JPS6296498A - ヒトインタ−ロイキン−１の免疫原性ペプチド類および対応する抗ペプチド抗体 - Google Patents
ヒトインタ−ロイキン−１の免疫原性ペプチド類および対応する抗ペプチド抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトインターロイキン−Ｌ （ＩＬ−１）種
ｐ１６．８の明確な領域に関連した特買性ペプチド類に
関する。本発明はまた合成ペプチド類およびＩＬ−１と
単一特異的に反応する抗体の産生に関する。
ｐ１６．８の明確な領域に関連した特買性ペプチド類に
関する。本発明はまた合成ペプチド類およびＩＬ−１と
単一特異的に反応する抗体の産生に関する。
ヒトＩＬ−１と単一特異的に反応することができる特異
性抗体は精製Ｉ Ｌ −１が抗体産生に十分な量で入手
できず、しかも最適量で入手し得るそれらの製剤は純度
が十分でないことから生産されていない。ジナレロ等Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ１．八ｃａｄ、Ｓｃｉ。
性抗体は精製Ｉ Ｌ −１が抗体産生に十分な量で入手
できず、しかも最適量で入手し得るそれらの製剤は純度
が十分でないことから生産されていない。ジナレロ等Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔ１．八ｃａｄ、Ｓｃｉ。
（１９７７年）第７４巻、４６２４〜４６２７頁は熱不
活化ブドウ球菌の食作用を行なうヒト単球の培養液から
得られるヒト白皿球発熱物質に対する抗血清を最初に産
生じている。次にキャノンおよびジナレロ、サイエンス
（１９８４年）第２２７巻、１２４７〜１２４９頁は分
子量１５，０００〜１７．０００を有するヒｌ−Ｉ Ｌ
−１に対する抗血清を製造している。これらの抗体製
剤のいずれもヒトＩ Ｌ −１の確認された種の間で識
別されずあるいはヒＩ−Ｉ Ｌ −１分子に対する特異
性も示さない。
活化ブドウ球菌の食作用を行なうヒト単球の培養液から
得られるヒト白皿球発熱物質に対する抗血清を最初に産
生じている。次にキャノンおよびジナレロ、サイエンス
（１９８４年）第２２７巻、１２４７〜１２４９頁は分
子量１５，０００〜１７．０００を有するヒｌ−Ｉ Ｌ
−１に対する抗血清を製造している。これらの抗体製
剤のいずれもヒトＩ Ｌ −１の確認された種の間で識
別されずあるいはヒＩ−Ｉ Ｌ −１分子に対する特異
性も示さない。
しかしながら、マウスＩ Ｌ −１に対して特異性を有
する抗体はマウスマクロファージ細胞系から得られるＩ
Ｌ−１を用いてミゼル等１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
する抗体はマウスマクロファージ細胞系から得られるＩ
Ｌ−１を用いてミゼル等１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
（１９８３年）、第１３１巻、１８３４〜１８３７頁に
よって産生されている。抗マウスＴ Ｌ −１抗体はマ
ウスｌ Ｌ −１とヒトインターロイキン−１のｐ＋６
．８に極めて限定された相似性を示ずヒトＩ Ｌ−１と
一部だり交差反応を示している。
よって産生されている。抗マウスＴ Ｌ −１抗体はマ
ウスｌ Ｌ −１とヒトインターロイキン−１のｐ＋６
．８に極めて限定された相似性を示ずヒトＩ Ｌ−１と
一部だり交差反応を示している。
ヒトインターロイキン−１の主な荷電種ｐ■６．ｓを精
製する能力はアミノ酸配列を明瞭にさせた。
製する能力はアミノ酸配列を明瞭にさせた。
アミノ酸配列は、この種のヒトインターロイキンに対す
るクローンＣＤＮＡから１１１論される配列と正確に一
致する。ＩＬ−１の配列の認識はＩＩ、−１の分泌した
形態の種々の部分を合成させた。順次これはヒ） Ｔ
Ｌ−１種ｐ＋６．ｓ分子と完全なＩＬ−１分子の合成ペ
プチド領域と反応する単一特異性抗体の産生を可能にし
ている。ヒトインターロイキン種ｐＩ６．８の精製は１
９８５年８月２６日に出願された米国特許出願番号第７
６９２３１号に開示され、本明細書中に引用される。
るクローンＣＤＮＡから１１１論される配列と正確に一
致する。ＩＬ−１の配列の認識はＩＩ、−１の分泌した
形態の種々の部分を合成させた。順次これはヒ） Ｔ
Ｌ−１種ｐ＋６．ｓ分子と完全なＩＬ−１分子の合成ペ
プチド領域と反応する単一特異性抗体の産生を可能にし
ている。ヒトインターロイキン種ｐＩ６．８の精製は１
９８５年８月２６日に出願された米国特許出願番号第７
６９２３１号に開示され、本明細書中に引用される。
従って本発明の目的は特異性免疫原として作用するヒト
Ｉ Ｌ −１のベプチドザブユニソトを提供することで
ある。他の目的は特異性ペプチド類を高分子量担体タン
パク質に複合させるごとである。
Ｉ Ｌ −１のベプチドザブユニソトを提供することで
ある。他の目的は特異性ペプチド類を高分子量担体タン
パク質に複合させるごとである。
さらに他の目的は合成ベプヂド類に対する単一特異性抗
体を産生ずることである。さらに他の目的は細胞、組織
および体液中のＩ Ｌ−１を検出するために抗ペプチド
抗体を使用することである。本発明のこれらのおよび他
の目的は次の説明から明白となる。
体を産生ずることである。さらに他の目的は細胞、組織
および体液中のＩ Ｌ−１を検出するために抗ペプチド
抗体を使用することである。本発明のこれらのおよび他
の目的は次の説明から明白となる。
精製ヒトインターロイキン−１種ｐＴ６．８の分泌形態
のいくつかの独特なペプチド領域は免疫原性の高いタン
パク質部分と関連した特徴を示ずことが見い出されてお
り、特異性抗ペプチド抗体を産生ずるために使用される
。個々のベプチＦ頬に対して生じる抗体は産生に使用さ
れるペプチドおよび先駆体ＩＩ、−１、ｐＩ６．８と成
熟体または細胞外Ｔ Ｌ −１、ｐ１６．８の両方に単
一特異性である。
のいくつかの独特なペプチド領域は免疫原性の高いタン
パク質部分と関連した特徴を示ずことが見い出されてお
り、特異性抗ペプチド抗体を産生ずるために使用される
。個々のベプチＦ頬に対して生じる抗体は産生に使用さ
れるペプチドおよび先駆体ＩＩ、−１、ｐＩ６．８と成
熟体または細胞外Ｔ Ｌ −１、ｐ１６．８の両方に単
一特異性である。
本発明はヒト細胞外ＩＬ−１、ｐ＋６．８の確認。
１ 領域を構成する特異性−プチドお
よび一プチド頚１ およｌ Ｔ Ｌ −１よ。、
−４□。６ｏつ、−お抗体の産生に関する。
よび一プチド頚１ およｌ Ｔ Ｌ −１よ。、
−４□。６ｏつ、−お抗体の産生に関する。
ヒトＩ Ｌ −１、ｐｒ６．ｓのアミノ酸配列はクロー
ンｃＤＮＡから推論され、（アラロン（Ａｕｒｏｎ）等
（１９８４年）ブロク、ナトル、アカド、サイ。
ンｃＤＮＡから推論され、（アラロン（Ａｕｒｏｎ）等
（１９８４年）ブロク、ナトル、アカド、サイ。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａ’ｔ１．＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）第８
１巻、７９０７〜７９１１頁）さらに精製タンパク質の
アミノ酸配列分析によって確認されている（カメロン（
Ｃａｍｅｒｏｎ ）等（１９８５年）ジェ、エクス、メ
ト（Ｊ、 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、 ）第１６２巻、７９０〜
８０１「 頁。）。ｃＤ’ＮＡによりコードされた完全な先駆体分
子は２６９個のアミノ酸鎖である。細胞外成熟体ＩＬ−
１は次の表で示される通り、およそアラニン（’１１７
）アミノ末端で始まりおよそセリン（２，６９）おそら
くカルボキシル末端で終わる。
１巻、７９０７〜７９１１頁）さらに精製タンパク質の
アミノ酸配列分析によって確認されている（カメロン（
Ｃａｍｅｒｏｎ ）等（１９８５年）ジェ、エクス、メ
ト（Ｊ、 Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、 ）第１６２巻、７９０〜
８０１「 頁。）。ｃＤ’ＮＡによりコードされた完全な先駆体分
子は２６９個のアミノ酸鎖である。細胞外成熟体ＩＬ−
１は次の表で示される通り、およそアラニン（’１１７
）アミノ末端で始まりおよそセリン（２，６９）おそら
くカルボキシル末端で終わる。
ＡＬノ
ＬＹ′
ＥＩ
Ｈ１
ＧＬ’
５ｉ
ＰＲ［
ＬＩ
Ｙｉ
ＧＬ’
ＡＩ
いくつかのペプチドセグメントは無傷のＩ Ｌ −１の
免疫原であり、次の表で示される。
免疫原であり、次の表で示される。
第■表
配列 （７４−ｉ貨１９７−２０７
ＧＬＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＳＥＲＶＡｌ
ΔＳＰ ＰＲＯＬＹＳ 八ＳＮ ＴＹＲＰＲ
Ｏ２０２−２１５八ＳＰ ｒ’１１０ １、ＹＳ
ＡＳＮ ＴＹＲＰＲＯＬＹＳ ＬＹＳ ＬＹＳ
ＭＥＴ Ｇｌ、Ｕ ＬＹｒ ＡＲＧ ＰＩＩ
Ｅ １８８−１９８ ＶＡＬ ＬＥＵ ＬＹＳ
ＡＳＩＩ ＡＳＰ ＬＹＳ Ｐｌ？ＯＴｉ１ｌ
？ １１ ＧＬＮ ｌＡＩＥＵ ＋２５−＋３５ ＴＩＩＲｌ、ｌｉＵ Ａｌ？
Ｇ ＡＳｌｌＳＥＩｉ ＧＬＮ ＧＬＮ ＬＹ
Ｓ ＳＥＲｌ、Ｆｌｆ ｕＡＩ。
ＧＬＮ ＬＥＵ ＧＬＵ ＳＥＲＶＡｌ
ΔＳＰ ＰＲＯＬＹＳ 八ＳＮ ＴＹＲＰＲ
Ｏ２０２−２１５八ＳＰ ｒ’１１０ １、ＹＳ
ＡＳＮ ＴＹＲＰＲＯＬＹＳ ＬＹＳ ＬＹＳ
ＭＥＴ Ｇｌ、Ｕ ＬＹｒ ＡＲＧ ＰＩＩ
