JP2532559B2 - ヒトおよび動物組織からの基底膜タンパクの単離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ラミニン（laminin）、ニドジエン（nidogen）および
BM40は基底膜の組織化および細胞と基底膜との相互作用
において主要な役割を有するとされる糖タンパクである
〔Paulsson,M.et al.Eur.J.Biochem.161,455〜464（198
6）,R.Timpl,M.Dziadek,Int,Rev.Exp.Pathol.29,1〜112
（1986）〕すなわち、ラミニンは末梢神経のニユーロン
からのアクソンの派生を助け〔Edgar,D.et al.,EMBO J.
３,1463〜1467（1984）〕また系内でのその再生を助け
る〔Madison et al.Exp.Neurol.88,767〜772（198
5）〕。

これらのタンパクを幅広く用いることは、特にこれら
のタンパクを損傷を与えないでヒト組織から単離するこ
とを可能にする適当な方法がなかつたことから、これま
で妨げられていた。RisteliおよびTimpl〔Biochem.J.19
3,749〜755（1981）〕の記載した方法は、プロテアーゼ
抵抗性ラミニン断片P1のヒト胎盤からの単離を扱つてい
る。この断片は神経および腫瘍細胞の相互作用に重要な
領域８（domain8）をもはや含んでいない。Timpl et a
l.〔J.Biol.Chem.254,9933〜9937（1979）〕の記載した
腫瘍組織からのラミニン単離方法を用いてもヒト胎盤か
らラミニンを可溶化することはできず、またこの方法に
よるときは腫瘍組織からの歩留りは低いものでしかな
い。

Ohno et al.〔Biochem.Biophys.Res.Com.112,1091〜1
098（1983）〕およびWewer et al.〔J.Biol.Chem.258,1
2654〜12660（1983）〕の記載した方法では、有意量の
ラミニンまたはラミニン断片を組織から抽出するには変
性条件またはタンパク分解が必要である。同様に、これ
までニドジエンまたはBM40の単離は変性条件の下でしか
可能ではなかつた〔Dziadek et al.,Eur.J.Biochem.16
1,455〜464（1985）,Paulsson et al.,Eur.J.Biochem.1
56,467〜478,（1986）〕。

今般、本発明の方法を用いることにより、これらの欠
点を克服しそして生物活性物質を損傷を与えることなく
単離することができる。驚くべきことに、キレート化剤
の存在下では水性溶液から完全無傷の基底膜タンパクを
抽出でき、しかも実際にこれまで可能とされていたより
も多量に抽出できる。

従つて、本発明は、キレート化剤を添加した水性溶液
中でヒトまたは動物組織を抽出することより成る該組織
からの基底膜タンパクの単離方法に関する。

すなわち、本発明は下記工程： ａ）基底膜含有組織を、基底膜タンパクの本来のコンホ
メーションを保つ生理学的緩衝液中でプロテアーゼ阻害
剤の存在下において予備抽出し、次に ｂ）ヒトまたは動物組織から基底膜タンパクを、基底膜
タンパクの本来のコンホメーションを保つ緩衝液中でプ
ロテアーゼ阻害剤およびキレート化剤の存在下において
抽出する 工程からなるヒトまたは動物組織からの基底膜タンパク
の抽出方法である。

