische Probe auf Eis gelagert. Nach Waschen mit
geeister phosphatgepufferter Salzlösung wurde ein Stück Schleimhaut
(5 × 5
cm) aus einem gesunden Gewebeteil möglichst weit entfernt von der
erkrankten Stelle ausgeschnitten. Die Schleimhaut wurde dann in
eine eiskalte PBS-Lösung
eingetaucht, enthaltend 3 mM EDTR und einen frisch bereiteten Cocktail
aus Proteasehemmern (Leupeptin 50 μg/ml, PMSF 0,2 mM und Benzamidin
0,8 mM). Die Krypten wurden mit einem Skalpell von der Basalmembran
abgekratzt und dann behutsam durch ein Stahlnetzgewebe mit einer
Porengröße von 300 μm gedrückt, um
die Epithelzellen vom Stroma zu trennen. Die so erhaltene Zellsuspension
wurde dann durch ein Nylonnetzgewebe mit einer Porengröße von 200 μm filtriert.
Auf diese Weise konnten einzelne Epithel- und andere Zellen (Lymphozyten,
Makrophagen, etc.) oder kleine Haufen isoliert werden. Das Stroma
(Bindegewebe) wird durch dieses mechanische Verfahren nicht verändert und
kann theoretisch für
weitere Analysen verwendet werden.
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Isolierung
von Epithelzellen
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Nach
Waschen und 10minütigem
Zentrifugieren der Zellen mit 350 × g bei 4°C wurden diese in der vorstehend
erwähnten
Lösung
mit einer Konzentration von 210 Zellen/ml resuspendiert. Diese Suspension wurde
dann mit Anti-Epithelzellen-"Dynabeads", beschichtet mit
Ber-EP4-Antikörpern
nach den Angaben des Herstellers (Deutsche Dynal GmbH, Hamburg),
30 Minuten lang bei 4°C
inkubiert. Die Zellen wurden dann mit einem Magnetteilchenkonzentrator
(MPC-1, Deutsche Dynal GmbH, Hamburg) gesammelt und fünfmal gewaschen.
Eine Zellenzählung
und Lebensfähigkeitsprüfung wurde
mit Trypanblau durchgeführt
und ergab über 90%
lebensfähige
Zellen. Dieser erste Teil des Verfahrens erforderte nicht mehr als
90 Minuten.
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Kontrolle
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Nach
45minütigem
Markieren der Produkte der Präparation
mit Fluorescein-konjugierten Antikörpern gegen Cytokeratin (CAM
5.2, Perkin-Elmer, Norwalk, Connecticut, USA) nach den Angaben des
Herstellers wurde die Beschaffenheit der Zellproben bewertet. Die
Proben wurden dann mit einem Fluorescence-Activated Cell Sorter (Epen, Coulter-Immuntech,
Hamburg) qualitativ sortiert. Auf diese Weise wurde abgeschätzt, dass die
Probe, bezogen auf das Volumen des gesamten Gewebes der Probe, in
diesem Stadium wenigstens 90% Epithelzellen enthielt.
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Denaturierung
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Nach
dem Zentrifugieren wurden die Pellets mit 8 M Harnstoff, CHAPS (4%
Gew./Vol.), Tris (40 mM) und DTE (65 mM) gemäß den SWISS-2D-PAGE-Vorschriften,
Sanchez et al., Electrophoretics 16, 1131–1151 (1995), denaturiert und
bei –20°C aufbewahrt.
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Analytische 2D-PAGE
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Das
Gesamtprotein in jeder Probe wurde wie beim wohlbekannten Bradford-Verfahren
beschrieben analysiert. 100 μg
Protein-Proben aus normalen menschlichen Kolon-Epithelzellen wurden
mittels 2D-PAGE aufgetrennt. Für
die erste Dimension wurde ein kommerzieller sigmoider immobilisierter
pH-Gradient (IPG) im Bereich von pH 3,5 bis 10,0 (18 cm) verwendet.
Für die
zweite Dimension wurden die IPG-Gelstreifen
nach dem Äquilibrieren
auf tafelförmige
Gele mit vertikalem Gradienten (9–16% Acrylamid) überführt und
mit dem diskontinuierlichen Laemmli-SDS-System laufen gelassen.
Der verwendete Vernetzer war Diacryloylpiperazin (PDA, 2,6%) und
der entsprechende Katalysator Natriumthiosulfat (5 mM). Eine ausführliche
Beschreibung der Methode findet sich in der obigen Kurzbeschreibung
der Erfindung.
