JPH02199A - 基底膜物質の免疫学的測定法のために好適な基底膜ペプチドＣｏｌｌ（４）及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、体液中の基底膜物質（Ｂａｓａｌｍｅｍｂ−
ｒａｎｍａｔｅｒｉａｌ）を免疫学的に測定する方法の
ために好適な基底膜ペプチドＣｏｌ１（ＩＶ）及びその
製法に関する。

多くの疾病（ＷｉＲ病、腎臓病、硬皮症、肝臓繊維症、
血管炎）で、特に血管壁中に基底膜が増加することは公
知である。この血管変化は、従って屡々致死要因となっ
ている。これらの疾病における免疫学的螢光検査によれ
ば、これら基底膜変動は、特にラミニンと称せられる新
規の基底膜成分及び基底膜コラーゲンの高い生成に基づ
くことが判明した。組織学的検査ではこの変動の特異検
査を行なっているが、バイオプシー物質でのみ実施でき
、定量的には評価できない。

従って、本発明は、この問題を血中及び他の体液（床、
腹水）中の基底膜抗原を測定するための定量的かつ特異
的方法を得るための特定の基底膜抗原を得ることである
。

この方法は、体液中の基底膜物質の免疫学的測定法より
なり、これは、測定すべき試料の存在下に抗原としての
標識ラミニン、標識ラミニンフラグメントＰＩ又は標識
基底膜７ラグメントＣｏｌ１　（ＩＶ）をその特異抗体
と共にインキュベートし、生じた抗原−抗体−結合体を
分離し、結合体中又は分離した液体中に含有される標識
抗原の量を測定することよりなる。

前記方法は、３種の基底膜の新規構造蛋白質即ちラミニ
ン、ラミニンフラグメントＰＩ及びコラーゲンペプチド
Ｃｏｌ１（■）の特性付けに基づく。これらの３種の新
規物質殊に２種のフラグメントラミニンＰＩ及びＣｏｌ
ｔ（ＩＶ）は、蛋白質分解及び変性作用に対して高い安
定性を示し、従って体液殊に血液中に良好に立証しうる
量でも現われるから、その定量によって基底膜の増加が
測定できる。

ラミニンは、高分子量の糖蛋白質である。これは、炭水
化物１２〜１５重量％を含有し、分子量８００〜１ｏ０
０ｋを有する糖蛋白質であり、２種の分子量的２２０ｋ
及び４４０にのジスルフィド結合したポリペプチド鎖よ
り成り、プロテアーゼ阻害剤の存在で基底膜含有組織を
濃塩酸溶液で抽出し、引続きこの組織を０．４〜０．６
ＭＮａＣαで抽出し、後者抽出液を３．３〜３　、５　
Ｍ　ＮａＣＱで沈殿させ、再溶解させた沈殿をクロマト
グラフィにかけることにより得られる。

プロテアーゼ例えばペプシンを用いるか又は化学的方法
で例えば臭化シアンを用いるラミニンの分解により、こ
れからラミニンＰＩと称される多大のフラグメントを得
ることができる。

このフラグメントは、直接、組織から得ることもできる
。

ラミニンＰＩは、分子量２００〜３００ｋを有し、シス
ティン１２〜１４モル％を含有し、レクチンに対する高
い親和性及びコラゲナーゼに対する安定性を有し、 ｌ）プロテアーゼ又は臭化シアンを用いてラミニンを分
解するか又は２）プロテアーゼ阻害剤の存在下で基底膜
含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０．４〜０．６　
Ｍ　ＮａＣｌ２で抽出し、残留分をプロテアーゼと共に
インキユベートし、得られる溶液を透析し、得られた溶
液を２Ｍ及び４　Ｍ　ＮａＣＱの間で分別沈殿させ、弱
塩基性カチオン交換体を通すクロマトグラフィにかけ、
レクチンを通すクロマトグラフィにかけることによって
得られる。