Ｅ １８８−１９８ ＶＡＬ ＬＥＵ ＬＹＳ
ＡＳＩＩ ＡＳＰ ＬＹＳ Ｐｌ？ＯＴｉ１ｌ
？ １１ ＧＬＮ ｌＡＩＥＵ ＋２５−＋３５ ＴＩＩＲｌ、ｌｉＵ Ａｌ？
Ｇ ＡＳｌｌＳＥＩｉ ＧＬＮ ＧＬＮ ＬＹ
Ｓ ＳＥＲｌ、Ｆｌｆ ｕＡＩ。
１６４−１７４ ６ＬＮ Ｇ１．Ｙ Ｇ１．Ｕ
ＧＬＵ ＳＲＲＡＳＮ ＡＳＰ ＬＹＳ Ｉ
Ｉ、Ｅ ＰＲ（ｌ ＶＡｋ ｌ、７２−１８４ １ＬＥ ＰＲＯＶＡｌ、
ＡＬＡ ＬＲＩＩ ＧＬＹ ＬＥＵ １．Ｙｓ
ＧＬＩＩ ＬＹＳ ｀ＳＮ ＬＥＤ ＴＹ
Ｉ？ ２５３−２６３ ＴＩＩＲＩＹｓ Ｇｌ、Ｙ
ＧＬＹ ＧＬＮ ＡＳＰ ［１，Ｅ Ｔｌ１
ＲＡＳＰ ｒ’ｌｌｌミ ｓＩＩＲ ＋５０ １６４ Ｇｌ、Ｎ ＡＳｌｌＭＩｉＴ
ＧＬＩＩ Ｇｌ、Ｎ ＧＬＮ ＶＡＩ、ＶＡ
ｉ、Ｉ’ｌｌｌ ＳＩｇＲｌＥＴ ＳＥＲＰＩＫＥ
ＶＡＬ ＧＬＮ１１７ １２８ ＡＬＡ
ＰＲＯＶＡＬ Ａｌ？Ｇ ＳＥＩ？ １．ＲＵ
ＡＳＮ ＣＹＳ ＴＨＲＬＥＵ ＡＲＧ ＡＳ
Ｐ ２５８−２６９ ＡＳＩ〕 Ｉｌ、ｌＥ Ｔｌ
１ｌｉ 八ＳＰ 円圧 ＴＨＲＭＥＴ ＧＩＮ
ＰＩ圧 ＶＡｌ、ＳＥＲ５ＥＰ１ 最初の二つの配列はおよそグルタミン（１９７）で始ま
りおよそフェニルアラニン（２１，５）ｔで続く合成的
（ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ）ペプチドに組み合わされる。
ＧＬＵ ＳＲＲＡＳＮ ＡＳＰ ＬＹＳ Ｉ
Ｉ、Ｅ ＰＲ（ｌ ＶＡｋ ｌ、７２−１８４ １ＬＥ ＰＲＯＶＡｌ、
ＡＬＡ ＬＲＩＩ ＧＬＹ ＬＥＵ １．Ｙｓ
ＧＬＩＩ ＬＹＳ ｀ＳＮ ＬＥＤ ＴＹ
Ｉ？ ２５３−２６３ ＴＩＩＲＩＹｓ Ｇｌ、Ｙ
ＧＬＹ ＧＬＮ ＡＳＰ ［１，Ｅ Ｔｌ１
ＲＡＳＰ ｒ’ｌｌｌミ ｓＩＩＲ ＋５０ １６４ Ｇｌ、Ｎ ＡＳｌｌＭＩｉＴ
ＧＬＩＩ Ｇｌ、Ｎ ＧＬＮ ＶＡＩ、ＶＡ
ｉ、Ｉ’ｌｌｌ ＳＩｇＲｌＥＴ ＳＥＲＰＩＫＥ
ＶＡＬ ＧＬＮ１１７ １２８ ＡＬＡ
ＰＲＯＶＡＬ Ａｌ？Ｇ ＳＥＩ？ １．ＲＵ
ＡＳＮ ＣＹＳ ＴＨＲＬＥＵ ＡＲＧ ＡＳ
Ｐ ２５８−２６９ ＡＳＩ〕 Ｉｌ、ｌＥ Ｔｌ
１ｌｉ 八ＳＰ 円圧 ＴＨＲＭＥＴ ＧＩＮ
ＰＩ圧 ＶＡｌ、ＳＥＲ５ＥＰ１ 最初の二つの配列はおよそグルタミン（１９７）で始ま
りおよそフェニルアラニン（２１，５）ｔで続く合成的
（ｒｅｓｕｌｔａｎｔ ）ペプチドに組み合わされる。
このペプチドは約１９個のアミノ酸を含有し、以後−次
内部ペプチドと呼ばれる。アミノおよびカルボキシル領
域はまた免疫原性ドメインとして機能する。従ってＩ
Ｌ −１、ｐ＋６．８の成熟形態の最初の１２個のアミ
ノ酸をほとんど含有しているおよそアラニン（１１７）
で出発し、およそアスパラギン酸（１２８）まで続くペ
プチドはアミノペプチドと呼ぶ。三番目のペプチドカル
ボキシル末端は、およそアスパラギン酸（２５８）で始
まり、およそセリン（２６９）まで続き冊７−１の最後
の１２個のアミノ酸をほぼ含有し、以後、カルボキシル
ペプチドと呼ぶ。
内部ペプチドと呼ばれる。アミノおよびカルボキシル領
域はまた免疫原性ドメインとして機能する。従ってＩ
Ｌ −１、ｐ＋６．８の成熟形態の最初の１２個のアミ
ノ酸をほとんど含有しているおよそアラニン（１１７）
で出発し、およそアスパラギン酸（１２８）まで続くペ
プチドはアミノペプチドと呼ぶ。三番目のペプチドカル
ボキシル末端は、およそアスパラギン酸（２５８）で始
まり、およそセリン（２６９）まで続き冊７−１の最後
の１２個のアミノ酸をほぼ含有し、以後、カルボキシル
ペプチドと呼ぶ。
本発明のペプチド類はあらゆる適当なペプチド合成技術
、例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ １ｅｌｄ）の
方法（１９６３年）ジェー、アム、ケム、ツク。
、例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ １ｅｌｄ）の
方法（１９６３年）ジェー、アム、ケム、ツク。
Ｕ、 八ｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 ）
第 ８５ 巻、 ２１４９〜２１５４頁による同相ペ
プチド合成化学を用いて合成することができる。第■表
に示されるようにシスティンはアミンあるいはカルボキ
シル末端のいずれか、好ましくは合成中−次内部および
カルボキシルペプチドのアミノ末端に付加して免疫原性
担体にカップリングする遊離のスルフヒドリル基を生成
する。ペプチド類はそれ自体でまたはそのアミドまたは
酸付加塩の形態で使用することができる。
第 ８５ 巻、 ２１４９〜２１５４頁による同相ペ
プチド合成化学を用いて合成することができる。第■表
に示されるようにシスティンはアミンあるいはカルボキ
シル末端のいずれか、好ましくは合成中−次内部および
カルボキシルペプチドのアミノ末端に付加して免疫原性
担体にカップリングする遊離のスルフヒドリル基を生成
する。ペプチド類はそれ自体でまたはそのアミドまたは
酸付加塩の形態で使用することができる。
第■表
ペプチド類は、分取用逆相高性能液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）によって精製し、凍結乾燥する。純度は
分析用逆相ＨＰＴ、Ｃによって確立し、組成はアミノ酸
分析によって確認した。合成ペブチド類は高分子１担体
タンパク質例えばキーホールリンペットヘモシアニン（
ｋｅｙｈｏｌｅ Ｉｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）
またはウシ血清アルブミン、好ましくはキーホールリン
ベットヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）にキタガワ等の方法
（（１９８１年）ケム、ファーム、パル、 （Ｃｈｅ
ｍ、 Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、）第２９巻、１１３０
〜１１３５頁）によって共有結合する。
（ＨＰＬＣ）によって精製し、凍結乾燥する。純度は
分析用逆相ＨＰＴ、Ｃによって確立し、組成はアミノ酸
分析によって確認した。合成ペブチド類は高分子１担体
タンパク質例えばキーホールリンペットヘモシアニン（
ｋｅｙｈｏｌｅ Ｉｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）
またはウシ血清アルブミン、好ましくはキーホールリン
ベットヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）にキタガワ等の方法
（（１９８１年）ケム、ファーム、パル、 （Ｃｈｅ
ｍ、 Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、）第２９巻、１１３０
〜１１３５頁）によって共有結合する。
共有結合したペプチド類は以後ペプチド免疫原と呼ぶ。
異種構造（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）多クローン性抗
体はマウスまたは先天性自己免疫疾患のあるマウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ好ましくはウサ
ギのような動物を免疫アジュバントを用いるかあるいは
用いずに特異性ペプチド免疫原の適当な濃度で免疫感作
することによって生じる。
体はマウスまたは先天性自己免疫疾患のあるマウス、ラ
ット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ好ましくはウサ
ギのような動物を免疫アジュバントを用いるかあるいは
用いずに特異性ペプチド免疫原の適当な濃度で免疫感作
することによって生じる。
免疫前血清は最初の動物免疫感作に先立って集めた。各
動物は許容できる免疫アジュバントと一緒に一回のペプ
チド免疫原５０μｇ〜３００μｇを受ける。かかる許容
できるアジュバンＩ・は完全フロインドアジュバント、
不完全フロインドアシュハント、ミョウバン沈降物、コ
リネバクテリウム、パルブム（ｐａｒν１１「）および
ｔＲＮＡを含有する油中水型エマルジョンを包含するが
、これらに限定されない。最初の免疫感作は多数の皮内
部位においてアジュバント中特異性ペプチド免疫原から
なる。各動物はアジュバント中ペプチド免疫原からなる
ブースター免疫注射を十分な抗体レヘルが得られるまで
受ける。これは通常最初の免疫感作より約３〜約５週間
での注射によって達成される。
動物は許容できる免疫アジュバントと一緒に一回のペプ
チド免疫原５０μｇ〜３００μｇを受ける。かかる許容
できるアジュバンＩ・は完全フロインドアジュバント、
不完全フロインドアシュハント、ミョウバン沈降物、コ
リネバクテリウム、パルブム（ｐａｒν１１「）および
ｔＲＮＡを含有する油中水型エマルジョンを包含するが
、これらに限定されない。最初の免疫感作は多数の皮内
部位においてアジュバント中特異性ペプチド免疫原から
なる。各動物はアジュバント中ペプチド免疫原からなる
ブースター免疫注射を十分な抗体レヘルが得られるまで
受ける。これは通常最初の免疫感作より約３〜約５週間
での注射によって達成される。
最終注射の約１０口後に動物を採血し、血清を集め部分
標本にし、約−２０°Ｃで貯蔵する。
標本にし、約−２０°Ｃで貯蔵する。
抗血清の単位容量当たりの単一特異性ペプチド抗体の濃
度（力価）は固定化ペプチドまたは精製Ｔ Ｌ −１、