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Präparative 2D-PAGE
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3
mg der Proben des normalen Proteins wurden mittels 2D-PRGE getrennt und
elektrisch auf PVDF-Membranen übertragen.
Für die
erste Dimension wurde ein kommerzieller immobilisierter pH-Gradient (IPG)
im Bereich von pH 3,5 bis 10,0 verwendet. Die Probe wurde im Gel
rehydratisiert, wodurch höhere
Probenbeschickung, erhöhte
Auflösung
und kürzere
Laufzeiten möglich
wurden. Für
die zweite Dimension wurden die IPG-Gelstreifen nach dem Äquilibrieren
auf tafelförmige
Gele mit vertikalem Gradienten (9–16% Acrylamid) überführt. Dann
wurde ein 2stündiges
Elektroblotting auf PVDF-Membranen
mit einer selbstgefertigten Halbtrocken-Apparatur mit 10% Methanol
und 10 mM CAPS als Puffer (pH 11) bei 200 V vorgenommen. Die Membranen
wurden mit Amidoschwarz angefärbt.
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Identifizierung
der Proteine
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Gelübereinstimmung
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Nach
Laserdensitometer-Abtastung wurde unter Verwendung des Software-Pakets
MELANIE II (Bio-Rad, CA) eine 2D-PAGE-Bildanalyse durchgeführt. Die Protein-Flecke wurden
erfaßt
und automatisch quantifiziert. Optische Dichte, Fläche und
Volumen wurden berechnet und direkt mit der Protein-Konzentration in
Beziehung gesetzt. Zur Korrektur der Unterschiede bei Gelbeladung
und Anfärbung
wurden auch die relative optische Dichte und das relative Volumen
berechnet. Der experimentelle pI und das experimentelle MG der Flecke
sowie die Protein-Identifizierung wurden abgeleitet mit Hilfe der
Bildanalyse-Software MELANIE II (Bio-Rad, Hercules, Kalifornien,
USA) aus der Leber-SWISS-2D-PAGE-Vergleichskarte,
Sanchez et al. (1995), siehe oben.
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Mikrosequenzierung
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PVDF-Membranen
wurden mit Amidoschwarz angefärbt,
mit Wasser entfärbt
und getrocknet. Die fraglichen Flecke wurden ausgeschnitten, unter
Stickstoff getrocknet und bis zur Durchführung der Mikrosequenzierung
in Eppendorf-Röhrchen
bei –20°C aufbewahrt.
Es wurden zehn bis fünfzehn
Edman-Abbauzyklen
für jeden
Fleck durchgeführt,
und es wurde eine Suche in der SWISS-PROT-Datenbank, siehe Bairoch
et al., Nucleic Acids Res. 22, 3578–3580 (1994), durchgeführt, um
die Identität
bereits bekannter Proteine zu ermitteln.
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Immunblotting
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Nach
der elektrophoretischen Übertragung
auf die PVDF-Membranen
wurden diese vor dem Inkubieren mit den primären Antikörpern mit 10 mM Tris-HCl (pH
7,0), 500 mM NaCl, 0,05% Tween-20 und 0,5% fettloser Trockenmilch
blockiert. Als sekundäre
Antikörper
wurden Meerrettichperoxidase-konjugierte Ziege-Antikaninchen- und
Antimaus-Antikörper
in einer Verdünnung
von 1 : 1000 eingesetzt. Die Blots wurden mit verstärkter Chemilumineszenz
und Röntgenfilm
entwickelt wie von Boehringer Mannheim beschrieben. Als interner
Marker zur Kontrolle und zum Vergleich mit Vergleichskarten wurde
ein monoklonaler Antikörper
gegen TCTP verwendet.
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Ergebnisse
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Die
vorstehend beschriebene Größentrennung
und magnetische Trennung mit "Ber-EP4"-beschichteten "Dynabeads" ermöglichte
die Anreicherung der Proben auf über
95% Epithelzellen. Dieser reine Zustand wurde durch eine zweite
nachfolgende Anfärbung
mit Fluorescein-konjugierten Antikörpern gegen Cytokeratin und
anschließende
fluoreszenzaktivierte Zellsortierung bewertet. Eine Qualitätskontrolle
mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie zeigte keinen Abbau der
Zelloberflächen.
Die Verunreinigung durch Blut, die anhand des Serumalbumins bewertet
wurde, war nach Waschen und Anreicherung gering. Ein Vergleich der
Proben vor und nach der Trennung mit den "Dynabeads" zeigte eine Verbesserung beim Kontrast
und das Verschwinden der Abbaumuster. Durch Silber-Anfärbung wurde
eine mittlere Anzahl von 900–1200
Flecken/Gel erhalten.