ラミニンＰｌに対して高い親和性を有するレクチ・ンの
典型的な例はコンカナバリン（Ｃｏｎｃａ−ｎａｖａｌ
ｉｎ）　Ａ及び麦芽レクチンである。

前記方法で使用できる第３の新規抗原は、基底膜コラー
ゲンのジスルフィドの多い変形体よりなるフラグメント
であり、慣用のプロテアーゼ例えばペプシン及びトリプ
シンに対しても、細菌性コラゲナーゼ（ＣＱ−ヒストリ
ティクム）に対しても抵抗する。これは、Ｃｏｌ　　ｌ
　（ＩＶ）と称され、分子量゛２００〜３００ｋを有し
、システィン２〜５モル％を含有し、軸比ｌ：０、融点
範囲６０〜７０℃の安定なトリペルらせんを有し、コラ
ゲナーゼに対して抵抗し、プロテアーゼ阻害剤の存在で
基底膜含有組織を濃塩酸溶液で、かつ引続き０．４〜０
．６　Ｍ　ＮａＣＱで抽出し、抽出残分をプロテアーゼ
と共にインキユベートし、得られた溶液を透析し、２　
Ｍ　ＮａＣＱで沈殿させ、再溶解した沈殿をコラゲナー
ゼと共にインキュベートし、透析しかつクロマトグラフ
ィで精製することにより得られる。

比較すると、コラーゲンにおける軸比はＩ：２００であ
る。

次表に新規の３種の抗原のアミノｒＩＩＩＩｌｔ、を挙
げる。

ｙｐ ｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。

ｌｙ ｌａ ｙｓ ａ１ ｅｔ １ｅ ｅｕ ｙｒ ｈｅ ｉｓ ｙｌ ｙｓ ｒｇ ラミニン ラミニンＰｌ これらの新規基底膜成分は、前記のように、体液中殊に
血液中の基底膜物質を公知の免疫学的検査法を用いる前
記測定を可能にし、これは、共同の抗体に関する周知量
の標識抗原と被検試料中の未知量の抗原との競争に基づ
く。この場合、公知ラジオイムノアッセイ−（ＲＩ　Ａ
）−変法も、酵素イムノアッセイ−変法及び他の方式の
標識付は例えば螢光標識付け、染料標識付は等を用いる
類似測定法も使用できる。この種の方法は、当業者にと
っては公知である。すべてのこれらの方法は、できるだ
け高純度の抗原を用いて適当な実験動物中に抗血清を作
り、これをそのもの自体として又はこれから単離した特
異抗体を得、場合により抗体もしくは抗血清を固体担体
に結合した後、慣用の抗原−抗体−結合体形成反応を反
応成分相互のインキュベートにより進行させることに基
づく。体液の被検試料中に存在する標識されていない抗
原の量に応じて、この結合体中では標識抗原の１部分の
みが結合しており、結合体の単離によるか又は上澄み中
で測定されうる。結合体中で結合した標識抗原の量は、
結合しなかった抗原の量に関係するから、こうして、体
液中の抗原作用をする基底膜物質の含分を測定すること
ができる抗血清の製造は、常法で実験動物特に家兎に腹
腔内注射することにより行なうことができるこの場合完
全な７０インドのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄｓｃｈｅ
ｎ　Ａｄｊｕｖａｎｓ）の存在で操作するのが有利であ
る。この種の場合に慣用の抗原量は更に加工できる。家
兎使用の際の特に好適な投与量としては、０．５〜１１
１１９／動物が効を奏する。次いで生じた抗血清は当業
者に公知の方法で回収され、そのもの自体として使用さ
れる。血清中に存在する特異抗体を、予め、例えば親和
クロマトグラフィの方法でなお精製することもできる。

抗原の標識付けは、蛋白質の標識付けに公知の方法で実
施できる。放射線核での放射性標識付けの場合は、放射
線核としてヨード１２５を使用する。この放射線核を用
いる標識付けは、公知のクロラミンＴ−法で行なうこと
ができる（Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　２
９巻１８５頁参照）。

前記方法の有利な実施形は、特異抗血清で形成された抗
原−抗体一緒合体を第２の抗体の使用により、結合しな
かった抗原から分離することよりなる。この場合、第２
の抗体として、抗血清を得るために使用しＩ；動物の免
疫グロブリンＧに対する抗体を使用するのが有利である
。

これにより不溶の形に変えられた抗原−抗体一緒合体を
溶液から分離することは、このために慣用の方法例えば
遠心分離、濾過及び類似方法で行なうことができる。抗
血清もしくは抗体を固体担体例えば試験管の内壁に結合
させるのも有利である。

抗原−抗体一緒合体の分離の後に、前記のように、標識
、例えば抗原−抗体一緒合体に結合している又は選択的
に上澄み中に残留している放射能又は酵素活性を測定す
る。公知の抗原含量の試料を用いて製造した較正曲線を
用いて、被検体中に含有される抗原量を測定することが
できる。この場合、原則的に、標識抗原の量（これは、
生じた抗原−抗体一緒合体中に結合している）が少ない
と、被検体中に存在する非標識抗原は多くなる。