本発明を以下、特に好ましい態様について詳述する。
本発明はまた特許請求の範囲においても定義される。

本発明の方法を用いれば、基底膜タンパクが存在する
あらゆるタイプのヒトまたは動物組織、例えばヒト胎
盤、ヒトまたは動物腫瘍組織または腎臓などを抽出する
こともできる。最初に予備的抽出を行うこともできる。
組織は基底膜タンパクに対し生理学的である緩衝液中
で、またプロテアーゼ阻害剤の存在下にホモジナイズさ
れ、そして遠心分離される。この処理では易溶性タンパ
ク、例えば血清タンパクや組織の細胞質タンパクなどが
優先的に除かれる。次に組織残渣をもう一度生理学的緩
衝液にとり、そしてプロテアーゼ阻害剤およびキレート
形成剤の存在下にホモジナイズし抽出する。適切なキレ
ート化剤は、有機ポリ酸例えばEDTA、EGTAまたはくえん
酸塩などである。抽出は、１〜500ミリモル/l、好まし
くは10〜50ミリモル/lのキレート化剤を添加し、また０
〜15℃、好ましくは４〜10℃に冷却しながら行う。より
高い温度でもなお抽出可能であるが、その場合には、障
害となる分解反応を伴う。抽出液は所望の基底膜タンパ
クを含有する。一部、共有結合によらないコンプレツク
スとしてのBM40、ニドジエンおよびラミニンは本発明に
より特に好適に単離される。

個々のタンパクは、適当なカラム、例えばデキストラ
ン、特にN,N′−メチレンビスアクリルアミドで架橋さ
れたアリルデキストラン、またはアガロースなどでの分
子ふるいクロマトグラフイにより抽出液から単離され
る。基底膜タンパクの最終精製はタンパクに依存し、そ
して好ましくは弱塩基性イオン交換体を用いて行つた
後、分子ふるいあるいはアガロースまたはSepharoseカ
ラムで更に精製を行う。

このようにして、従来の単離方法では得られない量の
無傷の基底膜タンパクを単離できる。

分画・精製された基底膜タンパクは次いでそれぞれ、
高度に特異的な抗血清または抗体を調製するための抗原
として用いることができる。これは常法により、実験動
物好ましくは兎に皮下または筋肉内注射することによつ
て行われる。これは完全フロインドアジユバントの存在
下に行うのが得策である。これらの場合に慣用される抗
原用量を用いることができる。兎に対して好ましい用量
は0.5〜1mg/匹である。生じた抗血清は次いで当業者に
知られた方法で採取され、そしてそのまま使用できる。
血清中に存在する抗体を予め精製しておくこともでき
る。このための好ましい方法は、アフイニテイクロマト
グラフイである。

精製基底膜タンパクを用いて調製された高度に特異的
な抗血清により、体液、例えば血清、尿など、および組
織抽出液中の基底膜タンパクを自体知られた免疫学的検
出方法を用いて測定することができる。

これらの測定には、既知ラジオイムノアツセイ（RI
A）各種変法、および酵素イムノアツセイ各種変法のい
ずれをも、また類似の方法を用いることができる。

免疫学的測定に必要な抗原の標識はタンパク標識につ
いて知られた方法により行うことができる。放射性物
質、酵素または螢光標識を用いるのが好ましい。放射性
標識の場合、好ましくは使用される放射性核種は沃素−
125である。標識はその場合既知のクロラミンＴ法（In
t.Arch.Allergy29,185,1966）により行うことができ
る。

これらの検出反応において、標識された基底膜タンパ
クは、既知の方式で抗体を求めて拮抗するため、形成さ
れる抗原−抗体コンプレツクス中の標識抗原量は、測定
されるべき検体中に含まれる未標識抗原量が増加するに
つれて減少する。基底膜タンパク含量の分つている検体
を用いて作成された検量プロツトにより検査されるべき
検体中に含まれる抗原量を確定するには、コンプレツク
スの標識、例えば放射能または酵素活性かまたは抗原−
抗体コンプレツクス除去後の上清の標識を用いることが
できる。コンプレツクス中の標識を測定するのが好まし
い。

本発明方法の好ましい一態様は、特異抗血清を用いて
形成された抗原−抗体コンプレツクスを第２抗体を用い
て除去することより成る。この目的に好ましく用いられ
るのは、前記特異抗血清の採取に用いられた生物種の免
疫グロブリンＧに対する抗体である。抗原−抗体コンプ
レツクスはこの目的に慣用される方法、例えば沈殿、遠
心分離または過などを用いて溶液から除去することが
できる。これを代替する方法としては、抗血清または第
２抗体を固体担体に結合させる方法がある。次いで抗原
−抗体コンプレツクス除去後、そのコンプレツクス中に
含まれる、あるいは溶液中に残る放射能または他の標識
を測定する。