種ｐ１６．８のいずれかを使用する同相結合検定を用い
て定量する。個々のペプチド類または純粋なＩＬ−１を
ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル面に吸着させ、特異
性抗血清の種々の希釈度と反応させる。単独のペプチド
に対して誘起される各抗血清は免疫感作ペプチドとのの
反応する。個々のペプチドに対して誘起される３種の血
清のすべてが純粋な無傷Ｉ Ｌ −１と反応する。
度（力価）は固定化ペプチドまたは精製Ｔ Ｌ −１、
種ｐ１６．８のいずれかを使用する同相結合検定を用い
て定量する。個々のペプチド類または純粋なＩＬ−１を
ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル面に吸着させ、特異
性抗血清の種々の希釈度と反応させる。単独のペプチド
に対して誘起される各抗血清は免疫感作ペプチドとのの
反応する。個々のペプチドに対して誘起される３種の血
清のすべてが純粋な無傷Ｉ Ｌ −１と反応する。
固相免疫放射線検定は種々の抗ペプチド抗血清が無傷Ｉ
Ｌ−］分子の適当なドメインを認識することを示すため
に使用する。ポリ塩化ビニル面は種々の濃度のＩ Ｌ−
１で被覆され、種々の希釈度で個々の抗血清と接触させ
る。結合検定は免疫血清の一定のペプチドおよびＩＬ−
１への結合は、関連のあるペプチドによる線量依存方法
で遮断されるが関連のないペプチドは遮断しなかったこ
とを示す。関連のあるペプチドは特異性抗体を誘発する
ために用いられるペプチドであり、例えばアミノペプチ
ドを抗アミノペプチド抗体を産生ずるために使用する場
合、アミノペプチドは関連のあるペプチドである。関連
のないペプチＦは抗体合成を誘発するために用いられる
もの以外のあらゆるペプチドである。
Ｌ−］分子の適当なドメインを認識することを示すため
に使用する。ポリ塩化ビニル面は種々の濃度のＩ Ｌ−
１で被覆され、種々の希釈度で個々の抗血清と接触させ
る。結合検定は免疫血清の一定のペプチドおよびＩＬ−
１への結合は、関連のあるペプチドによる線量依存方法
で遮断されるが関連のないペプチドは遮断しなかったこ
とを示す。関連のあるペプチドは特異性抗体を誘発する
ために用いられるペプチドであり、例えばアミノペプチ
ドを抗アミノペプチド抗体を産生ずるために使用する場
合、アミノペプチドは関連のあるペプチドである。関連
のないペプチＦは抗体合成を誘発するために用いられる
もの以外のあらゆるペプチドである。
無傷ＩＬ−１に対する抗ペプチド抗血清の特異性は刺激
されたヒト末梢血液単核細胞の培養から誘導される粗濃
縮上澄み液のウェスターンプロット分析法の抗血清を用
いて試験する（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ） （１９
８４年）ジュー。エクス、メト。
されたヒト末梢血液単核細胞の培養から誘導される粗濃
縮上澄み液のウェスターンプロット分析法の抗血清を用
いて試験する（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ） （１９
８４年）ジュー。エクス、メト。
（Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、）第１６０巻、７７２〜７
８７頁）。
８７頁）。
粗濃縮培養上澄み液は還元条件下１５％均質ゲル中ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ニトロセ
ルロースペーパーに移動させる。ペーパーを抗ペプチド
抗血清および＋２Ｊ４ｐ識プロテインＡと反応させ、オ
ートラジオグラフィーで試験する。３種のペプチドに対
する抗体は粗上澄み液でシングルバンドを認識する。移
動特性およびバンドの位置は純粋なｒＬ−１のそれと正
確に一致する。抗ペプチド抗血清はまた刺激単球から得
られる先駆体ＩＬ−１と反応する。単球溶解物のウェス
ターンプロット分析はペプチドに対する抗体が先駆体Ｔ
Ｌ −１に対応する約３３，０００の分子量を有する
シングルハンドを認識することを示した。
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ニトロセ
ルロースペーパーに移動させる。ペーパーを抗ペプチド
抗血清および＋２Ｊ４ｐ識プロテインＡと反応させ、オ
ートラジオグラフィーで試験する。３種のペプチドに対
する抗体は粗上澄み液でシングルバンドを認識する。移
動特性およびバンドの位置は純粋なｒＬ−１のそれと正
確に一致する。抗ペプチド抗血清はまた刺激単球から得
られる先駆体ＩＬ−１と反応する。単球溶解物のウェス
ターンプロット分析はペプチドに対する抗体が先駆体Ｔ
Ｌ −１に対応する約３３，０００の分子量を有する
シングルハンドを認識することを示した。
抗ペプチド抗血清はまたヒ）ＩＬ−１を免疫沈降する。
ヒトＩＬ−１の先駆体また−は細胞内形態は破壊した刺
激単球力゛ら見い出され、分子量約３３キロダルトン（
ｋｄ）の特徴がある。ヒトＩＬ−１の成熟体または細胞
外形態は刺激単球の培養液から得られる。単球が増殖す
る培養液は１５Ｓ−メチオニンを含有し、Ｉ Ｌ −１
の先駆体および成熟体形前の両方に結合される。アガロ
ースビーズをプロティンＡで被覆し、免疫前または免疫
血清と接触させる。ビーズ−プロティンＡ−血清複合体
は先駆体または成熟体ヒｌ−Ｉ Ｌ−１と反応する。ビ
ーズを洗浄し、すべての沈降物を溶解し、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分離する。破壊単球の免疫
沈降は先駆体ＩＬ−］、ｐ１６．８の特徴である優性３
５３−標識３３ｋｄハンドを示す。培養上澄み液の免疫
沈降はヒｌ−ｒ Ｌ −１の成熟細胞外形態の特徴であ
るｌ ７ｋｄハンドを示す。免疫前血清はＩ Ｌ−１の
いずれの形態も沈降しない。
激単球力゛ら見い出され、分子量約３３キロダルトン（
ｋｄ）の特徴がある。ヒトＩＬ−１の成熟体または細胞
外形態は刺激単球の培養液から得られる。単球が増殖す
る培養液は１５Ｓ−メチオニンを含有し、Ｉ Ｌ −１
の先駆体および成熟体形前の両方に結合される。アガロ
ースビーズをプロティンＡで被覆し、免疫前または免疫
血清と接触させる。ビーズ−プロティンＡ−血清複合体
は先駆体または成熟体ヒｌ−Ｉ Ｌ−１と反応する。ビ
ーズを洗浄し、すべての沈降物を溶解し、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分離する。破壊単球の免疫
沈降は先駆体ＩＬ−］、ｐ１６．８の特徴である優性３
５３−標識３３ｋｄハンドを示す。培養上澄み液の免疫
沈降はヒｌ−ｒ Ｌ −１の成熟細胞外形態の特徴であ
るｌ ７ｋｄハンドを示す。免疫前血清はＩ Ｌ−１の
いずれの形態も沈降しない。
個々のペプチド免疫原に対して誘起された抗血清は組織
培養および組織切片の刺激単球および他の細胞タイプ例
えば上皮細胞中ＩＬ−１、ｐｒｅ、ｇの存在を検出する
ために使用する。この高特異性異種構造抗血清はＩ Ｌ
−１の成熟形態だけでなく単球および表皮ケラチン細
胞を包含する細胞の細脂質に局在する先駆体分子の検出
も可能である。
培養および組織切片の刺激単球および他の細胞タイプ例
えば上皮細胞中ＩＬ−１、ｐｒｅ、ｇの存在を検出する
ために使用する。この高特異性異種構造抗血清はＩ Ｌ
−１の成熟形態だけでなく単球および表皮ケラチン細
胞を包含する細胞の細脂質に局在する先駆体分子の検出
も可能である。
ヒト単核血液細胞を集め、不連続密度勾配遠心法によっ
て精製する。単核細胞を刺激剤例えば、植物凝集素およ
びリボ多糖の存在下栄養培地で培養する。約４．５時間
培養した細胞をマクレーン（Ｍｃｌｅａｎ）およびナカ
ネ（１９７４）ジェー、ヒストゲム、ザイトケム、
（Ｊ、 ｌＩｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）
第２２巻、１０７７〜１０８３頁の技術に従って固定し
、リン酸塩緩１（ｊ食塩水中約０，１％トリトンＸ−１
００で処理して透過性にする。細胞を洗浄し、抗ペプチ
ドまたは抗ペプチド抗血清と同し動物から免疫感作前に
冑られ、洗浄し、フルオレスセインイソチオシアネーｈ
（ＦＩＴＣ）−複合ヤギ抗−勺すギＴ Ｆ． Ｃて染色
した免疫前血清のいずれかと接触さ一ロろ。処理細胞を
内部螢光に対して顕微鏡的に観察する。抗ペプチド抗血
清と反応し、ＦＩＴＣ−複合抗ーウサギ１ｇＧで染色し
た際核形熊によって単球として識別される刺激細胞は強
烈な細胞質螢光を示す。関連のあるペプチドと抗血端の
前培養は螢光染色がないが、関連のないぺプチドはなく
ならない。抗ペプチド抗体は細胞標本中に存在するリン
パ球または血小板と反応しない。前免疫血清は、細胞内
Ｉ Ｌ − １を含有する刺激卓球に結合しない。
て精製する。単核細胞を刺激剤例えば、植物凝集素およ
びリボ多糖の存在下栄養培地で培養する。約４．５時間
培養した細胞をマクレーン（Ｍｃｌｅａｎ）およびナカ
ネ（１９７４）ジェー、ヒストゲム、ザイトケム、
（Ｊ、 ｌＩｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）
第２２巻、１０７７〜１０８３頁の技術に従って固定し
、リン酸塩緩１（ｊ食塩水中約０，１％トリトンＸ−１
００で処理して透過性にする。細胞を洗浄し、抗ペプチ
ドまたは抗ペプチド抗血清と同し動物から免疫感作前に
冑られ、洗浄し、フルオレスセインイソチオシアネーｈ