前記の免疫学的測定法によれば、ｌｎｇ／＋＋＋ｆｆの
範囲までの濃度の測定が可能である。従って、この方法
を動物及びヒトの体液殊に血液もしくは血清中の基底膜
物質の測定法に使用することができる。正常の個体の場
合に、血清中のこの抗原の濃度は、２０〜５０　ｎｇ／
　ｍＱの範囲内にあり、基底膜変化の際には例えば実験
的糖尿病の際には著るしく高まる。前記方法を用いると
、この種の変化は比較的迅速にかつ確実に測定できる。

前記方法で使用される新規抗原は、原則的に基底膜を含
有するすべての組織から得られる。

得るべき物質の含分が明らかに多いので、ヒトの胎盤が
有利である。同様に、多量の基底膜を形成する特定の腫
瘍組織例えばマウスのＥＨＳ　−肉腫も有利である。

本発明により新規抗原を得る場合に、この組織からの基
底膜の純粋製造は省略される。組織を差当り、プロテア
ーゼ阻害剤の存在で高い塩濃度で抽出すると、この際付
随蛋白質が除かれる。この場合３．４〜４　Ｍ　ＮａＣ
Ｑが有利である。

この抽出のために、組織を差当り常法で粉砕もしくはホ
モゲナイズする。場合により高い塩濃度で数回抽出の後
に、低い塩濃度での、有利に０．４−０．６　Ｍ　Ｎａ
ＣＱでの第２の抽出工程を数回実施することができる。

この場合実際に基底膜コラーゲンは溶解しないが、ラミ
ニンの１部分は溶解する。こうして得た溶液は、ラミニ
ン及びラミニンフラグメントラミニンＰ１を得るために
使用でき、二重塩抽出時に残留する不溶の組織残分は、
フラグメントＣａ１ｌ　（ＩＶ）　ヲ得るための出発物
質として使用されるが、ラミニンＰｉを得るためにも好
適である。

プロテアーゼ阻害剤として例えばフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド、ｐ−クロルメルクリ安息香酸又はエチ
レンジアミンテトラ酢酸が使用される。しかしながら他
のプロテアーゼ阻害剤も好適である。阻害剤は、個々に
又は混合して使用できる。好適な濃度は、通例約１〜５
０ｍｙ／（ｌである。

ラミニン含有抽出物から天然のラミニンが、付随蛋白質
の塩沈殿により分離できる。沈殿は３．３〜３　、５　
Ｍ　ＮａＣ２で行なうのが有利であるこうして得た沈殿
を再び緩衝液中に入れ、例えばアガロースＡ１．５Ｒの
クロマトグラフィにかける。こうして、前記のように、
本発明方法に使用できる前記ラミニンが得られる。

こうして得たラミニンから、フラグメントＰ１は、蛋白
質分解酵素を用いる分解によるか又は化学的方法で例え
ば臭化シアンを用いて得ることができる。約ｐＨ１，５
〜２．５の強酸性溶液中でのペプシンを用いる分解を行
なうのが有利である。こうして得た溶液から、分別塩沈
殿により７ラグメントｐｔを得ることができる。沈殿は
有利に、差当たり２ＭＮａ（ｊ２を用い、かつ引続き４
ＭＮａＣｆｆを用いて行なうのが有利であり、この際最
後の工程でラミニンＰＩが沈殿する。

フラグメントＰｌは、直接、単離する必要のない基底膜
物質から得ることもできる。この有利な取得法では、２
工程塩抽出の不溶組織成分から出発される。残分を懸濁
させ、蛋白分解酵素と共に、この酵素に好適な温度及び
ｐＨ値条件下に、インキュベートする。有利にペプシン
を使用し、約１．５〜２．５のｐＨ−値で常温又は僅か
に低い温度で操作するのが有利である。約１０〜２０℃
が好適である。その後不溶分を分離し、低分子量物質を
透析により除去し、得られた溶液から塩分別により前記
のように、ラミニンＰＩが得られる。沈殿は有利に差当
たり２ＭＮａＣＱで、引続き４ＭＮａＣαを用いて行な
う。