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Flecke,
die 40 Proteine betreffen, wurden sequenziert und identifiziert
wie in Tabelle 1 aufgeführt.
Es wurde eine Protein-Hauptkarte der normalen Kolon-Epithelzellen
definiert (1). Eine
Legende zu 1 ist in
der folgenden Tabelle gegeben, aus der alle pI- und Molekulargewichtswerte
(nicht absolut) ersichtlich sind. Mittels Immunblotting wurde die
Expression von Proteinen mit möglicher
diagnostischer oder prognostischer Bedeutung bei Gewebeanomalien
wie etwa kolorektalem Karzinom bewertet. Insbesondere wurden die
Protein-Familien CD44, Mn-SOD, EGF-Rezeptor, PAI-1, hsp70 und PMS2 lokalisiert.
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Beispiele
für Zitate,
die die Bedeutung der obigen Proteine für die Diagnose oder Prognose
von Gewebezellanomalien betreffen, sind die folgenden:
EGFR:
R. Seshadri et al., Int. J. Cancer, 69, 23–27 (1996);
CD44: L. H.
Finke et al., The Lancet, 345, 583 (1995); J. Mulder, The Lancet
344, 1470–1472
(1994); Z. Nihei et al., Surgery Today 26, 760–761 (1996);
PMS2: B.
Liu et al., Nature Medicine 2, 169–174 (1996);
MnSOD: A.
M. L. Janssen et al., Abstract No. 1327, Proceedings of the 18th
Meeting of the American Association for Cancer Research, Washington
D.C., 20.–24.
April 1996, 37, 194–195
(1996);
I. Katsumi et al., JICST Abstract Accession No. 97A0705439
(1997);
HSP-70: J. Stulik et al., Electrophoresis 18 (3–4), 625–628 (1997).
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Ähnliche
Arbeiten können
an zerkleinerten Stücken
Tumorgewebe durchgeführt
werden, um Gele zu erhalten, die Flecke ergeben; die für die im
Tumorgewebe über-
oder unterexprimierten Proteine stehen. Durch Vergleichen der Karten,
insbesondere mit Hilfe der MELANIE II-Software, können Proteine
mit diagnostischer oder prognostischer Bedeutung identifiziert werden.
Beispiele finden sich in der gemeinsam an hängigen PCT-Patentanmeldung
der Electrophoretics International plc et al., eingereicht beim „UK Receiving
Office" am 23. März 1998,
die die gleiche Priorität
beansprucht, mit dem Titel "Diagnosis
of Colorectal Cancer and Proteins and Antibodies for Use Therein", deren Offenbarung
hierin durch Zitat erwähnt
sei.
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Die
Präparation
der Probe zur Anreicherung derselben mit Epithelzellen hat den Vorteil,
dass reproduzierbare Muster selbst dann erhalten werden können, wenn
sich das Stroma (das interzelluläre
Bindegewebe) bei verschiedenen Proben unterscheidet. Auf diese Weise
werden die Proben von Blut, Stuhlmaterial, Lymphozyten etc. befreit.
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Beispiel 2
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Proben
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Die
Proben wurden von tumorösem
und normalem menschlichen Kolorektalgewebe entnommen. Aus diesem
Kolorektalgewebe wurden Epithelzellen mit magnetischen Teilchen
("Dynabeads") wie in Beispiel
1 beschrieben isoliert.
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RNA-Extraktion
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Die
zelluläre
Gesamt-RNA wurde extrahiert mit Hilfe des sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahrens
von Chomczynsky und Sacchi, Analytical Biochemistry 162, 156–159 (1987).
Zusammenfassend war das Verfahren wie folgt: Das auf Eis zerhackte
und homogenisierte Gewebe wurde mit einer 4 M Guanidiniumthiocyanat-Lösung, enthaltend
2-Mercaptoethanol, und anschließend
mit Natriumacetat, pH 4, Phenol und Chloroform versetzt. Nach gründlichem
Mischen und Zentrifugieren wurde die die RNA enthaltende wäßrige Phase
abgetrennt, und die RNA wurde mit Isopropanol oder Ethanol ausgefällt. Nach dem
Zentrifugieren wurde das RNA-Pellet mit Ethanol gewaschen und in
SDS gelöst.
