JPH0257194A - 基底膜物質の免疫学的測定法のために好適なペプチドラミニンｐ１及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液中の基底膜物質（Ｂａ５ａ　１　ｍｅｍ
ｂｒａｎｍａｔｅｒｉａｌ）を免疫学的に測定する方法
のために好適なラミニンフラグメントＰＩ及びその製法
に関する。

多くの疾病（糖尿病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊維症、血
管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加することは公知
である。この血管変化は、従って屡々致死要因となって
いる。これらの疾病における免疫学的螢光検査によれば
、これら基底膜変動は、特にラミニンと称せられる新規
の基底膜成分及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づく
ことが判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検査
を行なっているが、バイオプシー物質でのみ実施でき、
定量的には評価できない。

従って、本発明は、この問題を血中及び他の体液（尿、
腹水）中の基底膜抗原を測定するための定量的かつ特異
的方法を得るための特定の基底膜抗原を得ることである
。

この方法は、体液中の基底膜物質の免疫学的測定法より
なり、これは、測定すべき試料の存在下に抗原としての
標識ラミニン、標識ラミニンフラグメントＰ１又は標識
基底膜フラグメントＣｏ１１　（ＩＶ）をその特異抗体
と共にインキュベートし、生じた抗原−抗体−結合体を
分離し、結合体中又は分離した液体中に含有される標識
抗原の量を測定することよりなる。

前記方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質即ちラミニ
ン、ラミニンフラグメントＰｌ及びコラーゲンペプチド
Ｃｏ１１　（ＩＶ）の特性付けに基づく。これらの３種
の新規物質殊に２種の７ラグメントラミニンＰｉ及びＣ
ｏ１１　（ＩＶ）は、蛋白質分解及び変性作用に対して
高い安定性を示し、従って体液殊に血液中に良好に立証
しうる量でも現われるから、その定量によって基底膜の
増加が測定できる。

ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これは、炭水
化物１２〜１５重量％を含有し、分子量８００〜１ｏｏ
ｏｋを有する糖蛋白質であり、２種の分子量的２２０ｋ
及び４４０にのジスルフィド結合したポリペプチド鎖よ
り成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組織を
濃塩酸溶液で抽出し、引続きこの組織を０．４〜０　、
６　Ｍ　ＮａＣＱで抽出し、後者抽出液を３．３〜３　
、５　Ｍ　ＮａＣＱで沈殿させ、再溶解させた沈殿をク
ロマトグラフィにかけることにより得られる。

プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化学的方法
で例えば臭化シアンを用いるラミニンの分解により、こ
れからラミニンＰＩと称される多大の７ラグメントを得
ることができる。

このフラグメントは、直接、組織から得ることもできる
。

ラミニンＰＩは、分子量２００〜３００ｋを有し、シス
ティン１２〜１４モル％を含有し、レクチンに対する高
い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を有し、 ｌ）プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニンを分
解するか又は２）プロテアーゼ阻害剤の存在下で基底膜
含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０−４−０．６　
Ｍ　Ｎａ（Ｊで抽出し、残留分をプロテアーゼと共にイ
ンキュベートし、得られる溶液を透析し、得られた溶液
を２Ｍ及び４　Ｍ　ＮａＣｌ２の間で分別沈殿させ、弱
塩基性カチオン交換体を通すクロマトグラフィにかけ、
レクチンを通すクロマトグラフィにかけることによって
得られる。

ラミニンＰＩに対して高い親和性を有するレクチンの典
型的な例はコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
）　Ａ及び麦芽レクチンである。

前記方法で使用できる第３の新規抗原は、基底膜コラー
ゲンのジスルフィドの多い変形体よりなるフラグメント
であり、慣用のプロテアーゼ例えばペプシン及びトリプ
シンに対しても、細菌性コラゲナーゼ（ＣＱ−ヒストリ
ティクム）に対しても抵抗する。これは、Ｃｏｔ　　ｌ
　（ＩＶ）と称され、分子量２００〜３００ｋを有し、
システィン２〜５モル％を含有し、軸比１：０、融点範
囲６０〜７０℃の安定なトリペルらせんを有し、コラゲ
ナーゼに対して抵抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で基
底膜含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０．４−０．
６　Ｍ　ＮａＣ＋２で抽出し、抽出残分をプロテアーゼ
と共にインキュベートし、得られた溶液を透析し、２Ｍ
ＮａＣＱで沈殿させ、再溶解した沈殿をコラゲナーゼと
共にインキュベートし、透析しかつクロマトグラフィで
精製することにより得られる。