沈殿した７ラクシヨン２〜４　Ｍ　ＮａＣＱから、ラミ
ニンＰＩは、クロマトグラフィにより更に精製できる。

有利に、差当り弱塩基性のカチオン交換体例えばＤＥＡ
Ｅ−セルロース又はＤＥＡＥ　−セファデックスでのク
ロマトグラフィを実施する。精製は、例えば担体結合又
は網状化により不溶性形で存在するレクチンへの結合に
より、かつ引続き適当な炭水化物での溶離により行なう
ことができる。例えば網状化されたデキストラン例えば
アガロースＡ１．５ｍでのゲル濾過も精製のために使用
できる。

フラグメントＣｏｌ１（ＩＶ）を得るために、同様に、
２工程で塩溶液で抽出した組織の溶解溶液から出発する
。プロテアーゼ処理の後に得られる２ＭＮａＣＱまでの
沈殿物を新たに溶解の後に、この酵素に好適な温度及び
ｐＨ値条件でコラゲナーゼと共にインキュベートすると
、Ｃｏｌ１（ＩＶ）を除きすべての余分のコラーゲンが
分解され、透析により除去することができる。精製は、
例えば網状化されたデキストラン及び／又はカルボキシ
メチルセルロースでのモレキュラーシーブタロマドグラ
フィにより行なうことができる。

前記の蛋白質分解法にとってペプシンが有利であるが、
他のプロテアーゼ例えばトリプシンもこのために好適で
ある。化学的分解法も使用できる。これは臭化シアンを
用いて行なうのが有利である。

次に実施例につき本発明を説明する。

例１（参考例） 標識抗原の製造 ラミニンＰｉ又はペプチドＣｏｌ１　（ＩＶ）　２５μ
９をクロラミン−Ｔ−法によりヨード１２５０．５ミリ
キユリーで標識し、結合しなかったヨードを透析又はビ
オ−ゲルＰ−２でのゲル濾過により除く。引続く工程を
有利に非イオン性界面活性剤例えばツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　２０　０．０４％の存在で実施する。抗体との結
合曲線を、標識ペプチドｌｏｇを用いて測定する。

免疫学的測定（ＲＩＡ）の実施 血清又は他の体液中の未知試料中のラミニンＰＩ又はＣ
ｏｌ１（Ｉ’／）の濃度を、次の阻害試験で測定する。

特異抗体又は抗血清の特定量を未知試料と共に４℃で１
６時間予備インキュベートし、標識抗Ｗ　ｌ　ｎｙの添
加の後に更に４℃で８時間インキュベートする。その後
家兎免疫グロブリンＧに対する抗体を過剰に加え、更に
４℃で１６時間後に免疫結合体中に結合した抗原を遠心
分離する。未知の試料の阻害活性を非標識抗原の標準濃
度の活性と比較する。

例２ （Ａ）　　ラミニンの製造 出発物質としてヒトの胎盤又は移植可能なマウス腫瘍（
ＥＨＳ−肉腫；オーキン（ｏｒｋｉｎ）等によるＪ　、
　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１４５巻（１９７７年）２．
０４〜２２０頁参照〕を使用する。組織を、まずプロテ
アーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフル矛リド（３
１１１９／１２　）　、ｐ−クロルメルクリ安息香酸（
３ｍｇ／Ｑ）及びＥＤＴＡ　（０，０１Ｍ）の存在で２
０倍過剰の３．４　Ｍ　ＮａＣＱ、　０．０５Ｍ　ｌ−
ＩＪ　スＨＣ４（ｐＨ７，４）中で２〜３回ホモゲナイ
ズし、抽出可能な蛋白質を遠心により除去する。次いで
残分をプロテアーゼ阻害剤の存在下に４°Ｃで０．５　
Ｍ　ＮａＣＱ、　　０．０５　トリス　ＨＣ（２（ｐＨ
７，４）で２回１夜にわたり抽出する。抽出物は天然ラ
ミニンを含有し、これを３．４ＭＮａＣＱを用いて沈殿
させ、かつ再溶解した沈殿をアガロースＡ　１．５　ｍ
　（Ｉ　Ｍ　ＣａＣｌ２２）でのりｏマドグラフィにか
ける（０．０５Ｍトリス・ＨＣＱｐＨ７，４）ことによ
り付随蛋白質を分離させる（Ｂ）　　ペプチドラミニン
ＰＩの製造（Ａ）に記載の塩抽出物中に残留している不
溶の組織残分を０．５　Ｍｅ醋酸中ホモゲナイズさせ（
５０ｍｇ／乾燥重量ｇ）　、Ｈｃａの添加によりｐｌを
２に調節し、懸濁液をペプシン（５０１１ｇ／乾燥重量
ｇ）の添加の後に１５°Ｃで２４時間インキュベートす
る。酵素で溶解させた物質を遠心により単離し、４℃で
０．５　Ｍ　ＮａＣ（１，０，０５Ｍトリス（ｐＨ７，
４）で透析する。この溶液から２ＭＮａＣＱを用いてコ
ラーゲン性蛋白質の混合物を沈殿させ、引続き上澄みを
４ＭＮａＣＱで沈殿させることにより、フラグメントラ
ミニンＰ１の濃度を高める。２ＭＮａＣＱまでの沈殿は
Ｃｏｌ１　（ＩＶ）を得るために使用できる。