（ＦＩＴＣ）−複合ヤギ抗−勺すギＴ Ｆ． Ｃて染色
した免疫前血清のいずれかと接触さ一ロろ。処理細胞を
内部螢光に対して顕微鏡的に観察する。抗ペプチド抗血
清と反応し、ＦＩＴＣ−複合抗ーウサギ１ｇＧで染色し
た際核形熊によって単球として識別される刺激細胞は強
烈な細胞質螢光を示す。関連のあるペプチドと抗血端の
前培養は螢光染色がないが、関連のないぺプチドはなく
ならない。抗ペプチド抗体は細胞標本中に存在するリン
パ球または血小板と反応しない。前免疫血清は、細胞内
Ｉ Ｌ − １を含有する刺激卓球に結合しない。
また抗ペプチド抗血清は、急性または慢性炎症疾患の個
体から得られる組織切片の細胞に産生ずるＩＬ−１に結
合する。重い歯槽膿漏の患者の炎症を起こした歯肉を包
埋し、調製した切片を凍結した。切片を抗ペプチド抗体
と反応させ、洗ηトし、ＦＩＴＣ−複合抗ーラビットＴ
ｇＧで染色した。
体から得られる組織切片の細胞に産生ずるＩＬ−１に結
合する。重い歯槽膿漏の患者の炎症を起こした歯肉を包
埋し、調製した切片を凍結した。切片を抗ペプチド抗体
と反応させ、洗ηトし、ＦＩＴＣ−複合抗ーラビットＴ
ｇＧで染色した。
顕微鏡試験は表皮ケラチン細胞中Ｉ Ｌ − １を示し
た。免疫前血清で処理した際これらの細胞は染色を示さ
なかった。
た。免疫前血清で処理した際これらの細胞は染色を示さ
なかった。
ｌ Ｌ − １、ｐＴ６．８の公知の領域の等質的に純
粋な種と反応することができる特異抗ペプヂド抗体の有
効性は種々の免疫細胞化学および血清学的検定によって
細胞内先駆体Ｔ Ｌ − １および細胞外成熟体ＩＬ−
１の両方の検出が可能である。栄球が優位なＩＬ−１含
有細胞がほとんどの急性および慢性炎症応答に伴うため
に免疫細胞化学技術によるＩ Ｌ − １含有細胞の検
出能は、これらの疾患症状を診断する有効性を増大する
。実際にＩＬ−１産生細胞の数およびタイプの迅速且つ
特定の検出は病理学的に類イ以の疾患症状を診断する能
力を高める。抗ペプチド抗体の特異的免疫沈降物ヒトＴ
Ｌ − １に対する能力は細胞のないヒトＩ Ｉ−
− １の存在を検出する免疫検定の範囲を拡大する。抗
ペプチド抗体は生物流体例えば血液、血清、リンパまた
は尿でおよびヒ１〜の細胞および組織から調製した抽出
物でラジオイムノアッセイ （ＲＩＡ）により抗原を検
出することができる。逆に精製ＩＴ、−１および合成ペ
プチドを自己免疫疾患の特定タイプに包含される抗−Ｉ
Ｌ−１抗体を検出するためにラジオイムノアッセイで使
用する。ＲＩＡは血清または血漿のような体液中のＩＬ
−１の存在を検出することができる。
粋な種と反応することができる特異抗ペプヂド抗体の有
効性は種々の免疫細胞化学および血清学的検定によって
細胞内先駆体Ｔ Ｌ − １および細胞外成熟体ＩＬ−
１の両方の検出が可能である。栄球が優位なＩＬ−１含
有細胞がほとんどの急性および慢性炎症応答に伴うため
に免疫細胞化学技術によるＩ Ｌ − １含有細胞の検
出能は、これらの疾患症状を診断する有効性を増大する
。実際にＩＬ−１産生細胞の数およびタイプの迅速且つ
特定の検出は病理学的に類イ以の疾患症状を診断する能
力を高める。抗ペプチド抗体の特異的免疫沈降物ヒトＴ
Ｌ − １に対する能力は細胞のないヒトＩ Ｉ−
− １の存在を検出する免疫検定の範囲を拡大する。抗
ペプチド抗体は生物流体例えば血液、血清、リンパまた
は尿でおよびヒ１〜の細胞および組織から調製した抽出
物でラジオイムノアッセイ （ＲＩＡ）により抗原を検
出することができる。逆に精製ＩＴ、−１および合成ペ
プチドを自己免疫疾患の特定タイプに包含される抗−Ｉ
Ｌ−１抗体を検出するためにラジオイムノアッセイで使
用する。ＲＩＡは血清または血漿のような体液中のＩＬ
−１の存在を検出することができる。
次の実施例は本発明を具体的に説明するものであるがそ
れらに限定されるものではない。
れらに限定されるものではない。
第■表で示した３種のペプチドをｔ−ＢＯＣ化学および
ＳＡＭ ＴＷＯペプチドシンセサイザー（パイオサ−
千社）を用いて合成した。アミノペプチドおよび一次内
部ペプチドの合成はＣ−末端アミドを得るために４−メ
チルベンツヒドリルアミン樹脂で行なった。カルボキシ
ルペプチドを標準メリフィールド樹脂で合成した。合成
操作はＳＡＭ ＴＷＯペプチドシンセサイザーオペレ
ーターズマニュアル（バイオサーチ、１９８５年）に詳
細に記載される。適当な樹脂から合成ペプチドの脱離は
ＳＡＭ ＴＷＯオペレーターズマニュアルに略述され
る操作によるバイオサーチフッ化水素装置のフッ化水素
で処理することによって達成される。ペプチドはＳＡＭ
ＴＷＯオペレーターズマニュアルに記載される１８
個の炭素原子を有するアルキルシラン基質を使用する高
性能液体クロマトグラフによって精製した。個々のペプ
チドの純度はまたＳＡＭ ＴＷＯオーナーズマニュア
ルに記載されるセント操作により逆相高性能液体クロマ
トグラフィ（Ｉ（ＰＬＣ）およびアミノ酸分折によって
評価した。合成したペプチドをキタガワ等（１９８１年
）ケム、ファーム、ハル。
ＳＡＭ ＴＷＯペプチドシンセサイザー（パイオサ−
千社）を用いて合成した。アミノペプチドおよび一次内
部ペプチドの合成はＣ−末端アミドを得るために４−メ
チルベンツヒドリルアミン樹脂で行なった。カルボキシ
ルペプチドを標準メリフィールド樹脂で合成した。合成
操作はＳＡＭ ＴＷＯペプチドシンセサイザーオペレ
ーターズマニュアル（バイオサーチ、１９８５年）に詳
細に記載される。適当な樹脂から合成ペプチドの脱離は
ＳＡＭ ＴＷＯオペレーターズマニュアルに略述され
る操作によるバイオサーチフッ化水素装置のフッ化水素
で処理することによって達成される。ペプチドはＳＡＭ
ＴＷＯオペレーターズマニュアルに記載される１８
個の炭素原子を有するアルキルシラン基質を使用する高
性能液体クロマトグラフによって精製した。個々のペプ
チドの純度はまたＳＡＭ ＴＷＯオーナーズマニュア
ルに記載されるセント操作により逆相高性能液体クロマ
トグラフィ（Ｉ（ＰＬＣ）およびアミノ酸分折によって
評価した。合成したペプチドをキタガワ等（１９８１年
）ケム、ファーム、ハル。
（Ｃｈｅｍ、 Ｐｈａｒｍ、 Ｂｕｌｌ、）第２９巻、
１１３０〜１１３５頁の方法によってギーホールリンペ
ットヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）に結合した。
１１３０〜１１３５頁の方法によってギーホールリンペ
ットヘモシアニン（Ｋ Ｌ Ｈ）に結合した。
ＮＺＷウサギ（１，５ｋｇ）の３つのグループを採血し
た後、皮内の多数部位において完全フロイントアジュハ
ン１〜中各ペプチド−Ｋ Ｌ Ｈ複合体、ペプチド免疫
原２００１ｚｇで免疫感作した。不完全フロイン１〜ア
ジユバントの複合体を３週間と５週間後に皮下の多数部
位に繰り返し、注射した。最後の免疫感作の１０日後に
ウサギの採血をし、血清を部分標本にし、−２０℃で凍
結した。
た後、皮内の多数部位において完全フロイントアジュハ
ン１〜中各ペプチド−Ｋ Ｌ Ｈ複合体、ペプチド免疫
原２００１ｚｇで免疫感作した。不完全フロイン１〜ア
ジユバントの複合体を３週間と５週間後に皮下の多数部
位に繰り返し、注射した。最後の免疫感作の１０日後に
ウサギの採血をし、血清を部分標本にし、−２０℃で凍
結した。
至
各ペプチド−Ｋ Ｌ Ｈ複合体に生しる抗血清の力価は
固定化ペプチドまたは純粋なＩＬ−１（ｐ１６．８）の
いずれかを使用する同相結合検定を用いて定量した。ペ
プチド（５００ｎｇ／ｍｐ）または純粋なＩ Ｌ−１（
５００ｒ＋ｇ／ｍ７りをリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ Ｂ
Ｓ） 、ｐＨ７，２中可撓性ポリ塩化ビニルマイクロタ
イターウエル（ダイナチク）に４°Ｃで一晩結合させて
おいた。翌日１．５％ウマ血清（ＴＴＳ）を含有するＰ
ＢＳでウェルを洗浄した後、１０％Ｈ３を含有するＰＢ
Ｓで２時間室温で遮断した。次にＰＢＳ／１．５％ＨＳ
で希釈した抗血清を１００μｌ容量に適用し、室温で２
時間放置した。ＰＢＳ／１．５％Ｈ３で３回洗浄した後
、＋′Ｉ標識プロティンＡ １００ 、ｊ／ （１（１
００，０００ｃｐｍ／ウェル、 Ｉ Ｘ １０ ”
ｃｐｍ／ｍｇ）を各ウェルに添加し、室温で２時間培養
した。５回洗浄した後、プレートを乾燥した。ウェルの
底を熱線で除去し、ガンマカウンターで計数した。次の
結果が得られた。
固定化ペプチドまたは純粋なＩＬ−１（ｐ１６．８）の
いずれかを使用する同相結合検定を用いて定量した。ペ
プチド（５００ｎｇ／ｍｐ）または純粋なＩ Ｌ−１（
５００ｒ＋ｇ／ｍ７りをリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ Ｂ
Ｓ） 、ｐＨ７，２中可撓性ポリ塩化ビニルマイクロタ
イターウエル（ダイナチク）に４°Ｃで一晩結合させて
おいた。翌日１．５％ウマ血清（ＴＴＳ）を含有するＰ
ＢＳでウェルを洗浄した後、１０％Ｈ３を含有するＰＢ
Ｓで２時間室温で遮断した。次にＰＢＳ／１．５％ＨＳ
で希釈した抗血清を１００μｌ容量に適用し、室温で２
時間放置した。ＰＢＳ／１．５％Ｈ３で３回洗浄した後
、＋′Ｉ標識プロティンＡ １００ 、ｊ／ （１（１
００，０００ｃｐｍ／ウェル、 Ｉ Ｘ １０ ”
ｃｐｍ／ｍｇ）を各ウェルに添加し、室温で２時間培養
した。５回洗浄した後、プレートを乾燥した。ウェルの
底を熱線で除去し、ガンマカウンターで計数した。次の
結果が得られた。
ごフ’（−ＩＩ ＩＬ−１用１釈度