比較すると、コラーゲンにおける軸比はｌ：２００であ
る。

次表に新規の３種の抗原のアミノ酸組成を挙げる。

Ｈ３’ｐ ｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。

ｌ　ｙ ｌａ ｙｓ ａ１ ｅｔ １ｅ ｅｕ ｙｒ ｈｅ ｉｓ ｙｌ ｙｓ ｒｇ ラミニン ラミニンＰＩ これらの新規基底膜成分は、前記のように、体液中殊に
血液中の基底膜物質を公知の免疫学的検査法を用いる前
記測定を可能にし、これは、共同の抗体に関する周知量
の標識抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争に基づ
く。この場合、公知ラジオイムノアッセイ−（ＲＩ　Ａ
）変法も、酵素イムノアッセイ−変法及び他の方式の標
識付は例えば螢光標識付け、染料標識性は等を用いる類
似測定法も使用できる。この種の方法は、当業者にとっ
ては公知である。すべてのこれらの方法は、できるだけ
高純度の抗原を用いて適当な実験動物中に抗血清を作り
、これをそのもの自体として又はこれから単離した特異
抗体を得、場合により抗体もしくは抗血清を固体担体に
結合した後、慣用の抗原−抗体結合体形成反応を反応成
分相互のインキュベートにより進行させることに基づく
。体液の被検試料中に存在する標識されていない抗原の
量に応じて、この結合体中では標識抗原の１部分のみが
結合しており、結合体の単離によるか又は上澄み中で測
定されうる。結合体中で結合した標識抗原の量は、結合
しなかった抗原の量に関係するから、こうして、体液中
の抗原作用をする基底膜物質の含分を測定することがで
きる抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹腔内
注射することにより行なうことができる。この場合完全
なフロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈｅｎ
　Ａｄｊｕｖａｎｓ）の存在で操作するのが有利である
。この種の場合に慣用の抗原量は更に加工できる。家兎
使用の際の特に好適な投与量としては、０．５〜１＋＋
＋９／動物が効を奏する。次いで生じた抗血清は当業者
に公知の方法で回収され、そのもの自体として使用され
る。血清中に存在する特異抗体を、予め、例えば親和ク
ロマトグラフィの方法でなお精製することもできる。

抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の方法で実
施できる。放射線核での放射性標識付けの場合は、放射
線核としてヨード１２５を使用する。この放射線核を用
いる標識付けは、公知のクロラミンＴ−法で行なうこと
ができる（Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　２
９巻１８５頁参照）。

前記方法の有利な実施形は、特異抗血清で形成された抗
原−抗体−結合体を第２の抗体の使用により、結合しな
かった抗原から分離することよりなる。この場合、第２
の抗体として、抗血清を得るために使用した動物の免疫
グロブリンＧに対する抗体を使用するのが有利である。

これにより不溶の形に変えられた抗原−抗体結合体を溶
液から分離することは、このために慣用の方法例えば遠
心分離、濾過及び類似方法で行なうことができる。抗血
清もしくは抗体を固体担体例えば試験管の内壁に結合さ
せるのも有利である。

抗原−抗体−結合体の分離の後に、前記のように、標識
、例えば抗原−抗体−結合体に結合している又は選択的
に上澄み中に残留している放射能又は酵素活性を測定す
る。公知の抗原含量の試料を用いて製造した較正曲線を
用いて、被検体中に含有される抗原量を測定することが
できる。この場合、原則的に、標識抗原の量（これは、
生じた抗原−抗体−結合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。

前記免疫学的測定法によれば、ｌ　ｎｇ／　ｍＱの範囲
までの濃度の測定が可能である。従って、この方法を動
物及びヒトの体液殊に血液もしくは血清中の基底膜物質
の測定法に使用することができる。正常の個体の場合に
、血清中のこの抗原の濃度は、２０〜５０　ｎｇ／　ｍ
Ｑの範囲内にあり、基底膜変化の際に・は例えば実験的
糖尿病の際には著るしく高まる。前記方法を用いると、
この種の変化は比較的迅速にかつ確実に測定できる。