基底膜タンパク測定のための酵素イムノアツセイ変法
もまた、関連生物種例えば兎の免疫グロブリンＧに対す
る抗体を酵素標識して行うこともできる。このタイプの
酵素イムノアツセイにおいては、抗原−抗体コンプレツ
クス形成後に残留する抗−基底膜タンパク血清部分を、
当該部分を担体結合基底膜タンパクに結合し次いでそれ
を兎免疫グロブリンＧに対する酵素標識抗体と反応させ
ることによつて測定する。結合酵素標識抗体量は次いで
酵素反応の測定により測定され、また検体中の未知量の
基底膜タンパクに反比例する。

本発明を更に次の実施例で説明する。

実施例１ 基底膜タンパクのラミニン、ニドジエンおよびBM40の単
離 EHS腫瘍細胞をC57B1マウスに皮下注射した〔Orkin et
al.J.Exp.Med.145204（1977）参照〕。10〜14日後腫瘍
を採取し、そして次いで精製される組織材料を−20℃で
貯蔵する。75gの凍結腫瘍を0.05mMフエニルメタンスル
ホニルフルオライド（PMSF）およびＮ−エチルマレイミ
ド（NEM）を含む1.5lの0.15M NaCl、0.05M Tris−HCl
（pH7.4）（TBS）中で１分間ホモジナイズした。8,000
r.p.m.で20分間遠心分離後、上清を捨て、そして残渣を
10mM EDTAを添加した375mlの前記緩衝液中で再びホモジ
ナイズし、そして冷室で１時間攪拌した。前述の遠心分
離後抽出液が得られ、そしてこれを更に直接使用するか
または−20℃で貯蔵した。抽出工程を繰り返すことによ
り目的生成物の収率および純度を更に挙げることができ
た。

そのTBS/EDTA抽出液のアリコートを、2mM EDTA、0.5m
M PMSFおよび0.5mM NEMを含有するTBS中で平衡させてあ
るアガロース（ Biogel A5m）またはSepharose CL−6B
カラム（３×135cm）に通した。これにより３〜４個の
分画範囲に分かれた。まず排除容量中に溶出された材料
はラミニン／ニドジエンコンプレツクスおよび遊離ラミ
ニンを含有し、そして以後の画分は、遊離ニドジエンを
無傷で（分子量150KD）、および部分的に分解された形
（分子量130および100KD）で含有する。次いでBM40が溶
出される。

前記ラミニンは、プロテアーゼ阻害剤を添加した0.05
M Tris−HCl（pH8.6）中の2M尿素を用いて弱塩基性イオ
ン交換体（DEAE−セルロース）でまず精製する。溶出に
は直線NaCl濃度勾配（０〜0.4M）を用いる。この工程で
障害となるプロテオグリカンおよび核酸による汚染が除
去される。最後に、残るニドジエンおよびより小さなタ
ンパクを2Mグアニジニウムクロライド（pH7.4）中Sepha
rose CL−4Bでのクロマトグラフイによりラミニンから
除去する。

ニドジエンはまず、ラミニンについて記載した方法と
同様にしてDEAE−セルロースおよびSepharose CL−4Bで
精製する。必要に応じて、2M尿素、0.02M酢酸ナトリウ
ム（pH4.8）を用いたCM−セルロース、および0.2M NH₄H
CO₃を用いた架橋アリルデキストラン（Sephacryl S20
0）でのクロマトグラフイなど更に精製工程を施す。