・□吐Ｖｉ・Ｘ Ｌ 、０・’ ・
１０−’ ２４ ０．８ ２
０ １１０’−２２６０，５１５０，８ １０−３１５０，３８０，５ １０−’ ６ ０．３
３ ０．３これらの結果はアミノペプチ
ド免疫原で免疫感作したウサギから得られた血清が誘起
されるアミノペプチドだけでなく、無傷ＩＬ−１にも線
量依存方法で結合したことを示す。免疫前血清は、関連
のあるペプチド又は無傷Ｉ Ｌ−１のいずれにも結合し
なかった。一致した結果が一次内部ペプチドおよびカル
ボキシルペプチドで免疫感作したウサギから得られる血
清で見られた。抗血清の力価は種々のペプチド免疫原で
免疫感作したウサギで得られたものが代表例である。
・□吐Ｖｉ・Ｘ Ｌ 、０・’ ・
１０−’ ２４ ０．８ ２
０ １１０’−２２６０，５１５０，８ １０−３１５０，３８０，５ １０−’ ６ ０．３
３ ０．３これらの結果はアミノペプチ
ド免疫原で免疫感作したウサギから得られた血清が誘起
されるアミノペプチドだけでなく、無傷ＩＬ−１にも線
量依存方法で結合したことを示す。免疫前血清は、関連
のあるペプチド又は無傷Ｉ Ｌ−１のいずれにも結合し
なかった。一致した結果が一次内部ペプチドおよびカル
ボキシルペプチドで免疫感作したウサギから得られる血
清で見られた。抗血清の力価は種々のペプチド免疫原で
免疫感作したウサギで得られたものが代表例である。
競合的固相結合実験は種々の抗ペプチド抗血清が無傷Ｉ
Ｌ−１分子の適当なドメインを識別することを示す。ア
ミノペプチド免疫原に誘起された抗血清の単一の飽和上
希釈（ｓｕｂ−ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）を関連のあるペ
プチド、アミノペプチドまたは関連のないペプチド、−
次内部ペプチドの増加量でアミノペプチドまたは純粋な
ＴＬ−１で被覆したウェルで検定する前に前培養した。
Ｌ−１分子の適当なドメインを識別することを示す。ア
ミノペプチド免疫原に誘起された抗血清の単一の飽和上
希釈（ｓｕｂ−ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）を関連のあるペ
プチド、アミノペプチドまたは関連のないペプチド、−
次内部ペプチドの増加量でアミノペプチドまたは純粋な
ＴＬ−１で被覆したウェルで検定する前に前培養した。
づＡ月α被覆ルにフ〉二上セレ」３被箭いζへ＝上町？
容１十ペプチド の瀉瓜 前培養した抗血清 前
培養したＩ；ＣＪ而面、（！ｕ”’．’％ − 関
連のある 関連のない 関連のある 関連のない
づり（チ」ニー づ〕−チトー つ乞こゾ二
［ ボッ）（」士−−・□」ヱＭー入↓度） ー・
・，・□１０’ ２３ ２３
８ １０１０”
１７ ２３ ２ １
０１０’ ２ ２３
０．５ １０免疫血清のペプチドおよび
ＩＬ−１への結合は線量依存方法で関連のあるペプチド
によって遮断されるが関連のないペプチドはいずれの場
合にも遮断しなかった。−次内部ペプチドおよびカルボ
キシルペプチドに対する抗血清で同様の結果が得られた
。
容１十ペプチド の瀉瓜 前培養した抗血清 前
培養したＩ；ＣＪ而面、（！ｕ”’．’％ − 関
連のある 関連のない 関連のある 関連のない
づり（チ」ニー づ〕−チトー つ乞こゾ二
［ ボッ）（」士−−・□」ヱＭー入↓度） ー・
・，・□１０’ ２３ ２３
８ １０１０”
１７ ２３ ２ １
０１０’ ２ ２３
０．５ １０免疫血清のペプチドおよび
ＩＬ−１への結合は線量依存方法で関連のあるペプチド
によって遮断されるが関連のないペプチドはいずれの場
合にも遮断しなかった。−次内部ペプチドおよびカルボ
キシルペプチドに対する抗血清で同様の結果が得られた
。
ポリスチレンマイクロタイターウェル（ダイナチク）を
０．０１５Ｍ炭酸す１〜リウム緩衝液ｐｌ＋９．６中０
．４〜５ ０ ｐｇ ／ｍｅの種々の濃度のＩＩ、−１
で一晩４℃で被覆した。翌ロウエルをＰＢＳｌｏ、０５
％トウィーンで３回洗浄した後、１％ゼラチン／Ｐ Ｂ
Ｓ／ ）ウィーンで１時間室温で遮断した。ＰＢＳ／
トウィーン中−次内部ペブチｌに対する抗血清の連続対
数希釈をウェルにＩ ０ ０ ｌｔ Ｉ。
０．０１５Ｍ炭酸す１〜リウム緩衝液ｐｌ＋９．６中０
．４〜５ ０ ｐｇ ／ｍｅの種々の濃度のＩＩ、−１
で一晩４℃で被覆した。翌ロウエルをＰＢＳｌｏ、０５
％トウィーンで３回洗浄した後、１％ゼラチン／Ｐ Ｂ
Ｓ／ ）ウィーンで１時間室温で遮断した。ＰＢＳ／
トウィーン中−次内部ペブチｌに対する抗血清の連続対
数希釈をウェルにＩ ０ ０ ｌｔ Ｉ。
容量で通用し、室温で１時間培養した。３回洗浄した後
ＰＢＳ／トウィーンで１ ： １０００に赤釈した親和
性精製ヤギ抗うザギＩｇＧーホースラディシュパーオキ
シダーゼ複合体（バイオラド）１００μｐをウェルに添
加し、室温で１時間培養した。３回洗浄した後、基９（
２．２’−アジノージ−（３〜エチルヘンツチアプリン
スルホネート）ＡＢＴＳ）、キルケガードおよびベリー
ラボラトリーズ（）［ｉｒｋｅｇａａｘａｎｄ Ｐｅｒ
ｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ）１００μｐを添
加し、１０分培養して、５％Ｆ′デシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ １ ０ ０μｐと〕冷した。
ＰＢＳ／トウィーンで１ ： １０００に赤釈した親和
性精製ヤギ抗うザギＩｇＧーホースラディシュパーオキ
シダーゼ複合体（バイオラド）１００μｐをウェルに添
加し、室温で１時間培養した。３回洗浄した後、基９（
２．２’−アジノージ−（３〜エチルヘンツチアプリン
スルホネート）ＡＢＴＳ）、キルケガードおよびベリー
ラボラトリーズ（）［ｉｒｋｅｇａａｘａｎｄ Ｐｅｒ
ｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） ）１００μｐを添
加し、１０分培養して、５％Ｆ′デシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ １ ０ ０μｐと〕冷した。
次に光学密度をマルチスギャンプレートリーダー（タイ
ターチック （Ｔｉｔｅｒｔｅｋ） ）の４０５１で読
み取り、次の結果を得た。
ターチック （Ｔｉｔｅｒｔｅｋ） ）の４０５１で読
み取り、次の結果を得た。
Ｔ Ｌ− Ｈ−ｒ＃（ｎ ／ウェル
血清 を土 １ 王立 葺至
■皿 −一友ー≠ー茫一良一一一一一一一一１０−
’ ０．４０ ０．９，１ １．１０
１．２０１０−２０．２１． ０．８４
１．０９ １．１８１０−’ Ｏ．
Ｌ７ ０．５３ ０．９５ １．０９
１０−’ ０．１０ ０．２３ ０．
５５ ０．７５１０−’ ０．０９
０．１２ ０．２３ ０．３５１０−’＝
０．０８ ０．０９ ０．１
５ ０．２７ウェルを被覆するために使用した
ＩＬ−１ｉとして増加させた免疫血清の各濃度で得た発
色団の量は増加した。ｒＬ−１および血清の最高濃度を
使用した時にも前免疫血清で感知できる吸光度は得られ
なかった。
■皿 −一友ー≠ー茫一良一一一一一一一一１０−
’ ０．４０ ０．９，１ １．１０
１．２０１０−２０．２１． ０．８４
１．０９ １．１８１０−’ Ｏ．
Ｌ７ ０．５３ ０．９５ １．０９
１０−’ ０．１０ ０．２３ ０．
５５ ０．７５１０−’ ０．０９
０．１２ ０．２３ ０．３５１０−’＝
０．０８ ０．０９ ０．１
５ ０．２７ウェルを被覆するために使用した
ＩＬ−１ｉとして増加させた免疫血清の各濃度で得た発
色団の量は増加した。ｒＬ−１および血清の最高濃度を
使用した時にも前免疫血清で感知できる吸光度は得られ
なかった。
無傷Ｉ Ｌ− １ （ｐＩ ６．８）に対する抗ペプ
チド抗血清の特異性を試験するために免疫および免疫前
血清を粗濃縮培養上澄み液および単球溶解物の“ウェス
ターン”分析で使用した。これらの実験で植物凝集素と
リボ多糖の両方で刺激されるヒト単核細胞から誘導され
る上澄み液を１００倍濃縮し、還元条件下で１５％均質
ゲル中ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。ゲルをト
ランスファ緩衝液（２ ０ ｍＭ ）リス、１％グリシ
ン、０． １％ＳＤＳ，ｐＨ８．６＞で室温で２０分間
、前平衡した後、前浸漬濾紙のシート（３龍、ホヮソト
マン（Ｗｈａ ｔｍａｎ） ）で静止させた。ニトロセ
ルロースの１１″ｌｉ浸漬シートと濾紙をゲルの露出面
に適用することによってサンドウィンチを完了した。ニ
トロセルロースへの電気泳動移動はハイロラドトランス
ブロノト装置で一定電圧３０ボルトで一晩４０℃で行な
った。完全な移動はポリアクリルアミドゲルの銀染色後
により示された。ニトロセルロースシートをＰＢＳで３
回洗浄し、０．５％ゼラチン／ＰＢＳで１時間遮断し、
０．１％ゼラチン／ＰＢＳで洗浄した。次にニトロセル
ロース片を２ＱｒｎＭトリス緩衝液ｐ１１８．６中抗血
清の１：１００希釈中で１時間緩かに攪拌しながら培養
した。その後細片をトリス緩衝液で３回（各１０分）洗
浄した後１２ＪプロテインＡ （２００，０００ｃｐｍ
／ｍｊ２ 、２５ｍｆｆ、］ ｘ ｌ Ｏ８ｃｐｍ／ｍ
ｇ）で１時間培養し泥。１−リス緩衝液で６回洗浄して
シー１−を空気乾燥し、コダソクＸ−０−ＭＡＴフィル
ムに４日間露出した。先駆体Ｉ Ｌ −１がリボ多）Ｊ
とと植物擬集素で刺激した付着単核細胞から得られ、血
清のない培地で洗浄し、５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミ
ド”、２ｍＭフェニルメチルスルボニルフルオリトおよ
び２ｍＭＥＤＴＡを含有するハンクスの平衡塩類溶液に
通過させ、ペレットにし、５ＤＳ−ＰＡＧＥに対してβ
−メルカプトエタノール含有試料緩衝液に再懸濁させた
。試料を上述の通り操作した。
チド抗血清の特異性を試験するために免疫および免疫前
血清を粗濃縮培養上澄み液および単球溶解物の“ウェス
ターン”分析で使用した。これらの実験で植物凝集素と
リボ多糖の両方で刺激されるヒト単核細胞から誘導され
る上澄み液を１００倍濃縮し、還元条件下で１５％均質
ゲル中ＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。ゲルをト
ランスファ緩衝液（２ ０ ｍＭ ）リス、１％グリシ
ン、０． １％ＳＤＳ，ｐＨ８．６＞で室温で２０分間
、前平衡した後、前浸漬濾紙のシート（３龍、ホヮソト
マン（Ｗｈａ ｔｍａｎ） ）で静止させた。ニトロセ
ルロースの１１″ｌｉ浸漬シートと濾紙をゲルの露出面
に適用することによってサンドウィンチを完了した。ニ
トロセルロースへの電気泳動移動はハイロラドトランス
ブロノト装置で一定電圧３０ボルトで一晩４０℃で行な
った。完全な移動はポリアクリルアミドゲルの銀染色後
により示された。ニトロセルロースシートをＰＢＳで３
回洗浄し、０．５％ゼラチン／ＰＢＳで１時間遮断し、
０．１％ゼラチン／ＰＢＳで洗浄した。次にニトロセル
ロース片を２ＱｒｎＭトリス緩衝液ｐ１１８．６中抗血
清の１：１００希釈中で１時間緩かに攪拌しながら培養
した。その後細片をトリス緩衝液で３回（各１０分）洗
浄した後１２ＪプロテインＡ （２００，０００ｃｐｍ
／ｍｊ２ 、２５ｍｆｆ、］ ｘ ｌ Ｏ８ｃｐｍ／ｍ
ｇ）で１時間培養し泥。１−リス緩衝液で６回洗浄して
シー１−を空気乾燥し、コダソクＸ−０−ＭＡＴフィル
ムに４日間露出した。先駆体Ｉ Ｌ −１がリボ多）Ｊ
とと植物擬集素で刺激した付着単核細胞から得られ、血
清のない培地で洗浄し、５ｍＭ Ｎ−エチルマレイミ
ド”、２ｍＭフェニルメチルスルボニルフルオリトおよ
び２ｍＭＥＤＴＡを含有するハンクスの平衡塩類溶液に
通過させ、ペレットにし、５ＤＳ−ＰＡＧＥに対してβ
−メルカプトエタノール含有試料緩衝液に再懸濁させた
。試料を上述の通り操作した。
アミノペプチド免疫原に対する抗面清は粗濃縮培養上澄
み液中シングルバンドを識別した。純粋なＴＬ−１のウ
ェスターン分析は粗材料において識別したバンドがＩ
Ｌ −１と同じ移動度を有することを示した。
み液中シングルバンドを識別した。純粋なＴＬ−１のウ
ェスターン分析は粗材料において識別したバンドがＩ
Ｌ −１と同じ移動度を有することを示した。
純粋なＩＬ−１および粗濃縮培養上澄み液のウェスター
ン分析における抗ペプチド抗血清の使用は、次の結果を
得た。３種の抗血清は全て、純粋なＩＬ−１を結合し、
一方、免疫前血清または１２５１プロテイン八単独でハ
ンドは観察されなかった。３種の抗血端金てが分子ｆｆ
１ｉ７ｋａの純粋なＩＬ−１と一致する移動度を有する
粗濃縮培養上澄み液で主なバンドを識別した。プールし
た免疫前血清または１２５■プロテインＡ単独のいずれ
もまたバンドは見られなかった。粗濃縮培養上澄み液の
銀染色は、多くの別個のタンパク質種を有するまさに複
合体であることを示した。末梢血液単核細胞を簡単に懸
濁した培地はこの分析により陰性であった。単球溶解物
のウェスターン分析は次の結果を得た。抗血清ｃｔすべ
てＩＬ−１、ｐ＋６．ｓ先駆体のサイズと一致する３１
〜３３ｋｄシングルハンドを識別した。免疫前血清およ
び１２５■−標識プロチインＡまたは１２５Ｉ−標識プ
ロチイン八単独での処理は結合を示さなかった。抗−次
内部ペプチドを使用する実験で得られた同し結果はさら
に３３ｋｄタンパク質が分泌した■Ｉ、−１と共に１つ
の抗原決定基以上を有することを示した。
ン分析における抗ペプチド抗血清の使用は、次の結果を
得た。３種の抗血清は全て、純粋なＩＬ−１を結合し、
一方、免疫前血清または１２５１プロテイン八単独でハ
ンドは観察されなかった。３種の抗血端金てが分子ｆｆ
１ｉ７ｋａの純粋なＩＬ−１と一致する移動度を有する
粗濃縮培養上澄み液で主なバンドを識別した。プールし
た免疫前血清または１２５■プロテインＡ単独のいずれ
もまたバンドは見られなかった。粗濃縮培養上澄み液の
銀染色は、多くの別個のタンパク質種を有するまさに複
合体であることを示した。末梢血液単核細胞を簡単に懸
濁した培地はこの分析により陰性であった。単球溶解物
のウェスターン分析は次の結果を得た。抗血清ｃｔすべ
てＩＬ−１、ｐ＋６．ｓ先駆体のサイズと一致する３１
〜３３ｋｄシングルハンドを識別した。免疫前血清およ
び１２５■−標識プロチインＡまたは１２５Ｉ−標識プ
ロチイン八単独での処理は結合を示さなかった。抗−次
内部ペプチドを使用する実験で得られた同し結果はさら
に３３ｋｄタンパク質が分泌した■Ｉ、−１と共に１つ
の抗原決定基以上を有することを示した。
プロティンＡ被覆セファロースビーズ（ファルマシア）
２■を緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ１．１０ｍＭ１
・リス、０．１％ＮＰ−４０、ｐＨ８，０）中に膨潤さ
せた後、免疫前または一次内部抗ペプチト′抗血清６〜
１０μｐと回転混合装置で一晩４℃で培養した。次にビ
ーズを緩衝液で３回洗浄し、緩衝液３００μβに再懸濁
させ、単球界面活性剤溶解物１００〜３００μβあるい
は粗単球培養上澄み液１．０〜１．５ｎ＋ｊ！と回転ミ
キサの４度で２時間培養した。
２■を緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ１．１０ｍＭ１
・リス、０．１％ＮＰ−４０、ｐＨ８，０）中に膨潤さ
せた後、免疫前または一次内部抗ペプチト′抗血清６〜
１０μｐと回転混合装置で一晩４℃で培養した。次にビ
ーズを緩衝液で３回洗浄し、緩衝液３００μβに再懸濁
させ、単球界面活性剤溶解物１００〜３００μβあるい
は粗単球培養上澄み液１．０〜１．５ｎ＋ｊ！と回転ミ
キサの４度で２時間培養した。
溶解物および上澄み液が誘発される単球培養は３５−メ
チオニン（アマジャム、］ ４７０Ｃｉ／ ミリモル、
８７μＣ４／ ２ ｍ ｌ培地）の存在下リボ多糖で前
もって刺激されているかあるいはされていない。その後
ビーズを回転させ、緩衝液で３回洗浄した。次に沈降物
をラエムリ試料緩衝液５０μｐに溶解し、５分間煮沸し
、１５％ＳＤＳゲルで電気泳動した。ゲルを乾燥し、オ
ートラジオグラフィーを行なった。
チオニン（アマジャム、］ ４７０Ｃｉ／ ミリモル、
８７μＣ４／ ２ ｍ ｌ培地）の存在下リボ多糖で前
もって刺激されているかあるいはされていない。その後
ビーズを回転させ、緩衝液で３回洗浄した。次に沈降物
をラエムリ試料緩衝液５０μｐに溶解し、５分間煮沸し
、１５％ＳＤＳゲルで電気泳動した。ゲルを乾燥し、オ
ートラジオグラフィーを行なった。
免疫血清で被覆したビーズとＬ Ｐ Ｓ−刺激単球の溶
解物の免疫沈降はＩ Ｌ −１先駆体の公知の大きさと
一致する優位の゛Ｓ−標識３３ｋｉハンドを表わした。
解物の免疫沈降はＩ Ｌ −１先駆体の公知の大きさと
一致する優位の゛Ｓ−標識３３ｋｉハンドを表わした。
無刺激単球の場合あるいは免疫血清で被覆したプロティ
ンＡビーズを一次内部ペプチドまたは無傷Ｉ Ｌ−１（
ｐ １６．８）の過剰量で前処理した場合には前免疫血
清で被覆したビーズでのハンドは見い出されなかった。
ンＡビーズを一次内部ペプチドまたは無傷Ｉ Ｌ−１（
ｐ １６．８）の過剰量で前処理した場合には前免疫血
清で被覆したビーズでのハンドは見い出されなかった。
培養上澄み液の免疫沈降はＩ Ｌ −１の成熟分泌形態
の公知の大きさと一致した」二連と同し特性を存する１
、 ７ ｋ ｄハントを表わした。
の公知の大きさと一致した」二連と同し特性を存する１
、 ７ ｋ ｄハントを表わした。
ｔｏ″２Ｕ灸淀−
ヒトＡＬ 核細胞をフィコール−ｌ＼イパソク（Ｆｉｃ
ｏｌｌｌｌｙｐａＢｕｅ ） （ファ１しマシア）不
連続密度勾配によって正常な志願者の血液から分離した
。得られた細胞を１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯラボラ
１〜リーズ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μ／ｍ
ｊ！ペニシリンおよび １００，１１ｇ／ｍｆｆストレ
プトマイシン 形のカバーグラスを含有する３５朋培養プレートに２個
の３ＸＩ（］６細胞を接種し、４〜２４時間５％ＣＯ２
／空気中 ３７℃で保温した。刺激単球およびリンパ球
の実験としてイー、コリ （Ｅ．ＣＯｌｉ ）０５５
．Ｂ５から（７） ＩＪボ多糖（１− Ｉ） Ｓ）（シ
グマケミカル社）１μｇ／ｍβと植物凝集素（ＰＨＡ）
（シグマ）５μｇ／ｍｊ２を培地に添加した。
ｏｌｌｌｌｙｐａＢｕｅ ） （ファ１しマシア）不
連続密度勾配によって正常な志願者の血液から分離した
。得られた細胞を１％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯラボラ
１〜リーズ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μ／ｍ
ｊ！ペニシリンおよび １００，１１ｇ／ｍｆｆストレ
プトマイシン 形のカバーグラスを含有する３５朋培養プレートに２個