前記方法で使用される新規抗原は、原則的に基底膜を含
有するすべての組織から得られる。

得るべき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎盤が
有利である。同様に、多量の基底膜を形成する特定の腫
瘍組織例えばマウスのＥＨ３−肉腫も有利である。

本発明により新規抗原を得る場合に、この組織からの基
底膜の純粋製造は省略される。組織を差当り、プロテア
ーゼ阻害剤の存在で高い塩濃度で抽出すると、この際付
随蛋白質が除かれる。この場合３．４〜４　Ｍ　ＮａＣ
ｌ２が有利である。

この抽出のために、組織を差当り常法で粉砕もしくはホ
モゲナイズする。場合により高い塩濃度で数回抽出の後
に、低い塩濃度での、有利に０．４〜０．６　Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ２での第２の抽出工程を数回実施することができる
。この場合実際に基底膜コラーゲンは溶解しないが、ラ
ミニンの１部分は溶解する。こうして得た溶液は、ラミ
ニン及びラミニンフラグメントラミニンＰ１を得るため
に使用でき、二重塩抽出時に残留する不溶の組織残分は
、フラグメントＣａ１ｌ　（Ｒ’）を得るための出発物
質として使用されるが、ラミニンＰｉを得るためにも好
適である。

プロテアーゼ阻害剤として例えばフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド、ｐ−クロルメルクす安息香酸又はエチ
レンジアミンテトラ酢酸が使用される。しかしながら他
のプロテアーゼ阻害剤も好適である。阻害剤は、個々に
又は混合して使用できる。好適な濃度は、通例的１〜５
０ｍｇ／Ｑである。

ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付随蛋白質
の塩沈殿により分離できる。沈殿は３．３〜３．５ＭＮ
ａＣＱで行なうのが有利であるこうして得た沈殿を再び
緩衝液中に入れ、例えばアガロースＡ１．５ｍのクロマ
トグラフィにかける。こうして、前記のように、本発明
方法に使用できる前記ラミニンが得られる。

こうして得たラミニンから、フラグメントＰ１は、蛋白
質分解酵素を用いる分解によるか又は化学的方法で例え
ば臭化シアンを用いて得ることができる。約ｐＨ１，５
〜２．５の強酸性溶液中でのペプシンを用いる分解を行
なうのが有利である。こうして得た溶液から、分別塩沈
殿によりフラグメントＰＩを得ることができる。沈殿は
有利に、差当たり２ＭＮａＣｆｆを用い、かつ引続き４
　Ｍ　ＮａＣＱを用いて行なうのが有利であり、この際
最後の工程でラミニンＰＩが沈殿する。

フラグメントＰ１は、直接、単離する必要のない基底膜
物質から得ることもできる。この有利な取得法では、２
工程塩抽出の不溶組織成分から出発される。残分を懸濁
させ、蛋白分解酵素と共に、この酵素に好適な温度及び
ｐｌ値条件下に、インキュベートする。有利にペプシン
を使用し、約１．５〜２．５のｐＨ−値で常温又は僅か
に低い温度で操作するのが有利である。約ｌＯ〜２０℃
が好適である。その後不溶分を分離し、低分子量物質を
透析により除去し、得られた溶液から塩分別により前記
のように、ラミニンＰＩが得られる。沈殿は有利に差当
たり２ＭＮａＣＱで、引続き４ＭＮａＣｌを用いて行な
う。

沈殿したフラクション２〜４ＭＮａＣｌカラ、ラミニン
ＰＩは、クロマトグラフィにより更に精製できる。有利
に、差当り弱塩基性のカチオン交換体例えばＤＥＡＥ−
セルロース又はＤＥＡＥセファデックスでのクロマトグ
ラフィを実施する。精製は、例えば担体結合又は網状化
により不溶性形で存在するレクチンへの結合により、か
つ引続き適当な炭水化物での溶離により行なうことがで
きる。例えば網状化されたデキストラン例えばアガロー
スＡ１．５ｍでのゲル濾過も精製のために使用できる。