同様に、2M尿素、0.05M Tris（pH8.6）を用いたDEAE
−セルロースで、直線NaCl濃度勾配（０〜0.4M NaCl）
を用いて溶出することによりBM40を更に精製する。0.2
〜0.25M NaClでBM40が溶出しそしてこれを最終的に濃縮
後0.2M NH₄HCO₃を用いたSephacryl S200で精製する。

次の表は、例えばこの損傷を与えない抽出を用いてEH
S腫瘍から抽出される無傷な基底膜タンパクの量が従来
方法によつては達し得ないような量であることを例示し
ている。

実施例２ 標識抗原の調製 実施例１と同様にして単離された25μｇの基底膜タン
パクをクロラミンＴ法により0.5mCiのＩ−125で標識し
そして未結合沃素を透析またはポリアクリルアミドゲル
（例えば Biogel P2,Pharmacia Fine Chemicals Inc.
社）でのゲル過により除去する。

実施例３ 免疫学的測定手順 免疫学的測定に必要なすべての工程を0.04％の非イオ
ン洗剤例えばTween20（ポリエトキシル化ソルビタンモ
ノラウレート）などの存在下に行う。結合プロツトは実
施例１と同様にして単離された1ngの標識基底膜タンパ
クを用いて測定する。血清または他の体液の未知検体中
の基底膜タンパク濃度を次の抑制アツセイにより測定す
る： 規定量の特異抗体または抗血清を４℃で16時間未知検
体と予備的にインキユベートし、そして1ngの標識抗原
を添加後、４℃でのインキユベーシヨンを８時間続け
る。次に兎免疫グロブリンＧに対する抗体を過剰に添加
し、そして４℃で更に16時間後、免疫コンプレツクス中
に結合された抗原を遠心分離により除去する。未知検体
の抑制活性を未標識抗原の標準濃度の活性と比較する。

実施例４ 抗血清の調製 実施例１と同様にして単離された基底膜タンパクを0.
5〜1mg/匹の割合で用い、等容の完全フロインドアジユ
バントと混合された抗原溶液を皮下または筋肉内注射す
ることによつて兎を免疫する。初回注射の４週間後に、
完全フロインドアジユバントと混合された等量の抗原溶
液を皮下または筋肉内注射する。第２回注射の４〜８週
間後に血液を集め、そしてこの血液から凝固後抗血清が
得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイートリヒ・ブロツクス ドイツ連邦共和国デー‐6200ヴイースバ ーデン．ゲーテリング９ (72)発明者 ルーペルト・テイムプル ドイツ連邦共和国デー‐8035ガウテイン グ．ユーリウス‐ヘルリンシユトラーセ ３ (72)発明者 マトス・パウルソン ドイツ連邦共和国デー‐8033マルテイン スリート．レントゲンシユトラーセ１ア ー (56)参考文献 特開 昭61−229900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−1353（ＪＰ，Ａ) 日本化学会編「新実験化学講座20生物 化学▲Ｉ▼」丸善（昭53−６−20）Ｐ. ８〜14

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記工程： ａ）基底膜含有組織を、基底膜タンパクの本来のコンホ
   メーションを保つ生理学的緩衝液中でプロテアーゼ阻害
   剤の存在下において予備抽出し、次に ｂ）ヒトまたは動物組織から基底膜タンパクを、基底膜
   タンパクの本来のコンホメーションを保つ緩衝液中でプ
   ロテアーゼ阻害剤およびキレート化剤の存在下において
   抽出する 工程からなるヒトまたは動物組織からの基底膜タンパク
   の抽出方法。
2. 【請求項２】抽出が１〜500mMのキレート化剤を添加し
   て行われる請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載の方法により得ら
   れる基底膜タンパクを用いて、高度に特異的な抗血清ま
   たは抗体を調製する方法。
4. 【請求項４】請求項３に記載の方法により得られた高度
   に特異的な高血清または抗体を用いて体液および組織抽
   出液中の基底膜タンパクを測定する方法。