ラミニンＰＩを、０．０５Ｍ１−リス・ＨＣｌ２（ｐＨ
８，６）、２Ｍ尿素中で均衡化し、線状勾配濃度のＮａ
ＣＱ　（０〜０．４　Ｍ）で溶離させ、更に精製する。

最終精製は、コンカナバリン八−カラムに結合させ、Ｏ
、ｌ　Ｍ　ａ−メチルマンノシドを用いて溶離させるこ
とにより行なう。必要な場合には、アガロースＡ１．５
＋Ｉ＋でのゲル濾過によりなお、更に精製することがで
きる。組織残分の代りに（Ａ）で得られるラミニンも使
用できる。

（Ｃ）　　Ｃａ１ｌ　（ＩＶ）の製造 ペプチドＣａ１ｌ　（ＩＶ）の単離のために、（Ｂ）で
得たコラーゲン蛋白質の混合物（沈殿、０．５−２Ｎａ
Ｃ（１）を０．０５Ｍ１−リス−ＨＣ（ｌ　ＣｐＨ７、
４）　、０．２Ｍ　ＮａＣＱ、　０．００２Ｍ　ＮａＣ
ｆｆ２（１０ｍｙ／１Ｒ＜２）中に溶かし、細菌コラゲ
ナーゼ（０，１ｍｇ／ｒｔｒＱ）の添加の後に２０℃又
は３７℃で１６時間インキュベートする。この場合、ペ
プチドＣａ１１　（■）を線いて全ての他のコラーゲン
は分解されて低分子量ペプチドになるから、これらを透
析により除去する。更にアガロースＡ５Ｍ（ｌ　　　Ｍ
　　　ＣａＣ（２２、０，０５ト　　リ　　ス　　−Ｈ
Ｃｆｆ、　　　ｐＨ７，４）で、かつ引続き、ペプチド
を、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）、４Ｍ尿
素中で均衡化Ｌ　ｔニー　ＣＭ−セルロースのカラムに
結合させることにより精製する。線状勾配濃度のＮａＣ
Ｑ　（Ｑ−０、２Ｍ　ＮａＣ１２）により純粋なＣｏｌ
１（ｒＶ）をカラムから溶離させる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分子量２００〜３００ｋを有し、システイン２〜５
   モル％を含有し、軸比１：２０、融点６０〜７０℃の安
   定なトリペルらせんを有し、コラゲナーゼに対して抵抗
   を有し、プロテアーゼ阻害剤の存在下に濃塩酸を用い、
   引続き０．４〜０．６ＭＮａＣｌを用いて基底膜含有組
   織を抽出し、抽出残分をプロテアーゼと共にインキュベ
   ートし、得られた溶液を透析し、２ＭＮａＣｌで沈殿さ
   せ、再溶解した沈殿をコラゲナーゼと共にインキュベー
   トし、透析しかつクロマトグラフィ精製することにより
   得た、体液中の基底膜物質を免疫学的に測定するための
   好適な基底膜ペプチドＣｏｌ１（IV）。 ２、プロテアーゼ阻害剤の存在で、基底膜含有組織を濃
   塩酸溶液でかつ引続き０．４〜０．６ＭＮａＣｌ抽出す
   ることにより得た不溶性組織残分をプロテアーゼと共に
   インキュベートし、得られた溶液を透析し、この透析液
   から２ＭＮａＣｌでＣｏｌ１（IV）を沈殿させ、沈殿を
   再溶解させ、コラゲナーゼと共にインキュベートし、そ
   の後透析しかつクロマトグラフィにかけることを特徴と
   する、基底膜ペプチドＣｏｌ１（IV）の製法。 ３、基底膜含有出発物質として、ヒト胎盤又はマウスの
   ＥＨＳ−肉腫を使用する、特許請求の範囲第２項に記載
   の方法。