フラグメントＣａ１ｌ（ＩＶ）を得るために、同様に、
２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液から出発する
。プロテアーゼ処理の後に得られる２ＭＮａＣｌ２まで
の沈殿物を新たに溶解の後に、この酵素に好適な温度及
びｐｎ値条件でコラゲナーゼと共にインキュベートする
と、Ｃｏ１１（ＩＶ）を除きすべての余分のコラーゲン
が分解され、透析により除去することができる。精製は
、例えば網状化されたデキストラン及び／又はカルボキ
シメチルセルロースでのモレキュラーシーブクロマトグ
ラフィにより行なうことができる。

前記の蛋白質分解法にとってペプシンが有利であるが、
他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこのために好適で
ある。化学的分解法も使用できる。これは臭化シアンを
用いて行なうのが有利である。

次に実施例につき本発明を説明する。

例１（参考例） 標識抗原の製造 ラミニンＰＩ又はペプチドＣｏ１１　（ＩＶ）　２５μ
９をクロラミン−Ｔ−法によりヨード１２５０．５ミリ
キユリーで標識し、結合しなかったヨードを透析又はビ
オ−ゲルＰ−２でのゲル濾過により除く。引続く工程を
有利に非イオン性界面活性剤例えばツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　２０　０．０４％の存在で実施する。抗体との結
合曲線を、標識ペプチドｌｎｇを用いて測定する。

免疫学的測定（ＲＩ　Ａ）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニンＰＩ又はＣ
ｏ１１　（ＩＶ）の濃度を、次の阻害試験で測定する。

特異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と共に４°Ｃで
１６時間予備インキュベートし、標識抗原１ｒ＋ｇの添
加の後に更に４°Ｃで８時間インキュベートする。その
後家兎免疫グロブリンＧに対する抗体を過剰に加え、更
に４°Ｃで１６時間後に免疫結合体中に結合した抗原を
遠心分離する。未知の試料の阻害活性を非標識抗原の標
準濃度の活性と比較する。

例２ （Ａ）　　ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマウス腫瘍（
ＥＨＳ−肉腫；オーキン（ｏｒｋｉｎ）等によるＪ　、
　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１４５巻（１９７７年）２０
４〜２２０頁参照〕を使用する。組織を、まずプロテア
ーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオリドＣ３ｍ
ｙ／Ｑ　）　、ｐ−クロルメルクリ安息香酸（３ｍｇ／
Ｑ）及びＥＤＴＡ　（０，０１Ｍ）の存在で２０倍過剰
の３．４　Ｍ　ＮａＣｆｆ、　０．０５ＭトリスＨＣＱ
　（ｐＨ７、４）中で２〜３回ホモゲナイズし、抽出可
能な蛋白質を遠心により除去する。次いで残分をプロテ
アーゼ阻害剤の存在下に４℃で０．５　Ｍ　ＮａＣ４，
０，０５トリスＨＣ（１（ｐＨ７，４）で２回Ｉ夜にわ
たり抽出する。抽出物は天然ラミニンを含有し、これを
３．４ＭＮａＣｆｆを用いて沈殿させ、かつ再溶解した
沈殿をアガロースＡ　Ｉ　、　５　ｍ　（Ｉ　Ｍ　Ｃａ
Ｃ（２２）でのりａマドグラフィにかける（０．０５Ｍ
トリス・ＨＣ（１ｐＨ７，４）ことにより付随蛋白質を
分離させる（Ｂ）　　ペプチドラミニンＰＩの製造（Ａ
）に記載の塩抽出物中に残留している不溶の組織残分を
０．５Ｍ酢酸中でホモゲナイズさせ（５０ｍｇ／乾燥重
量！？）　、ＨＣ（ｌの添加によりｐＨを２に調節し、
懸濁液をペプシン（５０ｍｙ／乾燥重量９）の添加の後
に１５℃で２４時間インキュベートする。酵素で溶解さ
せた物質を遠心により単離し、４℃で０．５　Ｍ　Ｎａ
ＣＵ、　０．０５　Ｍトリス（ｐＨ７，４）で透析する
。この溶液から２ＭＮａＣＱを用いてコラーゲン性蛋白
質の混合物を沈殿させ、引続き上澄みを４　Ｍ　ＮａＣ
Ｑで沈殿させることにより、フラグメントラミニンＰ■
の濃度を高める。２ＭＮａＣαまでの沈殿はＣｏ１１　
（ＩＶ）を得るために使用できる。