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Die
zytoplasmatische Gesamt-RNA wurde extrahiert wie beschrieben von
Aubel et al., "Current
Protocols in Molecular Biology" (1981),
Unit 4.1, "Preparation
of Cytoplasmic RNA from Tissue Culture Cells". Zusammenfassend war das Verfahren
wie folgt: Die Zellen wurden mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen
und für
alle nachfolgenden Handhabungen auf Eis aufbewahrt. Die Pellets
oder geernteten Zellen wurden in einem das nichtionische Detergens "Nonidet" P 40 enthaltenden
Lysepuffer resuspendiert. Die Lyse der Plasmämembranen tritt fast augenblicklich
ein. Die intakten Zellkerne wurden durch kurzes Schleudern mit einer
Mikrozentrifuge abgetrennt, und der zytoplasmatische Über stand
wurde zur Denaturierung des Proteins mit Natriumdodecylsulfat versetzt.
Protein und Lipid wurden durch Extrahieren mit Phenol/Chloroform
und Chloroform abgetrennt. In einigen Fällen mußte der zytoplasmatische Extrakt
vor dem Extrahieren mit Protease behandelt werden. Die zytoplasmatische
RNA wurde durch Fällen
mit Ethanol gewonnen und durch Messen ihrer Extinktion bei 260 und
280 nm quantifiziert.
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Primer-Auswahl
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Es
wurden beliebige (DNA) Oligonucleotid-Primer verwendet. Diese waren
noch nicht optimiert, weisen jedoch normalerweise 17 bis 40 Nucleotide
auf.
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Analysebedingungen
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Das
allgemeine Verfahren war wie folgt: Alle RNAs wurden mit einem beliebigen
Primer revers in cDNR tanskribiert, wonach mit dem gleichen Primer
eine PCR mit dem Produkt der vorhergehenden Reaktion in 5 Zyklen
bei einer Annealing-Temperatur
niedriger Stringenz und in 35 Zyklen bei einer Temperatur hoher Stringenz
durchgeführt
wurde, jeweils in Gegenwart eines radioaktiven Nucleotids, um so
die Auftrennung der Produkte in einem Gel vom Sequenzierungstyp
zu ermöglichen.
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Im
einzelnen wurde jede reverse Transkriptionsreaktion (RT) in einem
Endvolumen von 20 μl
mit 50 ng Gesamt-RNA, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM des jeweiligen dNTP, 0,5 μM Primer,
20 U RNAse-Hemmer und 200 U reverser Transkriptase (Gibco BRL) durchgeführt. Das
Inkubieren mit dem Enzym erfolgte 1 h bei 37°C, und die Reaktion wurde durch
5minütiges
Erhitzen auf 95°C
gestoppt.
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Die
nachfolgenden PCRs wurden durchgeführt mit 2 μl des Produkts der RT, 10 mM
Tris-HCl, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1 mg/ml
Gelatine, 0,1 mM des jeweiligen dNTP, 2 μM Primer, 1,25 U Taq-Polymerase (Boehringer
Mannheim) und 2 μCi
[α-33P]-dATP in einem Endvolumen von 25 μl. Die Reaktionen
bestanden aus einem anfänglichen
Denaturierungsschritt (1 min 94°C),
5 Zyklen unter Bedingungen niedriger Stringenz (1 min 94°C; 45 Sekunden
bei der Annealing-Temperatur; 1 min 30 Sekunden bei 72°C), 35 Zyklen
unter Bedingungen hoher Stringenz (1 min 94°C; 45 Sekunden 60°C; 1 min
72°C) und
einer abschließenden
Extension (5 min 72°C).
Alle Reaktionen wurden in einem programmierbaren Thermal Controller-100
(MJ Research Inc.) durchgeführt.
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Die
PCR-Produkte wurden mit 95% deionisiertem denaturierendem Formamid-Beladungspuffer
(DLB) verdünnt
(1 : 4), 3 min auf 95°C
erhitzt und sofort auf Eis gekühlt.
Jeweils 2 μl
der verdünnten
Probe wurden in ein denaturierendes 6% Polyacrylamid/8 M Harnstoff-Sequenzierungsgel
(40 cm lang, 30 cm breit, 0,4 mm dick) gegeben und 3 bis 4 Stunden
bei 55 W laufen lassen. Die Gele wurden bei 80°C unter Vakuum getrocknet und
1–3 Tage
bei Raumtemperatur ohne Verstärkerfolie
auf einen Röntgenfilm
einwirken gelassen. Die durch die Gele dargestellten "Fingerprints" der normalen und
anomalen Gewebeproben wurden dann verglichen.
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Die
DNA wurde aus den Gelbanden ausgeschnitten und sequenziert. Es kann
dann bestimmt werden, ob sich damit auf dem 2D-Gel erscheinende
Proteine vorhersagen lassen.