の３ＸＩ（］６細胞を接種し、４〜２４時間５％ＣＯ２
／空気中 ３７℃で保温した。刺激単球およびリンパ球
の実験としてイー、コリ （Ｅ．ＣＯｌｉ ）０５５
．Ｂ５から（７） ＩＪボ多糖（１− Ｉ） Ｓ）（シ
グマケミカル社）１μｇ／ｍβと植物凝集素（ＰＨＡ）
（シグマ）５μｇ／ｍｊ２を培地に添加した。
免疫螢光分析として細胞培養を２％パラホルムアルデヒ
ド中室温で２０〜２５分間固定した後、４℃で５分間Ｒ
ＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００または一２０℃で３
０分間アセトンで処理して透過性にし、ＰＢＳでウェル
を洗浄した。４°ＣでＰＢＳに貯蔵した場合、かかる標
本は数週間安定であった。染色前に培養物をトリス−１
１ｃ ７！０． １ ＭｐＨ７、８で簡単に処理した後
、非特異性抗体結合を最小にするために５％脱脂乾燥乳
、０．１％ＢＳＡおよび０．０４％アジ化ナトリウムを
含有する０． １ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｌ＋ ７．
８ ）で２０分間培養した。
ド中室温で２０〜２５分間固定した後、４℃で５分間Ｒ
ＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００または一２０℃で３
０分間アセトンで処理して透過性にし、ＰＢＳでウェル
を洗浄した。４°ＣでＰＢＳに貯蔵した場合、かかる標
本は数週間安定であった。染色前に培養物をトリス−１
１ｃ ７！０． １ ＭｐＨ７、８で簡単に処理した後
、非特異性抗体結合を最小にするために５％脱脂乾燥乳
、０．１％ＢＳＡおよび０．０４％アジ化ナトリウムを
含有する０． １ Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｌ＋ ７．
８ ）で２０分間培養した。
トリス−ＨＣｌで数回洗浄した後、培養液を５０〜１０
０Ｘに希釈した抗ペプチド抗血清または免疫前血清と培
養し、洗浄し、フルオレスセインイソチオシアネート（
ＦＴＴＣ）−複合ヤギ抗ーウサギＩｇＣ；（キャペルラ
ボラトリーズ）の１：１００希釈で染色した。抗体はず
べてＯ． Ｉ％ＢＳＡ、０、０４％アジドおよび０．１
％脱脂乾燥乳を含有する０．１Ｍリン酸塩緩衝液で希釈
し、遠心分離して使用前に微粒子物を除去した。標本を
ＦＩＴＣに対して狭域ハンド選択フィルターと共に照明
として備えたゼイス螢光顕微鏡で検査した。アクファイ
ン現像液（アクファイン社）で２０゛Ｃで１８分間現像
するコダソクトリーχフィルムを用いて顕微鏡写真を作
成した。
０Ｘに希釈した抗ペプチド抗血清または免疫前血清と培
養し、洗浄し、フルオレスセインイソチオシアネート（
ＦＴＴＣ）−複合ヤギ抗ーウサギＩｇＣ；（キャペルラ
ボラトリーズ）の１：１００希釈で染色した。抗体はず
べてＯ． Ｉ％ＢＳＡ、０、０４％アジドおよび０．１
％脱脂乾燥乳を含有する０．１Ｍリン酸塩緩衝液で希釈
し、遠心分離して使用前に微粒子物を除去した。標本を
ＦＩＴＣに対して狭域ハンド選択フィルターと共に照明
として備えたゼイス螢光顕微鏡で検査した。アクファイ
ン現像液（アクファイン社）で２０゛Ｃで１８分間現像
するコダソクトリーχフィルムを用いて顕微鏡写真を作
成した。
Ｌ Ｐ ＳおよびＰ Ｈ Ａの存在下４．５時間培養し
た細胞をアミノペプチド免疫原およびＦＩＴＣ−複合ヤ
ギ抗ーウサギＩｇＧに対して生じた抗血清と反応させた
。強烈な細胞質螢光が細胞内に観察され、核形態によっ
て単球として識別された。同じ標本に存在するリンパ球
または血小板に染色は見られなかった。対照実験は免疫
前血清または抗−Ｋ Ｌ Ｈ血清をアミノペプチド抗血
清に置き換えた場合、螢光染色が得られないことを示し
た。しかしながら■Ｌ−１の一次内部ペプチドに対する
抗血清は染色を生じアミノペプチドに対する抗血清で見
られるのと区別がつかなかった。
た細胞をアミノペプチド免疫原およびＦＩＴＣ−複合ヤ
ギ抗ーウサギＩｇＧに対して生じた抗血清と反応させた
。強烈な細胞質螢光が細胞内に観察され、核形態によっ
て単球として識別された。同じ標本に存在するリンパ球
または血小板に染色は見られなかった。対照実験は免疫
前血清または抗−Ｋ Ｌ Ｈ血清をアミノペプチド抗血
清に置き換えた場合、螢光染色が得られないことを示し
た。しかしながら■Ｌ−１の一次内部ペプチドに対する
抗血清は染色を生じアミノペプチドに対する抗血清で見
られるのと区別がつかなかった。
刺激単球の観察された螢光染色から見ても、無刺激細胞
を試験し、免疫細胞化学的に検出できる抗原もまた含有
するかどうか決定することは興味深いことであった。従
って単核細胞を前のように分離し、ＬＰＳおよびＰ Ｈ
Ａ含有培地に懸濁させた。次に細胞懸濁液の一部を直
接氷上に置き、細胞をサイトフユージ（ｃｙｔｏｆｏｇ
ｅ）を用いてスライド上にペレット化した。残存する細
胞をカバーグラスに付着させておき、３７℃で（ＬＰＳ
（！：ＰＨＡの存在下）４時間保温した。かかる標本を
固定し、透過性にし、免疫血清、次にＦＩＴＣ複合第二
抗体で処理した際、刺激単球は予期された通り、強烈な
螢光を示し、一方同じ培地に懸濁させた直後にサイトフ
ユージし、固定した細胞は螢光を示さなかった。従って
免疫細胞化学的に検出できるＩＬ−１は単球内に構成的
には存在しないが、むしろ適当な刺激によって誘発され
るに違いない。
を試験し、免疫細胞化学的に検出できる抗原もまた含有
するかどうか決定することは興味深いことであった。従
って単核細胞を前のように分離し、ＬＰＳおよびＰ Ｈ
Ａ含有培地に懸濁させた。次に細胞懸濁液の一部を直
接氷上に置き、細胞をサイトフユージ（ｃｙｔｏｆｏｇ
ｅ）を用いてスライド上にペレット化した。残存する細
胞をカバーグラスに付着させておき、３７℃で（ＬＰＳ
（！：ＰＨＡの存在下）４時間保温した。かかる標本を
固定し、透過性にし、免疫血清、次にＦＩＴＣ複合第二
抗体で処理した際、刺激単球は予期された通り、強烈な
螢光を示し、一方同じ培地に懸濁させた直後にサイトフ
ユージし、固定した細胞は螢光を示さなかった。従って
免疫細胞化学的に検出できるＩＬ−１は単球内に構成的
には存在しないが、むしろ適当な刺激によって誘発され
るに違いない。
さらに染色反応の特異性を試験するために、抗血清を関
連のあるペプチドまたは関連のないペプチドまたはタン
パク質のいずれかと前培養した後、刺激単核細胞の培養
物を染色するために使用した。
連のあるペプチドまたは関連のないペプチドまたはタン
パク質のいずれかと前培養した後、刺激単核細胞の培養
物を染色するために使用した。
希釈した抗血清（Ｉｇｌｏｏ）を（１）関連ＩＬ−１ペ
プヂド（非複合、５０μｇ ／ｍ７り 、（２１関連の
ないＴＬ−１ペプチド（非複合、５０μｇ／ｍｊりまた
は（３）オボアルブミン（１００μｇ ／ｍβ）と室温
で２．５時間、前培養した。次に血清を上記で記載した
ように間接免疫螢光染色に使用した。免疫血清の単球を
染色する能力は関連ペプチドの１０μｇ／ｍｌまたは５
０μｇ ／ｍ（ｌと前培養することによって完全になく
なった。同一濃度の関連のないペプチドとあるいはオボ
アルブミン１００μｇ／ｍＩ！、と抗血清の前培養は免
疫螢光に影古しなかった。これらの調査結果は観察され
た間接免疫螢光染色が適当なＩ Ｌ −１決定基と特異
性抗体の相互作用の結果であることを示す。
プヂド（非複合、５０μｇ ／ｍ７り 、（２１関連の
ないＴＬ−１ペプチド（非複合、５０μｇ／ｍｊりまた
は（３）オボアルブミン（１００μｇ ／ｍβ）と室温
で２．５時間、前培養した。次に血清を上記で記載した
ように間接免疫螢光染色に使用した。免疫血清の単球を
染色する能力は関連ペプチドの１０μｇ／ｍｌまたは５
０μｇ ／ｍ（ｌと前培養することによって完全になく
なった。同一濃度の関連のないペプチドとあるいはオボ
アルブミン１００μｇ／ｍＩ！、と抗血清の前培養は免
疫螢光に影古しなかった。これらの調査結果は観察され
た間接免疫螢光染色が適当なＩ Ｌ −１決定基と特異
性抗体の相互作用の結果であることを示す。
炎症を起こした歯肉の試料を重い歯槽膿漏の患者から得
、０．Ｃ，Ｔ、化合物で包埋し、−２０°Ｃで凍結させ
、クリオトム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ）で分画した。１０個
のミクロン分画をスライドに移し、室温で空気乾燥した
。組織片を室温で２５分間２％パラホルムアルデヒドで
次に４°Ｃで５分間リン酸塩緩衝食塩水中０．１％トリ
トン−ｘ−１００で処理した。間接免疫螢光染色を実施
例７で記載した通り行なった。単球Ｔ Ｌ −１に対し
て誘起した抗血清は強烈な細胞質螢光で示されるように
上皮細胞のＩ Ｌ −１と特異的に反応した。免疫螢光
染色は抗血清を関連のあるペプチドと前処理することに
よってなくなったが関連のないペプチドではなくならな
かった。免疫前血清は細胞内Ｉ Ｌ −１と複合しなか
った。
、０．Ｃ，Ｔ、化合物で包埋し、−２０°Ｃで凍結させ
、クリオトム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ）で分画した。１０個
のミクロン分画をスライドに移し、室温で空気乾燥した
。組織片を室温で２５分間２％パラホルムアルデヒドで
次に４°Ｃで５分間リン酸塩緩衝食塩水中０．１％トリ
トン−ｘ−１００で処理した。間接免疫螢光染色を実施
例７で記載した通り行なった。単球Ｔ Ｌ −１に対し
て誘起した抗血清は強烈な細胞質螢光で示されるように