ラミニアＰ　１を、０．０５Ｍ１−リス−ＨＣ（ｌ　Ｃ
ｐＨ８，６）、２Ｍ尿素中で均衡化し、線状勾配濃度の
ＮａＣｌ２（０〜０．４　Ｍ）で溶離させ、更に精製す
る。最終精製は、コンカナバリンＡ−カラムに結合させ
、０．１Ｍσ−メチルマンノシドを用いて溶離させるこ
とにより行なう。必要な場合には、アガロースＡ　１．
５ｍでのゲル濾過によりなお、更に精製するこきができ
る。組織残分の代りに（Ａ）で得られるラミニンも使用
テキる。

（Ｃ）　　Ｃｏ１１　（■）の製造（参考）ペプチドＣ
ａ１ｌ　（■）の単離のために、（Ｂ）で得たコラーゲ
ン蛋白質の混合物（沈殿、０６５〜２　　　ＮａＣ１を
　０．０５Ｍ）　　リ　ス　−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，４
）　、０．２Ｍ　ＮａＣ０％０．００２Ｍ　ＮａＣ０，
２（ｌ　Ｏｍｙ／ｗｒ（１）中に溶かし、細菌コラゲナ
ーゼ（０，１＋ｎｇ／ｍβ）の添加の後に２０°Ｃ又は
３７℃で１６時間インキュベートする。この場合、ペプ
チドｃｏ１１　（ｒＶ）を除いて全ての他のコラーゲン
は分解されて低分子量ペプチドになるから、これらを透
析により除去する。更にアガロースＡ５Ｍ（ｌ　　Ｍ　
　ＣａＣＯ２、０，０５ト　ｕ７．−ＨＣＱ、　　ｐＨ
７，４）で、かつ引続き、ペプチドを、０．０１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４，０）　、４Ｍ尿素中で均衡化した
ＣＭ−セルロースのカラムに結合させることにより精製
する。線状勾配濃度のＮａＣＱ　（０〜０　、２　Ｍ　
ＮａＣ１２）により純粋なＣｏ１１（ＩＶ）をカラムか
ら溶離させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量２００〜３００ｋを有し、システイン１２〜
   １４モル％を含有し、レクチンに対する高い親和性及び
   コラゲナーゼに対する安定性を有し、プロテアーゼ又は
   臭化シアンを用いるラミニンの分解によるか又はプロテ
   アーゼ阻害剤の存在下で濃塩酸溶液を用い、引続き０．
   ４〜０．６ＭＮａＣｌを用いて基底膜含有組織を抽出し
   、残留分をプロテアーゼと共にインキュベートし、得ら
   れる溶液を透析し、得られる溶液を２Ｍ及び４ＭＮａＣ
   ｌで分別沈殿させ、弱塩基性カチオン交換体を通すクロ
   マトグラフィにかけ、かつレクチンを通すクロマトグラ
   フィにかけて得られたものであることを特徴とする、体
   液中の基底膜物質を免疫学的に測定するために好適なラ
   ミニンフラグメントＰ１。 ２、プロテアーゼ阻害剤の存在で、基底膜含有組織を濃
   塩酸溶液で、かつ引続き０．４〜０．６ＭＮａＣｌで抽
   出することにより得られた不溶性組織残分を、又はラミ
   ニンをプロテアーゼと共にインキュベートし、得られた
   溶液を透析し、この透析した溶液から２Ｍ及び４ＭＮａ
   Ｃｌで沈殿するフラクションを得、弱塩基性カチオン交
   換体を通しかつレクチンを通してクロマトグラフィにか
   けることを特徴とする、ペプチドラミニンＰ１の製法。 ３、基底膜含有出発物質として、ヒト胎盤又はマウスの
   ＥＨＳ−肉腫を使用する、特許請求の範囲第２項に記載
   の方法。