上皮細胞のＩ Ｌ −１と特異的に反応した。免疫螢光
染色は抗血清を関連のあるペプチドと前処理することに
よってなくなったが関連のないペプチドではなくならな
かった。免疫前血清は細胞内Ｉ Ｌ −１と複合しなか
った。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列の１種を有するペプチド類【アミ
ノ酸配列があります】 およびそのアミド類および酸付加塩。 ２、高分子量担体タンパク質に複合した特許請求の範囲
第１項記載のペプチドよりなるペプチド免疫原。 ３、高分子量担体タンパク質がキーホールリンペットヘ
モシアニンである特許請求の範囲第２項記載のペプチド
免疫原。 ４、許容できるアジュバントと組み合わせた特許請求の
範囲第３項記載のペプチド免疫原で動物を免疫感作する
ことを特徴とする抗体の産生方法。 ５、特許請求の範囲第２項記載の個々のペプチド免疫原
に対して誘起された抗体。 ６、特異性抗体の刺激に包含される関連のあるペプチド
に特異的に結合する特許請求の範囲第５項記載の抗体。 ７、前駆体および成熟体ヒトＩＬ−１、ｐＩ６．８に特
異的に結合する特許請求の範囲第５項記載の抗体。 ８、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を有する
ペプチドまたは そのアミドまたは酸付加塩。 ９、高分子量担体タンパク質に複合した特許請求の範囲
第８項記載のペプチドよりなるペプチド免疫原。 １０、高分子量担体タンパク質がキーホールリンペット
ヘモシアニンである特許請求の範囲第９項記載のペプチ
ド免疫原。 １１、許容できるアジュバントと組み合わせたペプチド
免疫原で動物を免疫感作することを特徴とする特許請求
の範囲第９項記載のペプチド免疫原に対する抗体の産生
方法。 １２、特許請求の範囲第１０項記載のペプチド免疫原に
対して誘起された抗体。 １３、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】または
そのアミドまたは 酸付加塩を有するペプチドに特異的に結合する特許請求
の範囲第１０項記載の抗体。 １４、前駆体および成熟体ヒトＩＬ−１、ｐＩ６．８に
特異的に結合する特許請求の範囲第１３項記載の抗体。 １５、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を有す
るペプチドまたはその アミドまたは酸付加塩。 １６、高分子量担体タンパク質に複合した特許請求の範
囲第１５項記載のペプチドよりなるペプチド免疫原。 １７、高分子量担体タンパク質がキーホールリンペット
ヘモシアニンである特許請求の範囲第１６項記載のペプ
チド免疫原。 １８、許容できるアジュバントと組み合わせたペプチド
免疫原で動物を免疫感作することを特徴とする特許請求
の範囲第１６項記載のペプチド免疫原に対する抗体の産
生方法。 １９、特許請求の範囲第１６項記載のペプチド免疫原に
対して誘起された抗体。 ２０、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を有す
るペプチドまたはその アミドまたは酸付加塩に特異的に結合する特許請求の範
囲第１９項記載の抗体。 ２１、前駆体および成熟体ヒトＩＬ−１、ｐ１６．８に
特異的に結合する特許請求の範囲第１９項記載の抗体。 ２２、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】または
その アミドまたは酸付加塩を有するペプチド。 ２３、高分子量担体タンパク質に複合した特許請求の範
囲第２２項記載のペプチドよりなるペプチド免疫原。 ２４、高分子量担体タンパク質がキーホールリンペット
ヘモシアニンである特許請求の範囲第２３項記載のペプ
チド免疫原。 ２５、許容できるアジュバントと組み合わせたペプチド
免疫原で動物を免疫感作することを特徴とする特許請求
の範囲第２３項記載のペプチド免疫原に対する抗体の産
生方法。 ２６、特許請求の範囲第２３項記載のペプチド免疫原に
対して誘起された抗体。 ２７、アミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を有す
るペ プチドまたはそのアミドまたは酸付加塩に特異的に結合
する特許請求の範囲第２６項記載の抗体。 ２８、前駆体および成熟体ヒトＩＬ−１、ｐＩ６．８に
特異的に結合する特許請求の範囲第２６項記載の抗体。 ２９、特許請求の範囲第１項のペプチド類または対応す
るペプチド免疫原に対して産生した抗体をヒト組織、組
織抽出物または体液と接触させ、適当な血清学的または
免疫細胞化学検定でヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、
成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６．８およびＩＬ−１、ｐＩ６．
８の個々の関連のあるペプチド類の存在の有無を決定す
ることを特徴とするヒト組織、組織抽出物または体液中
ヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ−１、ｐ
Ｉ６．８およびＩＬ−１、ｐＩ６．８の個々の関連のあ
るペプチド類の存在の検定方法。 ３０、特許請求の範囲第８項のペプチドまたは対応する
免疫原に対して産生した抗体をヒト組織、組織抽出物ま
たは体液と接触させ、適当な血清学的または免疫細胞化
学検定でヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ
−１、ｐＩ６．８及び特許請求の範囲第８項のペプチド
の存在の有無を決定することを特徴とするヒト組織、組
織抽出物または体液中のヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．
８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６．８および特許請求の範囲
第８項記載のペプチドの存在の検定方法。 ３１、特許請求の範囲第１５項のペプチドまたは対応す
る免疫原に対して産生した抗体をヒト組織、組織抽出物
または体液と接触させ、血清学的または免疫細胞化学検
定でヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ−１
、ｐＩ６．８および特許請求の範囲第１５項のペプチド
の存在の有無を決定することを特徴とするヒト組織、組
織抽出物または体液中のヒト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．
８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６．８および特許請求の範囲
第１５項のペプチドの存在の検定方法。 ３２、特許請求の範囲第２２項のペプチドまたは対応す
る免疫原に対して産生した抗体をヒト組織、組織抽出物
または体液と接触させ、適当な血清学的または免疫細胞
化学検定でヒト先駆体ＩＬ−１、ｐ１６．８、成熟体Ｉ
Ｌ−１、ｐＩ６．８および特許請求の範囲第２２項のペ
プチドの存在の有無を決定することを特徴とするヒト組
織、組織抽出物または体液中のヒト先駆体ＩＬ−１、ｐ
Ｉ６．８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６．８および特許請求
の範囲第２２項のペプチドの存在の検定方法。 ３３、特許請求の範囲第１項のペプチド類をヒト組織、
組織抽出物または体液と接触させ血清学的または免疫細
胞化学検定で特異性抗体の存在と濃度を定量することを
特徴とするヒト組織、組織抽出物または体液中のヒト先
駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８および成熟体ＩＬ−１、ｐＩ
６．８および関連のあるペプチドと特異的に反応する抗
体の存在の検定方法。 ３４、特許請求の範囲第８項のペプチドをヒト組織、組
織抽出物または体液と接触させ、血清学的または免疫細
胞化学検定で特異性抗体の存在と濃度を定量することを
特徴とするヒト組織、組織抽出物または体液中のヒト先
駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６．
８およびペプチド【アミノ酸配列があります】 またはそのアミドまたは酸付加塩 と特異的に反応する抗体の存在の検定方法。 ３５、特許請求の範囲第１５項のペプチドをヒト組織、
組織抽出物または体液と接触させ、血清学的または免疫
細胞化学検定で特異性抗体の存在と濃度を定量すること
を特徴とするヒト組織、組織抽出物または体液中のヒト
先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ６
．８およびペプチド【アミノ酸配列があります】 またはそのアミドまたは酸付加塩と特異的に反応する抗
体の存在の検定方法。 ３６、特許請求の範囲第２２項のペプチドをヒト組織、
組織抽出物または体液と接触させ、血清学的または免疫
細胞化学検定で特異性抗体の存在及び濃度を定量するこ
とを特徴とするヒト組織、組織抽出物または体液中のヒ
ト先駆体ＩＬ−１、ｐＩ６．８、成熟体ＩＬ−１、ｐＩ
６．８およびペプチド【アミノ酸配列があります】また
はそのアミ ドまたは酸付加塩と特異的に反応する抗体の存在の検定
方法。
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